奧美拉唑雜質毒性預測及細胞毒性研究

劉荷英，劉波，鄭洋濱，陳濤，劉寧

1.江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029；2.上海凡默谷信息技術有限公司，上海 200127

藥品中不可避免地存在或多或少的雜質，雜質的毒性直接影響到藥品的安全性，因此對藥物雜質的毒性研究非常重要。目前藥物雜質的毒性研究方法較多，傳統方法主要為各種體內外動物試驗和細胞試驗，動物試驗是毒性研究中最準確直觀的方法，但考慮到動物倫理和“3R”原則的要求，加之動物試驗的成本較高，試驗周期較長，越來越多種體外毒性研究方法用于替代動物試驗研究。細胞試驗一定程度上彌補了上述動物試驗的缺陷，且更能研究出藥物作用機制，近年來在毒性研究領域應用廣泛［1-3］，但細胞試驗只能反映某一方面的潛在毒性，存在片面性。隨著計算機技術的飛速發展，計算機輔助預測化合物毒性方面的應用越來越多，其具有快速、經濟、環保、易實現等優點，一定程度上彌補了動物試驗和細胞試驗的局限性。定量結構-性質/活性關系（QSPR/QSAR）模型是指通過數學方法建立化合物的分子描述符與其生物性質/活性之間的線性或非線性關系模型［4］，近年來在化合物毒性預測方面應用廣泛［5-11］，許多國際組織和監管機構都支持和推動QSPR/QSAR 的運用，并認為其可以作為動物實驗的替代方法［12］。

奧美拉唑是一種能夠有效抑制胃酸分泌的質子泵抑制劑，用于治療十二指腸潰瘍，胃潰瘍、反流性食管炎及 Zollinger-Ellison 綜合征等［13-14］，臨床上應用的奧美拉唑系列藥物有很多，包括注射用奧美拉唑鈉、注射用艾司奧美拉唑鈉、奧美拉唑腸溶膠囊、奧美拉唑腸溶片、奧美拉唑鈉腸溶片、奧美拉唑鎂腸溶片和艾司奧美拉唑鎂腸溶片等。《中國藥典》［15］、《英國藥典》［16］、《歐洲藥典》［17］、《美國藥典》［18］和《日本藥典》［19］均收載了奧美拉唑的雜質結構，其中《英國藥典》《歐洲藥典》和《美國藥典》中收載的雜質最多，共9 個雜質（雜質A～I），此外《中國藥典》艾司奧美拉唑鈉（S 型奧美拉唑鈉）質量標準［15］中收載了5 個雜質（雜質I～V），其中雜質I 和雜質V 分別為國外藥典中的雜質D 和雜質A，其他3 個雜質結構與國外藥典不同，本課題組前期研究了注射用奧美拉唑鈉的有關物質，除各國藥典收載的12 個已知雜質外，還推測了4 個未知雜質的結構［20］。奧美拉唑藥物在生產和貯存過程中易降解產生雜質［21］，更需關注其雜質安全性問題。奧美拉唑毒理學研究發現大鼠長期服藥導致的高胃泌素血癥能引發胃癌，人類的慢性高胃泌素血癥可導致腸嗜鉻細胞樣細胞增生和胃體內的類癌腫瘤，盡管概率很小［22］，但至今未發現奧美拉唑相關雜質的毒理學方面報道。

ADMET Predictor 軟件可基于化合物的結構預測其吸收、分布、代謝、排泄和毒性，并綜合判斷化合物的成藥性。本研究采用該軟件基于QSPR 模型對奧美拉唑及16 個雜質進行毒性預測，再采用MTT法結合細胞形態學觀察對奧美拉唑鈉及7 種雜質進行L-929 細胞毒性試驗研究，雜質毒性研究數據可為奧美拉唑系列藥物的質量安全性評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與軟件

酶標儀（美國Thermo 公司，型號：MULTISKAN GO）；二氧化碳培養箱（美國Thermo 公司，型號：HERACELL150i）；倒置顯微鏡（重慶光學儀器有限公司，型號：XDS-1B）；自動細胞計數儀（上海睿鈺生物科技有限公司，型號：IC1000）；渦旋混合器（意大利VELP 公司，型號：VORTEX WX）；ADMET PredictorTM 軟件（美國Simulations Plus 公司，版本：9.5.0.16）；ChemOffice 2010（美國CambridgeSoft 公司）。

1.2 對照品與試劑

奧美拉唑鈉對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100760-201504，含量：95.2%）；雜質A（東京化成工業株式會社，批號：N5R3G-RK，HPLC 純度：99.9%）；雜質B（山東博洛德生物科技有限公司，批號：AML ZZZ20170501，純度：98.36%）；雜質C［徐希愛（上海）化成工業發展有限公司，批號：FRIFI-LL，HPLC 純度：99.9%］；雜質D（EDQM CS，批號：3.0）；雜質E（北京百靈威科技有限公司，批號：LF30Q06，HPLC 純度：98.60%）；雜質J（江蘇奧賽康藥業有限公司，批號：S18012901，純度：94.2%）；雜質K（Comprison 公司，批號：31171，純度：98.06%）。

小鼠成纖維細胞（L-929，武漢大學中國科學院典型培養物保藏中心）。RPMI 完全1640basic（1×）培養基（含10%杭州四季清新生牛血清）（上海語純生物科技有限公司）、磷酸緩沖液（上海語純生物科技有限公司）、二甲基亞砜（DMSO，Sigma 公司，細胞培養級）、噻唑藍（MTT，Sigma 公司）。

1.3 方法

1.3.1 ADMET Predictor 軟件方法 采用ChemOffice 2010 軟件分別繪制奧美拉唑及其16 個雜質的結構，其中雜質K 為《中國藥典》中艾司奧美拉唑鈉的雜質Ⅲ，為一對同分異構體的混合物，此文中分別命名為雜質K1 和K2，奧美拉唑及其各雜質的結構見圖1。將各化合物的結構圖導出為MOL 格式文件，然后導入ADMET Predictor 軟件中，進行心臟毒性、大鼠急性毒性、致癌性、肝臟不良反應毒性和致突變性的預測，再綜合計算出毒性風險系數。ADMET Predictor 軟件分析大部分上市藥物的毒性風險系數預測結果≤3.3；且毒性風險系數越大，說明毒性越大。心臟毒性通過預測化合物對hERG 鉀離子通道的半抑制濃度的log 值（pIC50）來評估，pIC50≤［5.5，6］mol/L 時，說明心臟毒性小或無；大鼠急性毒性通過預測大鼠口服給藥模型的半數致死量（LD50）來評估，預測結果≥［200，320］mg/kg 時，說明產生的毒性小或無；致癌性是通過預測大鼠及小鼠口服給藥模型的半數中毒劑量（TD50）來評估，大鼠的TD50值≥［4，6.5］mg·kg-1·d-1時，說明化合物對大鼠的致癌性小或無，小鼠的TD50值≥［20，35］mg·kg-1·d-1時，認為化合物對小鼠的致癌性小或無；肝臟不良反應是通過預測化合物是否會導致肝臟堿性磷酸酶（AlkPhos）、γ-谷氨酰轉肽酶（GGT）、乳酸脫氫酶（LDH）、血清谷草轉氨酶（AST）和血清谷丙轉氨酶（ALT）這5 種肝酶水平升高來評估，肝酶水平升高表示該化合物可能產生肝臟不良反應，當化合物同時導致AST、ALT 和LDH 升高時，認為化合物具有肝臟毒性；致突變性是通過預測不同沙門氏菌屬（共10 株）Ames 試驗中的致突變可能性，得出致突變性風險系數，大部分上市藥物的致突變性風險系數預測結果≤1，當突變性風險系數＞1 時，表明化合物產生致突變性的可能性較大。

圖1 奧美拉唑及其各雜質結構

1.3.2 細胞毒性試驗方法 取奧美拉唑鈉和雜質J、K 分別用培養基溶解，取雜質A、B、C、D、E 分別用含0.5% DMSO 的培養基溶解，過濾除菌，按2倍系列梯度稀釋成不同濃度，作為供試品溶液。以最高濃度下多數細胞被殺死，而最低濃度時不會殺死細胞為標準，選擇各化合物的最終濃度區間，奧美拉唑鈉濃度為25～400 μg/mL、雜質A、D 濃度為125～2 000 μg/mL、雜質B 濃度為9.375～300 μg/mL、雜質C、K 濃度為250～4 000 μg/mL、雜質E 濃度為36.25～1 160 μg/mL、雜質J濃度為62.5～1 000 μg/mL。同時分別取培養基和含0.5% DMSO 的培養基，作為陰性對照溶液；取含5% DMSO 的培養基，作為陽性對照溶液。取對數生長期的L-929 細胞消化吹打計數，稀釋細胞濃度至1×104個/mL 的細胞懸液。取細胞懸液接種于96 孔培養板，每孔接種100 μL 細胞懸液，置CO2培養箱（含體積分數5%二氧化碳氣體）37 ℃培養。培養24 h 后，棄去原培養液。取陰性對照溶液、陽性對照溶液和供試品溶液，各設至少6 孔，每孔100 μL，置CO2培養箱繼續培養72 h。于更換培養液后的72 h，置顯微鏡下觀察細胞形態。每孔加入20 μL 5 g/L 的MTT溶液（取0.5 g 噻唑藍，用100 mL 磷酸緩沖液溶解，過濾除菌），繼續培養4 h。棄去孔內液體，加入150 μL DMSO，置振蕩器上振蕩10 min，以570 nm為測定波長，630 nm 為參比波長，在酶標儀下測定吸光度，以加藥組與陰性對照組的吸光度比值計算相對增殖率（RGR），以100%減去RGR 即得抑制率，再運用SPSS 19.0 軟件使用Logit 模型進行probit 回歸分析，計算得到各化合物的半抑制濃度IC50值。

2 結果

2.1 毒性預測結果

奧美拉唑及其雜質的毒性預測結果見表1。心臟毒性預測結果表明，奧美拉唑及其雜質的hERG鉀離子通道的pIC50值均＜5.5 mol/L，說明無明顯心臟毒性；大鼠急性毒性預測結果表明，奧美拉唑及其雜質的LD50值均＞320 mg/kg，說明產生大鼠急性毒性的可能性較小；致癌性預測結果表明，奧美拉唑和雜質B、C、D、E、H、I、L、O、P 的大鼠TD50值均＜4 mg·kg-1·d-1，說明產生大鼠致癌性的風險較高，雜質C 的小鼠TD50值＜20 mg·kg-1·d-1，說明其產生小鼠致癌性的風險較高，雜質C 可能同時具有大小鼠致癌性，毒性較大；肝臟不良反應預測結果表明，雜質A可能同時引起AST、ALT 和LDH 升高，產生肝臟毒性的可能性較大，其他化合物產生肝臟毒性的可能性較小；致突變性預測結果表明，雜質A、F、G 的致突變性風險系數＞1，產生致突變毒性的可能性高。奧美拉唑及其雜質的綜合的毒性風險系數均＜3.3，在上市藥物毒性范圍內，其中雜質A、C、F、G 的毒性風險系數高于奧美拉唑，說明其毒性比奧美拉唑大，雜質A 的主要毒性是致突變性和肝臟毒性，雜質C的主要毒性是大、小鼠致癌性，雜質F、G 的主要毒性是致突變性。

表1 ADMET Predictor軟件對奧美拉唑及其雜質的毒性預測結果

2.2 細胞毒性試驗結果

陽性對照組細胞層完全破壞，重度抑制細胞增殖。奧美拉唑鈉及雜質A、B、C、D、E、J、K 在不同濃度下對細胞增殖的抑制率見圖2，計算的IC50值見表2，從圖表結果可知，雜質B 對細胞增殖的抑制作用最強，IC50值最小，細胞毒性最大，雜質C的細胞毒性最小，各化合物細胞毒性大小為雜質B＞奧美拉唑鈉＞雜質E＞雜質J＞雜質A＞雜質K＞雜質D＞雜質C，僅雜質B 的細胞毒性大于奧美拉唑鈉。

表2 奧美拉唑鈉及其雜質的IC50測得值 μg/mL

圖2 奧美拉唑鈉及其雜質在不同濃度下的細胞抑制率

3 討論

本研究采用ADMET Predictor 軟件進行毒性風險系數評估是基于統計來自全球藥物索引（WDI）中的2 270 個藥物分子的預測結果總結出的打分規則。打分規則里的中括號［ ］表示“軟”閾值，85%的上市藥物不違反打分規則，10%的上市藥物違反打分規則，中括號［ ］中的數據可以理解為5%的上市藥物在中括號［ ］的范圍內。以LD50值的閾值［200,320］mg/kg 為例，若LD50值＜200 mg/kg，說明違反該打分規則，存在毒性；若LD50值在200～320 mg/kg 之間，也違反該打分規則，同樣存在毒性，但毒性更小；若LD50值＞320 mg/kg，說明不違反該打分規則，產生毒性的可能性小。該軟件可預測35 項毒性參數，但僅將主要的5 項參數（心臟毒性、大鼠急性毒性、致癌性、肝臟毒性和致突變性）納入毒性風險系數的打分。肝臟毒性預測了化合物對5 種肝酶水平變化的影響，雖然僅將主要的3 種肝酶納入打分規則，但其他2 種肝酶的影響結果仍值得關注。

奧美拉唑毒性預測結果表明其可能具有大鼠致癌性，這與文獻［22］報道的大鼠長期服用奧美拉唑導致的高胃泌素血癥引發胃癌結果相符。奧美拉唑預測的大鼠LD50值為584.395 mg/kg，比文獻［23］報道的實驗值（＞4 g/kg）更小，但根據軟件打分規則，預測的LD50值＞320 mg/kg 時，認為產生大鼠急性毒性的可能性較小，因此本次預測的結果與文獻基本一致。雜質K1 和K2 為一對同分異構體，市場上僅能購買到它們的混合物，通過軟件毒性預測可分別研究其毒性，預測結果表明二者均未發現明顯毒性，毒性風險系數均低于奧美拉唑。奧美拉唑及其雜質的綜合毒性風險系數均不高，在上市藥物毒性范圍內，但有4 個雜質的毒性風險高于奧美拉唑，需警惕雜質A 的致突變性和肝臟毒性、雜質C 的大小鼠致癌性和雜質F、G 的致突變性。

目前化學藥品的細胞毒性研究還沒有相關的檢測標準或指導原則，大多參照GB/T 16886.5-2017/ISO 10993-5:2009［24］和GB/T 14233.2-2005［25］進行研究。本研究采用以上2 個國標中共同收載的方法，也是最常用的MTT 法，以小鼠成纖維細胞（L-929）進行雜質的細胞毒性研究。目前報道的奧美拉唑相關雜質共16 個，但僅7 個雜質能購買到純品，因此本研究僅對這7 個雜質進行了研究。雜質B 的細胞毒性約為奧美拉唑鈉的2 倍，其預測的大鼠LD50值與奧美拉唑接近，但該雜質在藥品中的含量極低，因此雜質B 的毒性風險不高。由于藥品中的雜質含量極低，雜質純品較難獲得，在進行毒性實驗研究時會受到限制，而采用軟件進行毒性預測僅需明確雜質結構。通過軟件毒性預測結合細胞毒性研究可快速篩查藥品中微量雜質的毒性，但需注意將雜質的毒性與主藥同步研究進行對比才能更準確地評價藥品安全性。