當歸實時熒光定量PCR 內參基因篩選

朋冬琴 ，羅蜜蜜 ，郭欣慰，栗孟飛 , ，魏建和*

1.甘肅農業大學 生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730070

2.干旱生境作物學國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730070

3.中國醫學科學院北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193

4.甘肅農業大學農學院，甘肅 蘭州 730070

當歸Angelicasinensis(Oliv.) Diels 為多年生草本植物，主要種植于我國甘肅、云南和青海等高寒陰濕地區[1-2]。其干燥根為我國常用大宗藥材，具有補血活血、調經止痛、潤腸通便等功效[3-4]?，F代藥理研究表明，根中多糖對保肝、類風濕性關節炎和缺血性中風[5-7]，酚類化合物對抗炎、抗增殖和血小板聚集[8-10]，以及有機酸對抗阿爾茨海默病、抗氧化和抗炎等具有顯著效果[4,11-12]。

獨特的藥理作用，促使當歸全球市場需求量逐年增加，目前，年均需求量已超過30 000 t，種植面積約43 000 hm2[13-14]。但在實際的生產過程中，當歸產量和品質的提升一直受到早薹開花、連作障礙和逆境脅迫等因素的制約[14-16]。大量研究證實，當歸產量和品質的形成主要受到基因表達調控的影響，比如，質量標志物阿魏酸的生物合成受到苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）、肉桂酸4-羥化酶基因（C4H）、對香豆素酸3-羥化酶基因（C3H）和咖啡酸3-O-甲基轉移酶基因（COMT）的調節[15]；早薹開花受到constans 1 過表達抑制劑（suppressorofoverexpression ofconstans1，SOC1）、開花時間控制蛋白（flowering timecontrolproteinFCA，FCA）和早花3（early flowering3，ELF3）等基因的調控[16-19]；逆境脅迫（如寒冷、干旱和病原體）受到乙烯反應性轉錄因子（ethylene‐responsivetranscriptionfactors，ERFs）、冷反應蛋白激酶1（cold‐responsiveproteinkinase1，CRPK1）和促分裂原活化蛋白激酶（mitogen‐activated proteinkinases，MPKs）等基因的調控[19]。因此，準確檢測當歸生長過程中的基因表達水平，對于產量和品質的促成具有重要作用。

目前，Northern 印跡、RNase 保護分析、原位雜交、半定量逆轉錄PCR（semi-RT-PCR）和實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）等多種檢測方法已被應用于檢測動物、植物和微生物中基因的表達水平[20]。其中，qRT-PCR 檢測因其高效、靈敏和適用于不同樣品而被廣泛應用于評估基因的表達水平[20]。在qRT-PCR 實驗中，內參基因通過控制潛在的實驗誤差，在規范靶基因的表達水平方面發揮著關鍵作用[20-22]。肌動蛋白（Actin，ACT）、泛素結合酶（ubiquitin-conjugating enzyme，UBC）、核糖體蛋白Ls（ribosomal protein Ls，RPLs）、18S 核糖體RNA（18S ribosomal RNA，18SrRNA）、含NAC 結構域的蛋白質（NAC domain-containing protein，NAC）和伸長率1-a（elongation factor 1-a，EF1-a）等持家基因通常被選為qRT-PCR 檢測中的內參基因[23]。例如穿心蓮中的UBC[24]，三葉木通和板藍根中的EF-1α[25-26]，以及延胡索中穩定表達的RPL7均是持家基因[27]。

到目前為止，只有ACT[28]和甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）[29]被報道用于當歸qRT-PCR 檢測中的內參基因。隨著測序技術的快速發展，從當歸中鑒定出越來越多的持家基因[16-19,30]，這為選擇穩定的內參基因奠定了基礎。本研究基于當歸全長轉錄組獲得的13 個候選基因和前期文獻報道的ACT，通過 qRT-PCR 檢測和 geNorm、NormFinder、BestKeeper、?Ct以及RefFinder 軟件分析，綜合評估了14 個候選內參基因在當歸不同生長期、春化溫度、組織部位以及抽薹/未抽薹植株中的穩定性。研究結果將為當歸產量和品質形成過程中的基因表達分析提供重要參考。

1 材料和儀器

1.1 植物材料

本研究所用樣品原植物由甘肅農業大學孫學剛教授鑒定為傘形科當歸屬植物當歸A.sinensis(Oliv.) Diels。樣品采集詳細信息見表1。所有樣品在qRT-PCR 統一檢測前，?80 ℃保存。

表1 樣品詳細信息Table 1 Detailed information of experimental samples

1.2 儀器

臺式高速離心機（德國SORVAL 公司）；ABI QuantStudio 5 實時熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）；NanoDrop 2000 紫外分光光度計（美國Thermo公司）。

2 方法

2.1 總RNA 提取和cDNA 合成

使用Plant RNA Kit 試劑盒（R6827，Omega 公司）提取總RNA；使用NanoDrop 2000 紫外分光光度計檢測RNA 樣品濃度（A260/A280在1.90～2.10）；通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 完整性；FastKing RT 試劑盒（KR116，Tiangen）合成cDNA。

2.2 引物設計和qRT-PCR 檢測

基于當歸全長轉錄組數據[19]（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA789039），從中篩選出13個候選內參基因，利用NCBI 中Primer-BLAST 工具設計引物，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；另外，還選擇前期報道的1 個ACT基因[28]，具體序列及產物長度見表2。利用SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒（FP205，Tiangen）進行qRT-PCR 檢測。利用Excel 繪制標準曲線，橫坐標（X）為cDNA 稀釋倍數的對數值，縱坐標（Y）為Ct值，得到標準曲線方程和線性相關系數（R2），根據標準曲線斜率值計算擴增效率[32]。

表2 qRT-PCR 分析引物序列Table 2 Sequences of primer used in the qRT-PCR analysis

2.3 數據分析

使用Microsoft Office Excel 2010 進行數據處理，使用 geNorm[33]、NormFinder[34]、BestKeeper[35]和?CT[36]軟件對候選內參基因的表達穩定性進行分析，利用RefFinder 在線網站綜合評價內參基因[37]，采用SPSS 22.0 軟件進行One-Way ANOVA Duncan 數據差異性分析（P＜0.05）。

2.4 候選內參基因的驗證

為了驗證所選內參基因表達的穩定性，針對2 個關鍵基因SOC1和CAD1在當歸4 個不同生長發育時期（S1～S4）的表達水平進行比較。SOC1是花器官分生組織形成過程中的關鍵基因，可通過整合外界環境和內在因素等各種成花途徑信號，激活下游花器官發育所需的基因促進植株開花[38]。CAD1可參與催化香豆醛形成松柏醇，然后聚合形成木質素[39]。qRT-PCR 檢測同“2.2”項，采用2?ΔΔCt法計算基因相對表達水平[40-42]。

3 結果與分析

3.1 引物驗證

對當歸各組織RNA 進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，發現均具有28 S RNA、18 S RNA 2 條明顯清晰的條帶，且沒有消失或彌散現象（圖1），說明RNA 沒有降解，完整性良好，符合后續實驗要求。qRT-PCR 結果顯示，14 個候選內參基因擴增效率在96.31%～108.71%，相關系數在0.953 2～0.999 1（表3）。同時，每個引物的熔解曲線均為特異的單一擴增峰（圖2），沒有產生引物二聚體，表明這14 個候選內參基因均具有良好的特異性，反應專一性高，符合qRT-PCR 引物標準，可以進行后續實驗。

圖1 不同樣本總RNA 瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA from different samples

圖2 14 個候選內參基因溶解曲線Fig.2 Melting curves of 14 candidate reference genes

表3 候選內參基因的標曲方程、擴增效率及相關系數Table 3 Scalar equations, amplification efficiencies and correlation coefficients of candidate reference genes

3.2 候選內參基因Ct 值分析

在基因表達分析中，Ct值是反映基因表達豐度的一個重要參數，Ct值越低，基因的表達量越高[31]。將熒光定量結果值繪制成箱線圖，箱寬代表數據的波動程度，箱線長度則反應基因的穩定性，圖3 結果顯示，14 個候選基因Ct值分布在18.32～32.99，其中，RPL37A的波動幅度最小，其次是UBC32和RID2；相反，REFA1的波動幅度最大，表明其穩定性最差。

圖3 候選內參基因Ct 值分布Fig.3 Ct value distribution of candidate reference genes

3.3 geNorm 分析

利用geNorm 計算候選內參基因平均穩定值（M），M 值越小，基因表達越穩定（M 值小于1.5為閾值）[33]。圖4 結果顯示，14 個候選內參基因所有M 值均低于1.5，表明這14 個基因表達均相對穩定，進而可以初步用作候選基因。geNorm 軟件評價顯示，在4 個不同生長發育時期樣品中，ACT7和UBC32的M 值最低（0.10），表達最穩定，而NAC071的M 值最高（0.75，圖4-A）；在不同春化溫度樣品中，UBC32和EEF1G的M 值最低（0.07），而RPL37A的M 值最高（0.60，圖4-B）；在不同組織部位樣品中，UBC2和NAC071的M 值最低（0.04），而RPL37A的M 值最高（1.16，圖4-C）；在抽薹/未抽薹植株樣品中，REFA1和EEF1G的M值最低（0.04），而UBC32的M 值最高（0.62，圖4-D）；在所有實驗樣品中，RPL3和EEF1G的M 值最低（0.43），而NAC071的M 值最高（1.02，圖4-E）?；趃eNorm 分析，EEF1G、UBC2、ACT7、REFA1和RPL3表現出相對較高的穩定性。

圖4 geNorm 分析候選內參基因表達穩定性Fig.4 Expression stability of candidate reference genes analyzed by geNorm

為獲得更可靠的評價結果，利用候選內參基因標準化因子的配對差異分析（Vn/Vn+1）來選擇內參基因的最佳數目，Vn/Vn+1＜0.15 時表示n個內參基因已經滿足穩定歸一化[33,35]。圖5 結果顯示，除了V2/V3（0.165）中所有樣品組外，幾乎所有的配對變異值均小于0.15，表明2 個內參基因足以滿足當歸qRT-PCR 定量分析結果的可靠性。

圖5 geNorm 分析候選內參基因配對變異系數Fig.5 Coefficients of paired variation of candidate reference genes analyzed by geNorm

3.4 NormFinder 分析

NormFinder 分析是利用M 值對候選內參基因進行排序，M 值越低，內參基因越穩定[34,43]。表4結果顯示，14 個候選內參基因的穩定性值存在顯著差異，ACT7、REFA1、UBC26和UBC7分別為不同生長發育時期、春化溫度、組織部位、抽薹/未抽薹植株中最穩定的內參基因；而EEF1G為所有樣品中最穩定的內參基因，其次是UBC26和RPL3。NormFinder 分析的14 個候選內參基因的穩定性與geNorm 分析M 值基本一致。

表4 NormFinder 分析候選內參基因的表達穩定性Table 4 Expression stability of candidate reference genes calculated by NormFinder

3.5 BestKeeper 分析

BestKeeper 分析是根據相關系數、標準偏差和RSD 判斷候選基因穩定性，相關系數越高，標準偏差和RSD 越小，基因越穩定，但標準偏差大于1則認為該基因不穩定[44]。表5 結果顯示，14 個候選內參基因的穩定值存在顯著差異，RPL37A、NAC078、NAC078和NAC071分別為不同發育階段、春化溫度、組織部位、抽薹/未抽薹植株中最穩定的內參基因；而UBC2為所有樣品中最穩定的內參基因，其次是UBC32和UBC7。但BestKeeper 分析的14 個候選內參基因的穩定性與 geNorm 和NormFinder 分析結果不一致。

表5 BestKeeper 分析候選內參基因的表達穩定性Table 5 Expression stability of candidate reference genes calculated by BestKeeper

3.6 ?Ct 分析

?Ct分析是通過平均標準偏差對候選基因進行排序，平均標準偏差越低，內參基因越穩定[36]。表6 結果顯示，14 個候選內參基因的穩定性值存在顯著差異，ACT7、REFA1、UBC26和UBC7分別為不同發育階段、春化溫度、組織部位、抽薹/未抽薹植株中最穩定的內參基因；而EEF1G為所有樣品中最穩定的內參基因，其次是UBC26和RPL3。?CT分析的14 個候選內參基因的穩定性與geNorm 和NormFinder 分析結果基本一致。

表6 ?Ct 分析候選內參基因的表達穩定性Table 6 Expression stability of candidate reference genes calculated by ?Ct

3.7 RefFinder 分析

RefFinder 軟件是基于geNorm、NormFinder、BestKeeper 和?Ct軟件的排序值的幾何平均數進行整體排序來確定候選內參基因的穩定性[45]。表7 結果顯示，14 個候選內參基因的穩定性值存在顯著差異，ACT7、UBC32、UBC26和UBC7分別為不同發育階段、春化溫度、組織部位、抽薹/未抽薹植株中最穩定的內參基因；而EEF1G為所有樣品中最穩定的內參基因，其次是RPL3和UBC26。RefFinder分析的14 個候選內參基因的穩定性與NormFinder和?Ct分析結果一致。結合Ct值、geNorm、NormFinder、BestKeeper、?Ct和RefFinder 分析結果，可以選擇EEF1G、RPL3和UBC26作為內參基因，用于評估當歸不同材料中的基因表達水平。

表7 RefFinder 分析候選內參基因的表達穩定性Table 7 Expression stability of candidate reference genes calculated by RefFinder

3.8 內參基因的穩定性驗證

為了驗證所選內參基因的可靠性，選取最穩定的3 個內參基因EEF1G、RPL3和UBC26以及最不穩定的2 個內參基因NAC071和NAC078，對2 個關鍵基因SOC1和CAD1在當歸4 個不同生長發育時期樣品中的相對表達水平進行驗證。圖6 結果顯示，在單個內參基因EEF1G、RPL3和UBC26以及EEF1G＋RPL3、EEF1G＋UBC26和RPL3＋UBC2組合之間，SOC1和CAD1表達水平沒有顯著差異，但單基因NAC071和NAC078過低評估了目的基因的表達，不能準確呈現基因的表達水平。以上結果表明，以最穩定的3 個基因EEF1G、RPL3和UBC26及其組合，可作為當歸不同材料中的內參基因。

圖6 SOC1 和CAD1 在當歸不同生長發育時期的表達穩定性分析Fig.6 Stability analysis of SOC1 and CAD1 expression in Angelica sinensis at different growth and development stages

4 討論

當歸是我國常用大宗藥材，生物和非生物因素顯著影響植株生長和藥效成分生物合成，該過程受到生長和代謝相關基因表達的調控[17-18,46]。因此，準確檢測關鍵基因的表達水平對于提高當歸體內生物活性代謝產物的積累至關重要。鑒于目前當歸僅有2 個內參基因ACT和GAPDH可供選擇的現狀[28-29]，本研究借助前期當歸全長轉錄組測序結果，通過geNorm、NormFinder、BestKeeper、?Ct和RefFinder 軟件分析和驗證，從14 個候選內參基因中篩選得到最穩定的3 個基因EEF1G、RPL3和UBC26。

目前，geNorm、NormFinder 和BestKeeper分析已廣泛應用于篩選植物中的最適內參基因，比如，研究發現CYP和EF-1a適合作為人參的內參基因[47]，ACT5、RPL3和18SrRNA是羊躑躅中表達最穩定的內參基因組合[20]，EF1-a、UBC和ACT是牛膝中表達最穩定的內參基因組合[48]。在本研究中，應用Ct值、geNorm、NormFinder、BestKeeper、?Ct和RefFinder 軟件篩選當歸不同材料中最穩定的內參基因，結果發現，利用相同的方法，不同樣品中14 個候選內參基因的穩定性存在差異，例如，在geNorm 分析中，不同發育階段、春化溫度、組織部位、抽薹/未抽薹植株穩定性較高的基因分別為ACT7和UBC32、UBC32和EEF1G、UBC2和NAC071、以及REFA1和EEF1G；在NormFinder和?CT 分析中，ACT7、REFA1和UBC26表達最穩定；在BestKeeper 分析中，RPL37A、NAC078和NAC078表達最穩定；在RefFinder 分析中，EEF1G、RPL3和UBC26表達最穩定。

由于不同組織和器官以及不同生長條件下的基因表達存在明顯差異[49]，因此，有必要找出最穩定的內參基因組合，確?；虮磉_水平在面對不同的樣品時更加準確。目前，候選內參基因在多個藥用植物中的表達穩定性已有研究報道，例如，EF-1α與18SrRNA是鐵皮石斛不同組織部位中最穩定的內參基因組合[50]；UBC與ACT是甘青青蘭中響應干旱脅迫時最穩定的內參基因組合[51]；ACT與18SrRNA是青蒿中響應鎘脅迫時最穩定的內參基因組合[52]。本研究通過驗證發現，EEF1G、RPL3和UBC26任意二者組合，可用于準確評估當歸不同材料中的基因表達水平。研究結果將為進一步檢測當歸產量和品質形成過程中的基因表達提供重要參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突