單細胞視角下鉛的體內代謝與檢測

霍詩薇 劉 念 田皓中 張偉燦 郭 華 李 裕 胡立剛,4* 江桂斌1,

(1.中國科學院生態環境研究中心,環境化學與生態毒理學國家重點實驗室,北京 100085;2.中國科學院大學 中丹學院,北京 100190;3.中國科學院大學,北京 100049;4.國科大杭州高等研究院 環境學院,杭州 310024)

盡管以含鉛汽油為代表的鉛污染問題不斷得到治理,但是慢性鉛暴露仍然是影響人體健康的重要環境問題。環境中新出現的鉛污染源與人體內的骨鉛蓄積,使得鉛的環境外暴露和人體內暴露情況日趨復雜。血鉛作為人體鉛暴露風險的主要評價指標存在一定的局限性。因此,鉛暴露的復雜性以及有關研究手段的缺乏為鉛研究帶來了新的挑戰。隨著單細胞技術的迅速發展,單細胞水平上鉛的檢測技術可用于建立和完善鉛動力學的機制與模型,從而在單細胞水平上理解人體內的鉛循環與鉛的毒理效應,有望為控制鉛污染的健康危害提供新的系統性認識。

1 鉛污染與鉛暴露來源

鉛的污染與暴露一直是廣受關注的環境健康問題。鉛污染的來源主要包括礦產的開采冶煉及含鉛汽油和電池的使用等,其中含鉛汽油的大規模應用給人類健康造成了嚴重的危害[1]。從20世紀90年代開始,全球大部分國家陸續停止使用含鉛汽油。2021年7月,隨著最后一個國家——阿爾及利亞停止供應含鉛汽油,聯合國環境規劃署隨即宣布,全球已正式停止使用含鉛汽油[2]。含鉛汽油的禁止使得全球范圍內成人和兒童鉛中毒的患病率顯著降低[3-5]。盡管含鉛汽油這一里程碑式的鉛污染問題已經解決,來源復雜的鉛污染所造成的公眾健康威脅仍十分嚴重,且面臨諸多新的挑戰。因此,為厘清人體鉛暴露的來源,本章節通過分析鉛污染現狀,總結鉛暴露源特征以及新的鉛暴露源,為有關鉛暴露的分析、毒理等環境健康研究提供新的參考,以便控制和削減其產生的環境風險和健康威脅。

1.1 鉛污染現狀與鉛暴露源特征

近十年來,鉛減排的相關舉措有力地削減了環境中的鉛暴露源,但鉛污染對人體健康的風險仍然存在且不容樂觀。例如,聯合國兒童基金會發布報告顯示,全球大約三分之一的兒童(約8億)的血鉛水平超過安全限值[6]。美國毒物與疾病登記署結合各種有害物質的毒性、頻率及接觸可能性,將鉛列為有害物質優先清單第二名[7]。

人體從環境中接收的鉛暴露源主要分為兩類:人類活動直接釋放的鉛與留存在環境中的鉛。鉛礦的開采與加工是人類活動直接釋放的主要鉛暴露源之一,且并未隨著鉛減排的推行而停止。2011年至2021年間,全球鉛的年開采產量約為400萬t至500萬t,鉛的年精煉化產量(包括新開采的鉛與回收的鉛)約在1 000萬t至1 100萬t[7]。人類活動直接釋放的鉛暴露源存在典型的區域性特征。例如,非洲地區的鉛污染問題主要歸因于其礦產資源的不當開采[8]。在以美國為首的部分國家及地區,含鉛管道的安裝引起了嚴重的日常用水中的鉛污染問題[9]。在中國,鉛礦的開采量和冶煉量遙遙領先于世界[7],同時中國還是煤炭的生產和消耗大國,因此鉛生產以及燃煤導致的鉛排放是中國鉛污染的主要來源[10]。

環境中留存的鉛可通過人類活動再次釋放,成為人體接收的鉛暴露源。冰芯中鉛濃度的數據顯示,工業革命后鉛的環境濃度呈現上升趨勢,2000年鉛的環境濃度約為工業革命時鉛濃度的3倍且遠高于工業革命前,因此鉛在環境中的積累以及再釋放導致的濃度上升不容忽視[11]。

1.2 新的鉛暴露源

鉛已被廣泛應用于光伏電池和風力渦輪機的儲能,如鉛酸電池與鉛基鈣鈦礦太陽能電池[12-13]。隨著可再生能源的普及,全球儲能需求增加,新的鉛暴露源不斷涌現。在很多中低收入國家,不受管制的鉛回收活動也因此成為了環境鉛污染與人體鉛暴露的重要來源[13]。鉛基鈣鈦礦作為目前最有效的光伏材料,其潛在的毒性已被驗證[12,14],如果發生泄露,遇水會釋放高水溶性與高生物利用度的碘化鉛[15],該化合物的生物有效性約為其他含鉛污染物的十倍[16]。隨著全球范圍內對清潔能源的推廣使用,鉛基鈣鈦礦可能成為一種不容忽視的鉛暴露來源。中國是全球鉛酸電池的主要生產國、精煉國和消費國[17],同時隨著“雙碳”政策的推行,新的鉛污染源的防治將成為我國鉛暴露風險防控中所要面臨的重要挑戰。

2 單細胞水平上鉛的動力學機制

環境中的鉛污染短期內難以根治,人體面臨著持續性的外源鉛暴露,由此導致鉛在人體內不斷積累,對人體健康可能產生不可逆轉的負面影響。傳統的鉛動力學研究主要關注鉛在區室間的周轉,僅以控制鉛的攝入來減少鉛對人體的危害,因此人體內鉛動力學的研究亟需完善單細胞水平上的循環機制,進而尋找富有臨床意義的鉛排出路徑,為解決鉛暴露引發的健康問題提供重要支撐。本章節較為詳細地描述了人體內鉛的循環路徑,對現有的單細胞水平上的鉛動力學機制進行總結,并進一步探討其研究意義,為建立單細胞水平上鉛的動力學模型以及人體內鉛的排出方法提供新的思路。

2.1 傳統的鉛動力學機制

鉛主要通過呼吸道與胃腸道進入人體[18]。肺部的鉛顆粒通過肺泡毛細血管膜進入血液,其余的顆粒會被肺泡巨噬細胞或淋巴系統清除[7,19]。胃腸道部分的鉛吸收與腸上皮細胞、腸壁排列細胞等有關[18,20],通過主動運輸、被動運輸以及胞飲作用進入腸道組織[20-21]。在運輸過程中,鉛與其他金屬競爭運輸蛋白以及結合蛋白,因此鉛的吸收受人體攝入的營養素影響[18,22]。

鉛分布過程中,血液將鉛運送到各個靶器官,起到關鍵的連接與運輸作用。血液中約99%的鉛被紅細胞吸收[23],其余的鉛在血漿中進行傳輸,血液中的大部分鉛與蛋白質或者配體絡合[24-27]。骨骼以不溶性磷酸鹽的形式儲存鉛,承擔了人體中約95%的鉛含量[23]。鉛可以隨新骨生成儲存在骨礦物基質中。同時,鉛以異質離子交換返回血漿,或者在破骨細胞主導的骨吸收過程中釋放返回血液[28-31]。軟組織中的鉛主要與蛋白質結合,目前已有研究在大鼠的大腦與腎臟中發現了與鉛親和力很高的鉛結合蛋白[32-33]。

人體內不同形式的鉛存在不同的代謝途徑。烷基鉛會在完全氧化后生成無機鉛,四甲基鉛和四乙基鉛會生成有高度神經毒性的代謝物[34]。無機鉛通過配體反應來進行代謝,可與各種蛋白質、氨基酸以及非蛋白硫醇結合形成配合物[18]。

鉛經過腎小球濾過作用和近端腎小管重吸收作用隨尿液排出人體[35-36]。糞便和唾液等均是鉛的排出途徑[37],如圖1所示。

圖1 鉛的動力學機制示意圖Figure 1 Schematic diagram of kinetic mechanism of lead.

2.2 單細胞水平上鉛動力學機制

隨著單細胞技術的發展,厘清鉛傳輸與鉛分布的細胞機制,完善單細胞水平上的鉛動力學機制,成為探究人體內鉛動態變化以及改善鉛中毒治療效果的一種有效途徑。

鉛在生物體內的細胞轉運機制與大多數離子相近。血液中的鉛通過介導Cl-與HCO3-的陰離子交換蛋白[38],以及鈉泵與鈣泵的陽離子轉運機制進入紅細胞[39-40]。研究發現,鉛可以通過鈣離子通道進入大鼠垂體瘤細胞(GH3細胞)與大腦的神經膠質細胞[38,41-44]。陰離子交換蛋白也參與了腦部星形膠質細胞的鉛運輸過程[38,41-44]。利用體外建立的血腦屏障模型,可以證明二價金屬離子轉運蛋白1在血腦屏障中鉛轉運的介導作用[38,41-44]。腎臟中的鉛通過二價金屬間共同存在的競爭性轉運蛋白進行轉運,包括鋅轉運蛋白以及二價金屬離子轉運蛋白1,但具體細節仍存在爭議[44]。

隨著細胞異質性的不斷驗證[45-46],同一類型細胞對同種污染物的不同反應也與人體內的鉛動力學高度相關。細胞異質性所導致的隨機過程會在微觀角度上影響鉛的轉運與分布,但鉛總量層面的檢測與研究忽略了細胞的異質性,這也是當前鉛治療效果受限的關鍵所在。鉛的總量分布差異可以間接地體現細胞間的鉛含量存在異質性。不同組織中鉛的分布顯然不同,但同一組織中的不同區域同樣存在鉛分布的差異性。如,肺部不同肺段累積的鉛濃度存在顯著差異性,區域淋巴結中累積的鉛濃度則明顯高于肺部平均鉛濃度[47]。骨骼中的鉛在不同部位的積累機制不同,其濃度分布與該部位的礦化程度有關[48-50]。更為直觀的是,有研究發現,胎兒血紅蛋白特有的γ鏈對鉛的親和力相比成人血紅蛋白中的α或β鏈明顯增強[25-27]。近期的一篇研究發現,血液中單個紅細胞中的鉛含量呈現差異性分布。其中,成熟紅細胞中的鉛含量明顯低于網織紅細胞中的鉛含量。由于紅細胞主要在骨髓生成,網織紅細胞是紅細胞的前體,說明隨著血細胞的分化成熟,單個血細胞中的鉛含量呈現逐步下降的趨勢[51]。因此,血細胞極有可能在骨髓生成階段吸收大量鉛,隨著其分化成熟逐漸釋放鉛。

細胞異質性不僅體現在污染物的分布吸收中,還體現在污染物對不同狀態細胞的損傷程度上[52]。這也表明,隨著單細胞研究的不斷深入,不同細胞對某一類型的化學污染物的反應差異是可預測的[51]。現有的鉛動力學機制多數從組織層面進行解讀,單細胞水平上的鉛動力學機制研究占比較少,所以忽視了鉛分布的細胞異質性及其他在人體健康風險中所起的作用。因此,需要完善單細胞水平上鉛的動力學機制,揭示各種隨機過程導致的細胞間的鉛分布差異性,形成單細胞水平上鉛循環的閉環路徑,從而對鉛暴露可能造成的細胞毒性進行預估,進一步對各種臨床檢測的低水平鉛暴露癥狀進行單細胞水平上的溯源和治療。

3 鉛的動力學模型

根據鉛的動力學機制與模型,人體內的鉛循環可主要劃分為三個區室:血池、骨池和軟組織池[37,53-56]。隨著鉛的生物動力學、骨骼中礦物質的代謝規律等相關的研究進展,建模工作得以進一步完善和擴展。目前,在鉛風險評估中廣受認可并且被廣泛應用的動力學模型有三種:1)O’Flaherty模型;2)美國環境保護署提出的兒童鉛綜合暴露吸收生物動力學模型;3)Leggett模型[18]。O’Flaherty模型主要考慮了年齡因素對模型的影響,可應用于廣泛年齡范圍內的人體血鉛濃度評估[31,57-60],如圖2(a)所示;兒童的鉛綜合暴露吸收生物動力學模型則主要應用于0～7歲兒童人群,其中包含對于鉛暴露來源的詳細分類[61],如圖2(b)所示;Leggett模型可以廣泛適用于堿土元素以及動力學機制與鈣類似的相關元素,其區室劃分細致,被認為是鉛藥代動力學中較為先進的模型[62],如圖2(c)所示。

圖2 廣泛應用的鉛動力學模型示意圖[31,57-62](a)O’Flaherty模型;(b)兒童的鉛綜合暴露吸收生物動力學模型;(c)為Leggett模型Figure 2 Schematic diagram of lead kinetic models widely used[31,57-62].(a)O’Flaherty model;(b)The integrated exposure uptake biokinetic model for lead in children;(c)Leggett model

在鉛動力學模型由三區室向多區室發展的過程中,模型中不同鉛周轉率的區域劃分更加詳細,越來越多的影響因素被納入考量,如表1所示。有研究以鈣與鉛的競爭性動力學為主導,嘗試將分子機制轉化為具體的數學描述。但該模型同樣存在一定的局限性,例如,缺少更加具體的生物學基礎、分子和細胞機制作為理論依據[63]。

表1 不同鉛動力學模型的特征

值得關注的是,鉛動力學模型的建立愈加重視細胞機制的作用,考量不同離子的交換作用及元素競爭作用。模型的發展趨勢也更加體現了鉛動力學領域對細胞、分子水平上鉛轉運與鉛分布機制的探尋與需求。當前的鉛動力學模型將復雜的運輸機制轉化為不同區室之間的周轉率,平均化地預估各個區室的鉛總量水平,忽視了單細胞水平上存在的分布差異。單細胞水平上的鉛動力學模型將形成單細胞水平上鉛轉運與鉛分布機制的閉環,結合細胞機制與細胞的異質性進行研究,完善人體內單細胞水平上的鉛運輸路徑,有針對性地識別鉛相關毒理效應的誘因,構建鉛從輸入到傳輸再到排出的完整通路,并且根據鉛動力學的運輸與分布機制進行引導,建立臨床上的高效治療方法。單細胞水平上的鉛動力學模型需要更為成熟的單細胞檢測技術支撐,并且借助相關的大數據研究與數學建模方法對檢測得到的批量單細胞數據擬合分析,實現體內鉛暴露來源的定位追蹤,從而完成人體內鉛的溯源。

單細胞水平上鉛動力學機制的完善以及鉛動力學模型的建立對單細胞檢測技術提出了新的要求,而傳統的鉛檢測技術無法實現細胞機制與細胞異質性的研究,單細胞水平上的鉛檢測技術成為了鉛的單細胞研究的關鍵所在。

4 單細胞水平上鉛的檢測技術

傳統的鉛檢測方法已經具有較高的靈敏度和準確度,但只能得到樣本中鉛的總量或者平均指標,無法獲得單細胞層面的信息。單細胞水平上鉛的檢測技術可以彌補傳統檢測方法的缺陷,探索單細胞層面的傳輸與作用機制,更好地體現單細胞分析所強調的細胞異質性。本章節總結了現有單細胞水平上的金屬檢測技術,并對這些技術及其應用進行簡要介紹,以便為人體內單細胞水平上鉛的細胞機制研究提供有效的工具。

4.1 流式細胞技術

細胞流式技術是當前鉛研究領域應用最廣且較為成熟的單細胞檢測技術。該技術通過熒光探針將熒光基團與金屬連接,再利用流式細胞技術進行分選與分析,從而實現單細胞層水平上的金屬檢測。得益于發展較為成熟的熒光成像技術,目前已有較多用于檢測鉛及其他金屬的熒光探針[64]。相比其他體外檢測或確定細胞內是否含鉛的熒光探針,目前的最新研究構建了一種基于若丹明的熒光探針RPb1,可用于細胞內不穩定鉛的檢測,同時利用結直腸腺癌細胞(DLD-1細胞)對其與鉛結合的靈敏度進行驗證。隨后該研究利用流式細胞技術對不同分化程度的人慢性髓系白血病細胞(K562細胞)中的不穩定鉛進行檢測,結果表明,隨著細胞分化程度的提高,蛋白結合鉛的水平增加[65]。

4.2 質譜流式細胞技術

質譜流式技術將流式細胞儀與質譜儀進行結合,利用重金屬同位素標記與抗原特異性結合進行鑒定區分,解決了多參數檢測中熒光發射光譜較寬導致的重疊問題,同時實現了細胞亞群分析與多參數分析[66]。該技術方法在與免疫相關的研究中已經發展得較為成熟,在金屬領域的應用仍然需要拓展。目前有研究利用質譜流式技術與單細胞數據的擬合方法對鉛中毒患者與健康受試者中的鉛分布模式進行分析,發現個體成熟紅細胞中的鉛含量具有高度異質性,鉛中毒患者與健康受試者的單個成熟紅細胞中的鉛含量均符合伽馬分布,且血細胞中的鉛含量隨著其分化程度的上升而下降。該研究也為鉛的體內循環研究提供了單細胞水平研究上的新思路[51]。

4.3 基于電感耦合等離子體質譜的單細胞檢測技術

電感耦合等離子體質譜技術作為近些年金屬檢測應用最廣泛的研究技術,其靈敏度得到了普遍認可[67-68]。目前單細胞水平上可應用的金屬檢測技術包括單細胞電感耦合等離子體質譜技術、電感耦合等離子體飛行時間質譜技術和激光燒蝕-電感耦合等離子體質譜技術等。

單細胞電感耦合等離子體質譜技術根據稀釋法及微流控等方法,利用單個細胞間的充分分離來得到非連續信號,實現單細胞水平上的金屬檢測,其信號強度與單個細胞中的金屬含量成正比[69]。有研究采用單細胞電感耦合等離子體質譜技術測定了單個釀酒酵母細胞中的銀濃度[70],也有研究使用該方法實現了單個細胞中的多種內源性金屬元素的準確測定[69]。

電感耦合等離子體飛行時間質譜可以實現大量分析物中短瞬態信號的多元素測量。根據電感耦合等離子體飛行時間質譜的單細胞分析方法,有研究探究了包括鉛在內的6種重金屬對酵母細胞吸收磷的影響[71]。已有研究利用電感耦合等離子體飛行時間質譜技術實現了高達16種金屬的同時間多元素特異性檢測[72]。

激光燒蝕-電感耦合等離子體質譜技術主要通過前處理方法生產單細胞陣列,用激光燒灼單個細胞產生氣溶膠,氣溶膠被引入電感耦合等離子體質譜實現單細胞水平上的分析。利用激光燒蝕-電感耦合等離子體質譜技術可以對單個巨噬細胞中的銀納米顆粒進行定量[73]。基于壓電聲學微陣列的單細胞陣列新技術,有研究首次利用激光燒蝕-電感耦合等離子體飛行時間質譜完成了單細胞內源性同位素的指紋圖譜[74]。

但是,基于電感耦合等離子體質譜技術的單細胞分析方法仍存在較多挑戰,需要標準化的技術方案[75]與前處理方法來實現該技術的定量檢測。

4.4 單細胞水平上的其他金屬檢測技術

除以上較為系統的研究技術外,現有研究通過結合熒光探針與微流控制系統實現了單細胞中多種金屬離子的分析[76],也有研究利用透射電子顯微鏡、X射線熒光顯微鏡、納米二次離子質譜等實現了單細胞水平上金屬的成像[77-79],但其成像精度使其應用范圍受限,主要應用于細胞體積較大的植物細胞等。

雖然當前單細胞技術日益完善,但單細胞水平上鉛的檢測技術仍需進一步探索與完善,以便支撐鉛暴露有關的單細胞研究。

5 結論與展望

可再生能源的日益普及,可能導致新的人體鉛暴露來源;而體內骨骼對于鉛的儲存作用,可能使大量人群面臨老年時期的體內鉛釋放風險,甚至在母體懷孕階段威脅嬰幼兒的發育健康,所以鉛有關的人體健康風險研究仍十分重要。當前的鉛檢測技術可以實現高精度的鉛總量檢測,但單細胞水平上鉛的檢測技術仍有待推廣應用。檢測技術的局限性導致鉛細胞機制的研究較為欠缺,細胞異質性的相關研究十分有限。多數單細胞水平的鉛研究從毒理效應入手尋求其對應的細胞機制,以減少靶器官的毒理效應,忽略了鉛動力學中可能存在的調控作用與細胞異質性作用,因此較少有研究致力于單細胞水平上鉛的運輸與分布。鉛動力學模型依舊停留在組織層面的鉛總量估算,缺乏對于鉛動力學的動態考量,限制了鉛循環完整體系的構建與鉛臨床治療效果的改善。

鉛循環中,血液作為關鍵的鉛運輸載體,在不同發育階段直接接收不同的鉛暴露,包括發育過程中人體骨骼的鉛暴露以及成熟后外界環境直接攝入和吸入的鉛暴露。而其他軟組織則由血液進行鉛的傳輸,間接性地暴露骨骼以及外界環境中的鉛,這表明血液在鉛的溯源機制中起到關鍵作用。鉛污染造成的骨鉛蓄積問題對于血液存在著暴露風險,我們對于人體內鉛循環細胞機制的認識尚不成熟,無法對現階段鉛的暴露風險和健康效應進行預估,也無法進一步完成臨床治療中鉛的溯源與根除性治療。

隨著單細胞技術和生物數學模型的發展,鉛的研究重點應該逐漸由總量轉移到細胞層面。從而完善鉛動力學中的細胞機制,建立血液中鉛運輸的路徑以及動態的動力學模型,探索鉛分布異質性的影響因素與可引導的鉛排出路徑,提出有效的臨床治療方法。完善的單細胞理論基礎,標準化和體系化的前處理與檢測方法,儀器的聯用和創新是其中的決定性因素。利用單細胞水平上鉛的檢測技術進行樣品的分析,結合動物實驗進行驗證,將單細胞水平上鉛含量與動力學機制及鉛來源等信息相結合,能為我們解決單細胞水平上人體內鉛動力學的未知機制提供新思路。