黃毛耳草總黃酮的提取工藝優(yōu)化及有效成分的含量測定

金賢武，何亞芬

上饒市檢驗檢測認(rèn)證院藥品檢測分院，江西 上饒 334000

黃毛耳草（Hedyotis chrysotricha）又名敷地兩耳草、地坎風(fēng)、石打穿等，系茜草科耳草屬植物金毛耳草Hedyotis chrysotricha（Palib.）Merr.的全草［1］，收錄于浙江、福建、江蘇等地方中藥材標(biāo)準(zhǔn)，主要分布于我國的浙江、江西、安徽、江蘇、福建、湖南等地，是國藥準(zhǔn)字中藥成方制劑腸炎寧片、傷濕丸的主要組方藥材［2］。黃毛耳草味苦，性涼，歸肝、膽、膀胱、大腸經(jīng)，具有清熱除濕、解毒消腫、活血舒筋的功效，臨床上主要用于腎炎、腸炎、急性肝炎、跌打腫痛等疾病的治療［3］。研究［4］顯示，黃毛耳草主要含有黃酮、三萜、環(huán)烯醚萜苷、生物堿、甾醇等成分，具有防衰老、抗炎、抗菌、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等多種活性［5］，是一味民間常用、價值較高的全草入藥中藥。

化學(xué)成分是中藥發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。據(jù)報道，蘆丁、煙花苷等黃酮類成分廣泛存在耳草屬植物中，具有較強(qiáng)的抗炎、鎮(zhèn)痛、保肝及保護(hù)心腦血管等作用［6-7］，可能是耳草作用于黃疸型病毒性肝炎、急慢性腎炎及腫瘤等疾病治療的主要活性成分。目前，對于黃毛耳草黃酮類成分的提取工藝研究還相對較少，僅有學(xué)者通過正交法研究其提取與純化工藝［8］，還未有響應(yīng)面法優(yōu)化黃毛耳草總黃酮提取工藝及HPLC 法同時測定多個黃酮類成分的相關(guān)研究報道。本試驗以黃毛耳草為研究對象，應(yīng)用Box-Behnken 響應(yīng)面法對黃毛耳草中總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，采用HPLC 法測定黃毛耳草中蘆丁、煙花苷的含量，以期為黃毛耳草資源的深入開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV5500 紫外光度計（上海元析儀器有限公司）；Agilent1260 高效液相色譜儀（Agilent 公司）；Sartorius BS-124S 電子天平（德國賽多利斯公司）；FW100 高速萬能粉碎機(jī)（泰斯特儀器有限公司）；優(yōu)普超純水儀（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

1.2 試藥

對照品蘆丁（批號111081-201202，純度＞98%），煙花苷（批號111683-200401，純度＞98%）購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。黃毛耳草購自溪福草藥鋪，經(jīng)上饒市檢驗檢測認(rèn)證院藥品檢測分院彭任輝副主任藥師鑒定為黃毛耳草的全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃毛耳草總黃酮提取工藝優(yōu)化

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取蘆丁對照品12.68 mg，置100 mL 量瓶中，加入70%乙醇并定容至刻度，制得質(zhì)量濃度為126.8 μg/mL 的對照品溶液。參照文獻(xiàn)［9］方法，繪制蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得蘆丁回歸方程為A=0.136 2C-0.002 4（r=0.999 7），表明蘆丁在0～63.4 μg/mL 的質(zhì)量濃度內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.1.2 樣品含量的測定 精密稱取干燥粉碎后的黃毛耳草粉末1.0 g，置100 mL 具塞錐形瓶中，精密加入提取溶液，稱定重量后超聲提取，放冷，再稱定重量，用提取溶液補(bǔ)足減失的重量，濾過，得供試品溶液。取1.0 mL 供試品溶液按“2.1.1”項下方法測定吸光度并計算總黃酮得率。總黃酮得率（%）=（A+0.002 4）×V×100/（0.136 2×m×1 000）。式中：A為吸光度值；V為提取液體積；m為樣品質(zhì)量。

2.1.3 響應(yīng)面設(shè)計 在文獻(xiàn)［9］報道的研究基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度、提取時間、液料比3 個因素為設(shè)計因素，設(shè)計黃毛耳草總黃酮提取條件，設(shè)計方案和所得的結(jié)果見表1 和表2。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平表

表2 響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果

2.1.4 方差分析 Box-Behnken 響應(yīng)面法所得的方差分析結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，黃毛耳草總黃酮得率對乙醇濃度、提取時間、液料比3 個因素的回歸方程為：Y=12.53+0.11A+0.33B+0.28C-0.078AB+0.042AC+0.027BC-1.26A2-1.27B2-0.70C2。本試驗所建立的模型得P值為0.005 9（P＜0.001），差異有統(tǒng)計學(xué)意義；失擬項P值為0.119 7（P＞0.05），差異無統(tǒng)計學(xué)意義，所建立的模型擬合程度良好，回歸可靠。此外，二次項中A2、B2、C2的P值均小于0.000 1，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義

表3 方差分析結(jié)果

2.1.5 響應(yīng)面分析 通過Design-Expert 9.0.4 軟件繪制考察指標(biāo)黃毛耳草總黃酮得率與自變量乙醇濃度、提取時間、液料比之間的等高線圖，具體結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，黃毛耳草總黃酮的最佳提取工藝為：乙醇濃度70.44%、超聲時間46.95 min、料液比12.41∶1，總黃酮預(yù)測得率12.59%。

圖1 不同因素間的響應(yīng)曲面圖

2.1.6 驗證試驗 為便于操作，修正預(yù)測條件為：乙醇濃度70%、超聲時間47 min、料液比12.5∶1，以此條件平行3 次提取黃毛耳草總黃酮，結(jié)果平均得率為12.62%，與預(yù)測得率12.59%無明顯差異，表明擬合良好，所優(yōu)化的工藝穩(wěn)定可靠。

2.2 HPLC 法測定蘆丁和煙花苷含量

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁和煙花苷對照品適量，置50 mL 量瓶中，加70%甲醇溶解，定容，搖勻，得濃度分別為352.6、68.4 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品的制備 取粉碎后的黃毛耳草藥材1.0 g，置50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入10 mL 的70%甲醇，稱定重量，超聲提取45 min，放冷，再稱定重量，補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得。

2.2.3 專屬性試驗 采用Agilent Extend C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇（A）-0.5%甲酸溶液（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫（0～20 min，35%→60%A；20～302 min，60%→68%A）；檢測波長為360 nm；流速為1.0 mL/min。分別取10 μL混合對照品溶液和供試品溶液進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2 所示，各成分之間分離較好。

圖2 HPLC色譜圖：A.對照品；B.黃毛耳草

2.2.4 線性關(guān)系 精密吸取0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL“2.2.1”項下的混合對照品溶液，置10 mL容量瓶中，加70%甲醇定容至刻度。按“2.2.3”項下色譜條件測定，以濃度X 對峰面積Y 進(jìn)行回歸計算，結(jié)果蘆丁、煙花苷在質(zhì)量濃度3.526～352.6、0.684～68.4 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程分別為Y=32 174X+332.6（r=0.999 7）和Y=10 211X+126.5（r=0.999 3）。

2.2.5 精密度試驗 取干燥粉碎后的黃毛耳草藥材1.0 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件測定，重復(fù)進(jìn)樣6 次。結(jié)果蘆丁、煙花苷的峰面積RSD 分別為0.84%、1.25%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣分析。結(jié)果蘆丁、煙花苷的峰面積RSD 分別為1.83%、1.02%，表明供試品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取干燥粉碎后的黃毛耳草藥材6 份，各1.0 g，按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件測定，計算峰面積RSD。結(jié)果蘆丁、煙花苷的峰面積RSD 分別為1.29%、2.37%，表明重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收試驗 取干燥粉碎后的黃毛耳草藥材6 份，每份約0.5 g，精密稱定，加入適量的蘆丁、煙花苷對照品，再按“2.2.2”項下方法制備加樣回收供試品溶液，測定其含量并計算回收率，結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率試驗

2.2.9 含量測定 取干燥粉碎后的黃毛耳草藥材，按“2.2.2”項下方法平行制備3 份供試品溶液，吸取10 μL 注入HPLC 測定蘆丁和煙花苷的含量。結(jié)果測得黃毛耳草中蘆丁的含量為0.74 mg/g，煙花苷的含量為0.058 mg/g。

3 討論

正交試驗法和響應(yīng)面法是目前藥物有效成分提取工藝優(yōu)化的主要應(yīng)用方法。有學(xué)者通過正交法對黃毛耳草的總黃酮提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，但相比于正交法只是試驗所用水平的某一種組合，響應(yīng)面法可通過多項擬合直觀地分析出各個因素之間交互關(guān)系，結(jié)果更精密準(zhǔn)確，因此，本試驗選擇采用響應(yīng)面法優(yōu)化黃毛耳草的總黃酮提取工藝。

黃毛耳草中主要含有黃酮、三萜、環(huán)烯醚萜苷、生物堿等類成分，其中黃酮類成分包括蘆丁、煙花苷、槲皮素、水仙甙等，是黃毛耳草作用于黃疸型病毒性肝炎、急慢性腎炎及腫瘤等疾病治療的主要活性成分［9］。對于其有效成分黃酮類的含量測定主要是測定蘆丁或者槲皮素的含量［10］。本試驗選擇以蘆丁和煙花苷為指標(biāo)性成分，建立了其HPLC 含量測定方法。

本研究采用Box-Behnken響應(yīng)面法試驗設(shè)計法，首次對黃毛耳草的總黃酮提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到了操作簡便、提取率高、預(yù)測性好的提取方法。同時，還建立了準(zhǔn)確可靠、操作簡便、重現(xiàn)性高、穩(wěn)定性好、專屬性強(qiáng)的黃酮類成分HPLC 含量測定方法，為黃毛耳草的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提升完善提供了依據(jù)。