基于生物信息學分析濕性年齡相關性黃斑變性的氧化應激相關基因及靶向防治中藥篩選

崔高暢，Amy Yi Hsan Saik，張新慧，馬玉瑋，楊 早*

1.東姑阿都拉曼大學M.Kandiah 醫學與健康科學學院，雪蘭莪 加影 43000

2.寧夏醫科大學藥學院，寧夏 銀川 750004

年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）是全球老年人失明的主要原因之一[1]。AMD 可分為2 種亞型：非滲出性（干性，dry AMD，dAMD）和滲出性（濕性，wet AMD，wAMD）。其中，wAMD 對視力的損害程度遠甚于dAMD。在由AMD 引起的嚴重視力損害的患者中，wAMD 占到了80%及以上[2]。wAMD 發生后患者可表現為視物不清、視物變形、視力下降、中心暗點、眼前黑影等癥狀。視覺的改變是由于脈絡膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）所致。CNV又稱視網膜下新生血管，wAMD 發病過程中，CNV穿過Bruch 膜[3]，進入到視網膜色素上皮下或視網膜下，發生視網膜下的出血、滲出等病理性改變，對視網膜色素上皮細胞及視細胞造成損害。隨著病情的發展，還可發生視網膜色素上皮出血性脫離、玻璃體積血等導致視力突然減退，嚴重者甚至導致失明[4]。wAMD 發病機制尚未完全闡明，可能與氧化應激有關。氧化應激可對視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細胞造成損害，從而導致wAMD 發生發展，但少有其具體機制的相關研究。

目前，推薦的wAMD 標準治療是基于血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抑制劑的使用，這通常需要反復在玻璃體內注射，但可能導致患者對治療依從性較差[5]。中藥因其能作用于多個靶點以緩解各種癥狀、2 種或多種中藥聯合使用時的協同作用以及已被證實的安全性和有效性而聞名[6]。而篩選出預防和治療wAMD 的中藥對于臨床至關重要。綜上所述，本研究旨在利用生物信息學分析wAMD 的氧化應激相關基因并篩選靶向防治中藥，以期為臨床決策提供更多的參考。

1 材料與方法

1.1 芯片數據采集

在 NCBI-GEO（https://www.ncbi.nlm.nihgov/geo/）數據庫中輸入“wet age-related macular degeneration”檢索詞，獲得符合研究需求的基因表達芯片數據集GSE103060。該數據集基于GPL6480芯片分析平臺，由Ehlken 等[7]于2017 年提交，GSE103060 樣本包含16 個樣本，本研究選取其中12 個，其中8 例CNV 樣本和4 例人視網膜色素上皮細胞ARPE-19 正常樣本（對照）。所有數據均可于GEO 數據庫直接獲取，本研究不涉及倫理問題。為了確保數據集的完整性和可比性，使用R 軟件4.3.1 對以上2 組芯片數據進行背景校正、標準化和取對數的轉換。并利用factoextra 和FactoMineR 包繪制聚類圖、主成分分析（principal component analysis，PCA）和箱線圖。

1.2 差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）的篩選

利用R 程序中limma 包，以|log2FC|≥1［FC 表示差異倍數（fold change）］且P＜0.05 為篩選條件進行DEGs 分析。Pheatmap 和ggplot2 軟件包分別用于繪制可視化熱圖和火山圖，以顯示重要DEGs的表達。

1.3 DEGs 的功能富集分析

為了進一步探索上述DEGs 的潛在功能，用clusterProfiler R 軟件包對DEGs 進行基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析（篩選標準設定為P＜0.05），以探究DEGs 的生物過程（biological processes，BP）、細胞成分（cell component，CC）和分子功能（molecular function，MF）及相關通路。并利用微生信在線網站（https://www.bioinformatics.com.cn）進行可視化。

1.4 氧化應激相關基因的獲取與篩選

從GeneCard數據庫（https://www.genecards.org）篩選相關性評分＞7 分的氧化應激相關基因，之后與GSE103060 數據集DEGs 取交集為wAMD 中氧化應激相關DEGs。

1.5 wAMD 中氧化應激差異基因的功能富集分析

用Metascapes（https://metascape.org/gp/index.html）對wAMD 中氧化應激相關DEGs 進行了GO與KEGG 分析（篩選標準設定為P＜0.01），以探究DEGs 的BP、CC、MF 及相關通路。并利用微生信進行可視化。

1.6 蛋白相互作用（protein-protein interaction networks，PPI）網絡構建和關鍵基因的篩選

將篩選出來的氧化應激差異基因導入String 網站（https://www.string-db.org）進行分析，獲得PPI網絡。利用Cytoscape 中的CentiScaPe 2.2 插件，采用3 種算法［度中心性（degree）、接近中心性（closeness）、中介中心性（betweenness）］對氧化應激差異基因篩選關鍵基因（各種算法中均排前10 的關鍵基因），之后取這些關鍵基因的交集，最終得到8 個關鍵基因。

1.7 氧化應激相關關鍵基因驗證

利用GSE103060 作為驗證數據集，驗證關鍵基因在2 組樣本中的表達水平，并繪制柱狀圖。

1.8 wAMD 靶向防治中藥的預測

利用COREMINE Medical 在線數據庫（http//:www.coremine.com/medical）整合中藥與基因互作關系，篩選出藥食同源的中藥材作為預防wAMD 的策略。將關鍵基因輸入數據庫，按照中藥中關鍵基因的頻次≥7 來篩選出靶向防治中藥。

2 結果

2.1 芯片數據質量

運用R 語言對基因表達譜數據集GSE103060進行標準化正態處理，并繪制芯片數據相對表達值均一化箱線圖（圖1-A）。結果顯示，12 個樣本的中位數基本位于1 條水平直線，聚類圖（圖1-B）和PCA 圖（圖1-C）顯示CNV 組與對照組有顯著差異。提示基因芯片質量良好，無異常表達，兩組之間的數據具有可比性，可繼續用于下一步分析研究。

圖1 GSE103060 表達譜數據質量分析 (A)、聚類分析 (B) 和PCA 分析 (C)Fig.1 Quality analysis (A), cluster analysis (B) and PCA analysis (C) of GSE103060 expression profile data

2.2 DEGs 的篩選

對GSE103060 進行差異表達分析，得到1 874個DEGs，其中上調基因747 個，下調基因1 127個，DEGs 的火山圖如圖2-A 所示，DEGs 的熱圖如圖2-B 所示。說明CNV 組與對照組有顯著差異。

圖2 wAMD 差異基因的火山圖 (A) 和熱圖 (B)Fig.2 Volcano map (A) and heat map (B) of wAMD differential genes

2.3 DEGs 的功能富集分析

GO 分析顯示，wAMD 差異基因主要富集在外部包裹結構組織（external encapsulating structure organization）、細胞外基質組織（extracellular matrix organization）、細胞外結構組織（extracellular structure organization）、調控神經突觸發育（regulation of neuron projection development）、軸突發育（axon development）等生物學過程。主要定位于膠原含有的細胞外基質（collagen-containing extracellular matrix）、內質網腔（endoplasmic reticulum lumen）、肌動蛋白細胞骨架（actin cytoskeleton）、谷氨酸能突觸（ glutamatergic synapse ）、基底膜（ basement membrane）等細胞成分。參與細胞外基質結構組分（extracellular matrix structural constituent）、整合素結合（ integrin binding ）、糖胺聚糖結合（glycosaminoglycan binding）、肝素結合（heparin binding）、硫化合物結合（sulfur compound binding）等分子功能。GO 富集柱狀圖展示了BP、CC、MF排名前10 的GO 術語（圖3-A）。

圖3 wAMD 表達譜差異基因的GO (A) 和KEGG (B) 分析Fig.3 GO (A) and KEGG (B) analysis of differential genes in wAMD expression profiles

KEGG 分析結果顯示，wAMD 差異基因主要富集于細胞外基質受體相互作用（ECM-receptor interaction）、黏附斑激酶（focal adhesion）、蛋白質消化吸收（protein digestion and absorption）、河馬信號通路（Hippo signaling pathway），癌癥信號通路（proteoglycans in cancer）、糖尿病并發癥糖尿病并發癥晚期糖基化終末產物-晚期糖基化終末產物受體（ advanced glycation end products-receptor for advanced glycation end products，AGE-RAGE）信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、鈣信號通路（calcium signaling pathway）、近端小管碳酸氫鹽回收（proximal tubule bicarbonate reclamation）、軸突導向（axon guidance）和磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）等，排名前10 的信號通路見圖3-B。

2.4 wAMD 中氧化應激DEGs 的功能富集分析

DEGs 富集分析從GeneCards 中得到1 189 個氧化應激相關基因，將其與GSE103060 的1 874 個DEGs進行韋恩分析，得到wAMD中氧化應激DEGs共117 個（圖4）。GO 分析顯示，wAMD 差異基因主要富集在應對氧化應激（response to oxidative stress）、應對降低的氧氣水平（response to decreased oxygen levels）、細胞對化學應激的反應（cellular response to chemical stress）、應對氧氣水平（response to oxygen levels）、應對低氧癥（response to hypoxia）等生物學過程，主要定位在氧化還原酶活性（oxidoreductase activity）、信號受體激活活性（signaling receptor activator activity）、信號受體調節活性（signaling receptor regulator activity）、受體配體活性（receptor ligand activity）、蛋白質同源二聚體化活性（protein homodimerization activity）等細胞成分。參與囊泡腔（vesicle lumen）、分泌顆粒腔（secretory granule lumen）、胞漿囊泡腔（cytoplasmic vesicle lumen）、細胞外基質（extracellular matrix）、外部包圍結構（external encapsulating structure）等分子功能。GO 分析柱狀圖展示了BP、CC、MF 排名前10 的GO 術語（圖5-A）。

圖4 氧化應激相關基因與wAMD 差異基因的韋恩圖Fig.4 Venn diagram of oxidative stress-related genes and wAMD differential genes

KEGG 分析結果顯示氧化應激相關差異基因主要富集在流體剪切應力與動脈粥樣硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、癌癥信號通路（pathways in cancer）、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路（ AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、癌癥中的蛋白聚糖（proteoglycans in cancer）、Rap 信號通路（Rap signaling pathway）、活性氧物質化學誘癌（chemical carcinogenesis-reactive oxygen species）等。排名前20 的信號通路見圖5-B。

2.5 PPI 網絡構建及功能模塊分析

將117 個氧化應激差異基因導入String 數據庫構建PPI 網絡，預測差異表達基因編碼的蛋白質之間的相互作用。通過Cytoscape 創建了一個共有108個節點、745 條相互作用線的PPI 網絡圖（圖6）。

圖6 PPI 網絡 (A) 及其優化 (B)Fig.6 PPI network (A) and its optimization (B)

2.6 關鍵基因篩選

基于Cytoscape 中的Centiscape2.2 插件，利用其中3 種不同的算法分別篩選出評分最高的關鍵基因。結果如表2 所示，3 種算法中的關鍵基因取交集，得到共有的8 個關鍵基因：白細胞介素6（interleukin 6，IL6）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、低氧誘導因子-1α（低氧誘導因子-1α，HIF1A）、載脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）、纖維連接蛋白基（fibronectin-1，FN1）、過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptor gamm，PPARG）、內皮素1（endothelin 1，EDN1）和神經生長因子（nerve growth factor，NGF）。

表2 wAMD 中氧化應激相關關鍵基因的篩選Table 2 Screening of oxidative stress-related key genes in wAMD

2.7 氧化應激相關關鍵基因驗證

在數據集GSE103060 中，關鍵基因的表達水平結果（圖7）顯示，在CNV 樣本中IL6、HIF1A、EDN1和FN1的表達均顯著高于對照組，APOE、PPARG、NGF和EGFR的表達均顯著低于對照組。

圖7 8 個氧化應激相關關鍵基因驗證Fig.7 Verification of eight key genes related to oxidative stress

2.8 wAMD 防治中藥的預測

利用 COREMINE Medical 在線數據庫（http://www.coremine.com/medical）整合中藥與基因互作關系，篩選防治wAMD 的中藥。以8 個氧化應激相關的關鍵基因作為篩選條件，出現頻次≥7的中藥見表3，可作為防治wAMD 的新策略。

表3 靶向防治wAMD 的中藥預測Table 3 Prediction of traditional Chinese medicine for targeted prevention and treatment of wAMD

3 討論

wAMD 被認為是代謝、功能、遺傳和環境因素之間復雜的多因素相互作用的結果。其中衰老、光照和吸煙等因素已被證明通過誘導氧化應激來促進wAMD 的發病機制，而氧化應激是目前被證實最直接的wAMD 致病因素。由于陽光照射和高氧濃度，視網膜的氧化應激負擔高于其他組織，從而導致視網膜中氧化脂質的水平增加。許多脂質氧化產物已被證明對光感受器和RPE 細胞具有促炎和毒性[8]。這與本研究結果一致，從Top 10 的KEGG 通路中得到與氧化應激有密切相關的通路有6 個，分別是細胞外基質受體相互作用、黏附斑激酶通路、Hippo信號通路、AGE-RAGE 信號通路、鈣信號通路和PI3K-Akt 信號通路。

通過對CNV 樣本中的氧化應激相關差異基因篩選，得出最關鍵的8 個基因，分別是高表達的IL6、HIF1A、EDN1和FN1以及低表達的APOE、PPARG、NGF和EGFR。

IL-6 是與炎癥相關最為典型的細胞因子。在視網膜中，小膠質細胞通過釋放并與一系列細胞因子和趨化因子的相互作用來保護視網膜；然而，當長時間暴露于IL-6 等促炎細胞因子時，小膠質細胞活性會發生退行性變化，并促進循環免疫細胞的募集。這些活性促進內皮細胞遷移和小管形成，從而影響局部血管生成反應的幅度。?olak 等[9]發現wAMD患者的IL-6 水平相比早期的AMD 值更高一點，而這主要是由于慢性低度炎癥而導致，這與本研究結果一致。因此，認為降低慢性低度炎癥是控制AMD的關鍵之一。

HIF1A 是一種轉錄因子，能夠在缺氧條件下激活多種基因的表達，包括VEGF，從而促進血管生成[10]。氧化應激可以影響HIF1α 的表達和功能，從而影響血管生成的平衡。在wAMD 組織樣本中，HIF1A的表達水平顯著上調，可能加劇wAMD 的發展。

EDN1 在血管功能中是重要的調節因子，決定血管中的血流，可能參與血管生成。EDN-1 的產生和釋放可以受到氧化應激的影響。研究表明，氧源性自由基可以增加培養內皮細胞中內皮素-1 的合成，但氧化應激誘導EDN1 含量升高的機制尚不清楚。Chor?ziak 等[11]在一項早產兒視網膜病變相關研究中，證明EDN1 與視網膜病變有關，這與本研究結果一致，相比對照組，CNV 組的EDN1表達顯著升高，表明EDN-1 可能是防治wAMD 的重要潛在靶點。

FN1[12]是由纖維母細胞、內皮細胞、巨噬細胞和肝細胞等合成和分泌的一種糖蛋白，存于體液、細胞表面、結締組織和基底膜中，也分布于眼組織細胞，具有促進組織細胞生長的作用，FN 已用于一些眼病的治療，特別是用于促進角膜上皮修復，取得了較好效果。但目前鮮有FN1 關于wAMD 的報導。在本研究結果中，與對照組相比，FN1在CNV組的表達顯著上升，這可能與眼部自我修復的功能激活有關。

APOE 可以影響血管生成和血管完整性，從而影響視網膜的血液供應和氧氣輸送。盡管APOE 是與阿爾茨海默病密切相關的基因，但APOE 可以影響β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）的清除和纖維化，從而導致Aβ 在視網膜中的沉積和損傷。并在RPE 細胞中高度表達[13]。一項研究表明，缺乏APOE 的小鼠表現出脂質和糖代謝異常，并發展出布魯赫膜增厚以及基底RPE 細胞和布魯赫膜中脂質沉積。Rasmussen 等[14]研究也發現，APOE 結構的變異可能提高AMD 的風險。由此證明，APOE 也是wAMD 潛在的關鍵基因。

PPARG 是一類脂質激活轉錄因子，參與脂質代謝和炎癥過程。在各種致盲疾病中的代謝、血管生成、纖維化、炎癥和氧化應激等多種生理過程的控制中發揮重要作用[2]。而在本研究結果中，PPARG在CNV 組樣本中顯著下調。提高PPARG的表達水平對防治wAMD 有重要意義。

NGF 是一種促進交感神經和外周膽堿能神經生長以及神經感覺通路發育和生長的營養因子。研究表明在動物模型中[15]，眼內給藥NGF 可抑制視網膜神經節細胞變性從而改善AMD 患者的視力。

EGFR 是一種膜酪氨酸激酶受體，能夠調節細胞的增殖、遷移、分化和凋亡等過程，Chen 等[16]報道氧化應激可破壞EGFR/Akt 信號通路，從而抑制ARPE-19 細胞的存活。這一發現提示EGFR/Akt 信號通路可能是預防RPE 細胞氧化損傷的重要靶點。在CNV 組樣本中，EGFR的表達水平顯著下調，可能導致血管生成和RPE 細胞損傷，從而加劇wAMD的進展。

AMD 屬于中醫學“視瞻昏渺”的范疇，在《證治準繩》中首次提出這一病名，并說明了其眼外觀無異常，但出現視物昏朦、視如曲線的癥狀[17]。一項臨床探究統計得出wAMD 的病位證素[18]特征主要為肝、腎、脾，病性主要為陰虛、痰濕、血瘀、氣虛，常見證型有肝腎陰虛、脾虛濕困、痰瘀互結、陰虛火旺、脾虛氣弱。其中肝腎陰虛、精虧血少為主要的病因病機，治療應以補益肝腎、滋陰明目為主。本研究結果與此不謀而同，預測到補益類中藥有人參、人參葉、人參花、枸杞子、白果、黃芪、杜仲、郁金。這些中藥具有滋補、提高免疫力、改善體質的作用，可用于防治wAMD。而血行類中藥丹參、川芎和紅花有助于促進血液循環，可以用于一些與眼部血液供應不足相關的問題。清熱解毒類中藥大黃、黃連和黃芩通常用于清熱解毒，可以在一些眼部感染或炎癥的治療中有一定的作用。葛花、金銀花、紅花和銀杏葉富含抗氧化劑，有助于保護眼睛健康，可以用于一些與眼睛老化或疲勞相關的問題。因此，推薦使用以上中藥來防治wAMD，這對中醫指導下的用藥提供了新的方向。

4 結論

本研究基于基因芯片，通過對wAMD 芯片的挖掘和生物信息分析，差異基因主要富集于氧化應激的相關通路（細胞外基質受體相互作用、黏附斑激酶通路、Hippo 信號通路、AGE-RAGE 信號通路、鈣信號通路和PI3K-Akt 信號通路）。發現wAMD 的氧化應激主要是由IL6、EGFR、HIF1A、APOE、FN1、PPARG、EDN1、NGF引起的。而防治wAMD 氧化應激的首選中藥為人參、黃芪、枸杞子、丹參、銀杏葉等26 種。這將對理解和探索wAMD 的中醫藥防治有重要意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突