基于Rac1 信號通路研究淫羊藿苷對慢性阻塞性肺疾病模型小鼠肺泡巨噬細胞胞葬及吞噬功能的影響

周哲旭，王 省，唐 洲，陳 星，吳耀松，劉 洋，菅佳寧，胡嘯博，劉婭茹，陳玉龍

河南中醫藥大學，河南省中醫方證信號傳導重點實驗室，河南省中醫方證信號傳導國際聯合實驗室，河南 鄭州 450046

慢性呼吸系統疾病包括慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）、哮喘、肺纖維化等，截至2017 年，全球慢性呼吸系統疾病發病率較1990 年增加39.8%，是僅次于心血管疾病和腫瘤的第3 大死亡原因，其主要危險因素包括香煙煙霧、粉塵、生物燃料及空氣污染[1]等。其中吸煙是唯一最可預防的死亡和疾病原因，香煙煙霧除了與COPD 密切相關，還與肺癌、間質性肺病的發展，以及肺部感染和急性肺損傷易感性的增加有關[2]。香煙煙霧包含4 500 多種物質（尼古丁、焦油、一氧化碳等）[3-4]，具有致毒、致突變以及致癌作用。香煙煙霧會引起氧化應激，導致低級別慢性炎癥反應，并通過激活上皮細胞、肺泡巨噬細胞、中性粒細胞和T 淋巴細胞將炎癥細胞募集到氣道[5]。肺泡巨噬細胞發揮吞噬和胞葬功能，清除肺內凋亡細胞、有害顆粒，從而維持內環境穩態，與COPD 等慢性肺部疾病的發生發展密切相關。

目前，很少有治療方法可以影響COPD 的整體病程，現有的治療方法大多以緩解癥狀為主以降低惡化率，如西醫臨床治療慢性呼吸系統疾病以使用支氣管擴張劑、吸入糖皮質激素以及服用抗生素和祛痰藥物為主，這些藥物可以在短期內有效改善肺通氣從而緩解不適，但長期使用也會增加患者微生物感染的風險和頻率[6]。中醫認為，COPD 屬于中醫“肺脹”“肺痿”等范疇，該病首先傷肺，久病肺虛累及脾腎，久虛又導致痰濁、氣滯、血瘀，出現正虛與邪瘀的相互影響。COPD 穩定期以補肺、健脾、益腎為主，而淫羊藿“稟天冬令之水氣，入足少陰腎經，得地潤澤之金味，入手太陰肺經”（《葉天士·本草經解》），入肺、腎、肝經，具有補肝腎、祛風濕、清肺潤肺等功效。淫羊藿苷是淫羊藿的有效成分之一，屬黃酮類物質[7]。淫羊藿苷具有抗氧化作用，能抑制一氧化氮和一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，iNOS）釋放[8-9]，具有抑制炎癥的作用[10]，減少香煙煙霧誘導COPD 小鼠肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中炎性細胞數量，改善香煙煙霧提取物引起的炎癥反應、氧化應激和細胞損傷等[11-12]。說明淫羊藿苷在一定程度上能夠抑制COPD 慢性持續性炎癥反應的發展，為淫羊藿的補肺益腎功能提供實驗依據。課題組前期研究發現，香煙煙霧提取物作用下大鼠肺泡巨噬細胞Rac1 表達降低，淫羊藿苷能夠上調Rac1 表達。現有研究表明，在脂多糖/香煙煙霧誘導的COPD 模型刺激下，Rac1 持續活化并釋放炎癥因子[13-16]，Rac1受抑制會下調巨噬細胞吞噬顆粒物的活性[17]。因此，本研究通過香煙煙霧熏吸法制備COPD 小鼠模型，基于Rac1 信號通路探討淫羊藿苷介導細胞骨架重排改善COPD 穩定期肺泡巨噬細胞胞葬及吞噬功能障礙的分子機制。

1 材料

1.1 動物

SPF 級C57BL/6 小鼠40 只，6～8 周齡，雌雄各半，體質量18～20 g，由北京斯貝福生物技術有限公司提供，動物質量合格證號113242200080854，許可證號SCXK（京）2019-0010。動物適應性飼養1 周后開始造模。實驗動物倫理審查批號DWLL202209008。

1.2 細胞

小鼠肺癌LLC 細胞購自中國科學院昆明細胞庫（編號KCB20781YJ），由本實驗室傳代培養。

1.3 藥品與試劑

淫羊藿苷（質量分數≥98.0%，批號MUST-22012418）購自成都曼思特生物科技有限公司；Rac1 抑制劑（批號S8031-03）購自美國Selleck 公司；無水乙醇（藥用級，批號C13975831）購自上海麥克林生化科技有限公司；PKH26 細胞鏈接試劑盒（批號6008X220861）購自懋康生物公司；TRIZOL（ 批號 284911 ）、pHrodo?Deep RedE.coliBioParticles（批號2510628）購自美國Invitrogen 公司；FITC 鬼筆環肽（批號CA1620）、紅細胞裂解液（批號20210915）購自北京索萊寶科技有限公司；ReverTra Ace qPCR RT 試劑盒（批號117000）購自日本TOYOBO 公司；SYBR Green 熒光染料（批號RK21203）購自武漢ABclonal 公司；兔單克隆抗體Rac1（批號2465S-4）購自美國CST 公司；P21 蛋白激活激酶（P21 activated kinase，PAK）兔多克隆抗體（批號0069245）購自武漢三鷹生物技術有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）鼠單克隆抗體（批號41323）購自美國Genetex 公司；白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA 試劑盒（批號A206H20233 ）、IL-4 ELISA 試劑盒（ 批號A204H20757）購自杭州聯科生物技術有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒（批號AK064V062759）購自武漢Elabscience 公司；乳脂球表皮生長因子8（milk fat globule EGF factor 8，MFG-E8）ELISA 試劑盒（批號L220921733）購自武漢云克隆公司；生長停滯特異性蛋白6（growth arrest specific protein 6，GAS6）ELISA 試劑盒（批號7421898927）購自武漢博士德生物公司；FITC 抗小鼠F4/80 抗體（批號B361742）、APC 抗小鼠CD68 抗體（批號B355351）購自Biolegend 公司；PE-CD206 抗體（批號D0721）購自 Santa Cruz 公司；“紅旗渠”香煙（批號1062453192944302）購自河南中煙工業公司。

1.4 儀器

YP10001 型電子天平（上海衡際科學儀器有限公司）；Fine Pointe WBP 型非束縛小動物肺功能測量系統（美國BUXCO 公司）；FACSCalibur 型流式細胞儀（美國BD 公司）；Epoch 酶標儀（美國Bio-Tek公司）；CL-1000 型紫外交聯儀（美國UVP 公司）；Scientz-48L 型高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Universal Hood II 型凝膠成像掃描儀（美國Bio-Rad 公司）；QuantStudio 6 型實時熒光定量PCR 儀、ProFlex 型PCR 熱循環儀、NanoDrop One/One C 型超微量分光光度計（美國Thermo 公司）。

2 方法

2.1 動物模型制備

雌、雄小鼠分籠飼養，每籠4 只，適應性喂養1 周后，隨機數字法選出雌雄共8 只作為空白組，其余32 只小鼠采用香煙煙霧熏吸法制備COPD 模型[18-19]：造模工具為熏煙架，過濾嘴香煙，PE 塑料膜。造模時長為8 周，造模期間，每周熏煙6 d，每日熏煙2 次，每次間隔3 h 以上。每次熏煙時，將鼠籠置于熏煙架上，外用PE 塑料膜密封，共點燃25 支香煙，熏吸40 min，熏煙架上放置溫度計，實時監測熏煙時的溫度，溫度控制于26 ℃，熏煙結束后，打開塑料膜，穩定30 min 后將小鼠運回動物房，同時期空白組小鼠自由呼吸新鮮空氣。熏煙結束后常規飼養，8 周后判斷是否造模成功[20]。

2.2 動物分組及給藥

將造模成功的32 只小鼠運用隨機數字法分為模型組、Rac1 抑制劑（2.5 mg/kg）組和淫羊藿苷低、高劑量（40、80 mg/kg）組，每組8 只。空白組和模型組ig 生理鹽水（雄鼠0.25 mL/次，雌鼠0.20 mL/次）和ip 生理鹽水（雄鼠0.20 mL/次，雌鼠0.15 mL/次）；Rac1 抑制劑組ig 生理鹽水（雄鼠0.25 mL/次，雌鼠0.20 mL/次）并ip Rac1 抑制劑（雄鼠0.20 mL/次，雌鼠0.15 mL/次）；淫羊藿苷ig 不同濃度的藥物（雄鼠0.25 mL/次，雌鼠0.20 mL/次）并ip 生理鹽水（雄鼠0.20 mL/次，雌鼠0.15 mL/次）。1 次/d，每周給藥6 次，干預4 周。

2.3 一般情況觀察

每日觀察小鼠精神、運動、呼吸狀態、皮膚毛色、飲水飲食等，每周日稱定小鼠體質量，比較各組小鼠第0、4、8、12 周的體質量。

2.4 肺功能檢測

第0、4、8、12 周采用無束縛小動物全身體積描記儀測定無創肺功能。通過軟件記錄分析得出最終潮氣量（TV）、每分鐘呼氣量（MV）、呼氣峰流速（PEF）和50%潮氣量呼氣流量（EF50）。

2.5 小鼠肺組織病理分析

給藥結束后，使用4%多聚甲醛灌注小鼠左肺，固定72 h，將固定好的肺組織乙醇梯度浸泡、石蠟包埋制作蠟塊，用切片機切成4 μm 切片。撈片后，將切片置于烤片機內烤片，按照脫臘、水化、染色、中性樹膠封片流程進行常規蘇木素-伊紅（HE）染色。置于光學顯微鏡下觀察各組氣道、支氣管及肺泡的病理變化。

各組均取6 張病理切片，采用K-viewer 數字病理分析軟件隨機選取6 個視野，在200 倍視野下，避開大、中支氣管與大、中血管，截取圖片，測得視野總面積（S），“十”字線總長度（L），計算視野中肺泡總數（Na）和穿過“十”字線的肺泡間隔數（Ns），計算肺泡平均截距（mean linear intercept，MLI）和單位面積平均肺泡數（mean alveolar numbers，MAN）。

MLI＝L/Ns

MAN＝Na/S

2.6 小鼠BALF 提取肺泡巨噬細胞

末次給藥3 h 后取材，取材前12 h 禁食不禁水。取材時小鼠稱定質量，頸椎脫臼處死，全身噴灑乙醇，迅速轉移至超凈臺內，固定好四肢，手術剪分離小鼠氣管，橫剪“一”字小口后，用5 mL 注射器將4 ℃預冷的PBS 緩慢注入肺內進行肺泡灌洗，收集BALF 至15 mL 尖底離心管內，1 500 r/min 離心10 min，用1 mL 完全培養基重懸，轉移至6 孔板內，收集貼壁細胞即為小鼠肺泡巨噬細胞。

2.7 巨噬細胞胞葬功能測定

將各組小鼠肺泡巨噬細胞種于35 mm 的培養皿中，調整細胞數量為5×105個，每皿2 mL 完全培養基，等待貼壁。同時誘導LLC 細胞凋亡，以每皿20 mL 培養基開蓋置于紫外交聯儀中，以30 000 μj/cm2的紫外強度照射15 min 后，置于CO2培養箱中平衡10 min。平衡結束后使用PKH26 膜標記探針進行染色，使LLC 細胞攜帶紅色熒光。待巨噬細胞貼壁后，按照小鼠肺泡巨噬細胞-LLC 細胞（1∶5）的比例，加入染色后的LLC 凋亡細胞，置于培養箱中孵育1 h，使用4%多聚甲醛避光固定15 min，0.04%臺盼藍淬滅細胞外熒光，1 500 r/min 離心5 min，PBS 重懸后，流式細胞術檢測巨噬細胞熒光強度，肺泡巨噬細胞所攜帶的平均熒光強度代表其吞噬凋亡細胞的能力。

2.8 巨噬細胞吞噬功能檢測

將各組小鼠肺泡巨噬細胞以5×105接種于35 mm 的培養皿中，每皿2 mL 完全培養基，配制熒光標記大腸桿菌溶液（1 mg/mL），將大腸桿菌加入對應各組，終質量濃度為0.1 mg/mL，在CO2培養箱中避光吞噬3 h 后，流式細胞儀檢測巨噬細胞吞噬大腸桿菌的平均熒光強度。

2.9 全血巨噬細胞M1/M2 分型檢測

抽取100 μL 全血，加入F4/80、CD68、CD206抗體避光孵育30 min，加入5 倍體積的紅細胞裂解液，冰上裂解，每5 分鐘避光渦旋1 次，裂解15 min后，4 ℃、450×g離心10 min，重復裂解2 次，配制含5%胎牛血清的PBS 重懸細胞，轉移至含2 mL PBS 流式管中，離心后加入500 μL PBS 重懸細胞，上機檢測。

2.10 ELISA 法檢測肺組織勻漿中TNF-α、IL-4、IL-6 及胞葬輔助因子MFG-E8、GAS6 含量

取小鼠肺組織30 mg，置于1.5 mL EP 管內，用眼科剪將組織剪碎，加入4～5 個小鋼珠和270 μL預冷的PBS，用組織破碎機破碎10 min，離心取上清用于檢測，按照ELISA 試劑盒說明書檢測細胞上清中TNF-α、IL-4、IL-6、MFG-E8、GAS6 的含量。

2.11 qRT-PCR 檢測肺組織Rac1 和PAK mRNA 表達

稱取小鼠肺組織，TRIZOL 法提取RNA，ReverTra Ace qPCR RT 試劑盒合成cDNA，使用SYBR Green Fast qPCR Mix 進行實時熒光PCR 檢測，以GAPDH 為參考基因，用2???Ct法進行定量，對照組的基因表達被標準化為 1。引物序列由GENEWIZ 公司設計與合成，見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.12 Western blotting 檢測肺組織Rac1 和PAK 蛋白表達

稱取肺組織，加入適量裂解液，組織破碎機低溫破碎10 min 后，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，采用BCA 法檢測各組蛋白濃度后變性蛋白，統一蛋白上樣量，蛋白條帶以凝膠成像分析系統進行檢測，使用Image Lab 軟件分析條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值分析各實驗組蛋白表達情況，進行統計分析。

2.13 巨噬細胞吞噬及骨架結構變化觀察

各組小鼠肺泡巨噬細胞種板同“2.8”項，貼壁后吸掉培養液，加入大腸桿菌混懸液，使其終質量濃度為0.1 mg/mL，吞噬3 h 后處理細胞：37 ℃預熱的PBS 清洗細胞2 次；4%多聚甲醛固定10 min；室溫下PBS 清洗細胞2 次，每次10 min；加入2 mL 0.5% Triton X-100 溶液透化處理5 min；PBS 清洗2次，每次10 min；每皿加入1 mL 配制好的FITC 鬼筆環肽工作液（100 nmol/L），室溫避光孵育30 min后，PBS 清洗3 次，每次5 min；使用500 μL DAPI溶液（100 nmol/L）對細胞核進行復染30 s；在皿底中央滴入抗熒光衰減封片劑，蓋上蓋玻片后放入暗盒內，在激光共聚焦下觀察。

2.14 統計學分析

數據采用SPSS 25.0 軟件進行分析，數據符合正態分布，結果以±s進行統計描述。兩組間對比選用獨立樣本t檢驗；多組間對比選用單因素方差分析，方差齊以LSD 為統計依據，若方差不齊則采用DunnettT3檢驗。

3 結果

3.1 小鼠一般情況觀察

實驗期間，空白組小鼠毛色鮮亮，攝食活動正常，二便正常，精神狀態良好，體質量正常增長；模型組小鼠出現煩躁不安，毛色晦暗等現象，撕咬打架較為頻繁，攝食進水減少，墊料較為潮濕，造模第4 周時空白組小鼠體質量增長較快，造模組雌、雄小鼠體質量均增長緩慢，第8 周造模結束時，與空白組比較，其余熏煙雌雄小鼠體質量均有顯著降低（P＜0.05、0.01，表2、3），給藥4 周后，模型組雌雄小鼠體質量雖有較前有所增長，但仍較空白組偏低（P＜0.05、0.01）；與模型組比較，Rac1 抑制劑組及淫羊藿苷高、低劑量組雄鼠體質量有一定升高但無統計學差異，Rac1 抑制劑組及淫羊藿苷高劑量組雌鼠體質量有顯著升高（P＜0.05、0.01）。

表2 各組雄鼠體質量變化 (±s, n = 4)Table 2 Changes of body weight of male mice in each group (±s, n = 4)

表2 各組雄鼠體質量變化 (±s, n = 4)Table 2 Changes of body weight of male mice in each group (±s, n = 4)

與空白組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，下表同。*P < 0.05 **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05 ##P < 0.01 vs model group, same as below tables.

組別 劑量/(mg·kg?1) 體質量/g第0 周 第4 周 第8 周 第12 周空白 — 21.41±0.52 24.13±0.56 26.69±0.27 28.14±0.88模型 — 21.15±0.19 21.87±0.37* 22.77±0.62** 25.57±1.81*Rac1 抑制劑 2.5 21.12±0.67 21.32±2.20* 23.14±0.85** 26.37±1.53淫羊藿苷 40 21.02±0.50 21.97±1.64* 23.51±0.69** 25.80±1.07 80 21.07±0.16 21.49±1.34* 23.54±0.62** 25.96±0.89

表3 各組雌鼠體質量變化 (±s, n = 4)Table 3 Changes of body weight of female mice in each group (±s, n = 4)

組別 劑量/(mg·kg?1) 體質量/g第0 周 第4 周 第8 周 第12 周空白 — 17.46±0.22 19.88±0.36 21.02±0.09 21.74±0.47模型 — 17.35±0.58 18.08±0.65** 18.54±0.99** 19.93±0.94**Rac1 抑制劑 2.5 17.43±0.53 18.50±0.32* 18.81±0.71** 21.33±0.40##淫羊藿苷 40 17.09±0.47 18.13±0.87** 19.16±0.45* 20.48±0.43 80 17.37±0.51 18.31±0.98** 18.54±1.77** 20.88±0.50#

3.2 小鼠肺功能指標比較

如表4～7 所示，造模4 周時，與空白組比較，熏煙小鼠TV、MV、EF50、PEF 有降低趨勢（P＜0.05、0.01）；第8 周造模結束后，模型組小鼠肺功能指標TV、MV、EF50、PEF 顯著降低（P＜0.05、0.01）；第12 周給藥結束后，與空白組比較，模型組TV、MV、PEF 水平仍受損（P＜0.05、0.01）；與模型組比較，淫羊藿苷低、高劑量組小鼠肺功能TV、MV、PEF 水平有明顯改善（P＜0.05、0.01）。

表4 各組小鼠TV 變化 (±s, n = 6)Table 4 Changes of TV in each group of mice (±s , n = 6)

表4 各組小鼠TV 變化 (±s, n = 6)Table 4 Changes of TV in each group of mice (±s , n = 6)

組別 劑量/(mg·kg?1) TV/mL第0 周 第4 周 第8 周 第12 周空白 — 0.25±0.03 0.32±0.03 0.41±0.11 0.39±0.05模型 — 0.23±0.02 0.27±0.03* 0.24±0.08** 0.23±0.07**Rac1 抑制劑 2.5 0.24±0.02 0.27±0.02* 0.31±0.07* 0.27±0.08淫羊藿苷 40 0.24±0.03 0.27±0.06* 0.23±0.06** 0.33±0.07#80 0.24±0.02 0.30±0.04 0.31±0.08* 0.35±0.07##

表5 各組小鼠MV 變化 (±s, n = 6)Table 5 Changes of MV in each group of mice (±s, n = 6)

表5 各組小鼠MV 變化 (±s, n = 6)Table 5 Changes of MV in each group of mice (±s, n = 6)

組別 劑量/(mg·kg?1) MV/mL第0 周 第4 周 第8 周 第12 周空白 — 103.57±15.99 118.16±13.51 182.58±52.40 169.84±13.58模型 — 110.61±4.75 72.96±20.92** 108.07±41.35** 97.92±26.80**Rac1 抑制劑 2.5 121.24±11.02 84.44±20.22** 131.52±29.82* 113.32±32.29淫羊藿苷 40 110.25±7.02 88.90±15.15* 99.87±24.01** 140.79±28.34#80 116.82±10.43 80.90±23.74** 100.68±39.51** 149.58±33.13##

表6 各組小鼠EF50 變化 (±s, n = 6)Table 6 Changes of EP50 in each group of mice (±s , n = 6)

表6 各組小鼠EF50 變化 (±s, n = 6)Table 6 Changes of EP50 in each group of mice (±s , n = 6)

組別 劑量/(mg·kg?1) EF50/mL第0 周 第4 周 第8 周 第12 周空白 — 0.27±0.05 0.45±0.06 0.46±0.13 0.39±0.09模型 — 0.28±0.03 0.35±0.13* 0.29±0.08** 0.28±0.11 Rac1 抑制劑 2.5 0.32±0.07 0.27±0.05** 0.30±0.09** 0.27±0.08淫羊藿苷 40 0.27±0.05 0.28±0.06** 0.25±0.08** 0.30±0.11 80 0.30±0.04 0.35±0.09* 0.29±0.07** 0.35±0.11

表7 各組小鼠PEF 變化 (±s, n = 6)Table 7 Changes of PEF in each group of mice (±s, n = 6)

表7 各組小鼠PEF 變化 (±s, n = 6)Table 7 Changes of PEF in each group of mice (±s, n = 6)

組別 劑量/(mg·kg?1) PEF/mL第0 周 第4 周 第8 周 第12 周空白 — 4.79±0.89 7.31±0.95 10.67±3.79 10.49±1.66模型 — 5.01±0.57 6.22±1.53 5.61±2.36** 5.81±1.69*Rac1 抑制劑 2.5 5.26±0.78 5.68±0.83* 7.02±1.75* 6.95±2.40淫羊藿苷 40 4.81±0.61 5.77±1.33* 5.05±1.24** 8.32±1.96#80 5.08±0.60 6.57±1.26 5.67±1.65** 9.35±2.66##

3.3 小鼠肺組織病理觀察

如圖1 所示，空白組小鼠肺泡大小基本均勻，肺泡壁結構比較完整，肺泡無明顯塌陷，偶見肺泡壁斷裂融合，肺泡腔和肺泡壁炎癥細胞浸潤較少，支氣管管壁未見明顯增厚。模型組小鼠肺泡大小不一，大量肺泡壁斷裂融合，可見明顯肺泡塌陷，肺泡腔擴大，炎性細胞浸潤明顯，支氣管壁可見明顯增厚，管腔狹窄，杯狀細胞與黏液細胞肥大增生，支氣管周圍纖維組織增生。Rac1 抑制劑組和淫羊藿苷低、高劑量組小鼠上述情況明顯改善。

圖1 各組小鼠肺組織病理變化 (HE, ×100)Fig.1 Histopathologic changes in lung of mice in each group (HE, × 100)

3.4 肺組織病理定量分析

如圖2 和表8 所示，200 倍鏡下測得視野總面積0.225 7 mm2，“十”字線總長度為955.41 μm，計算視野中肺泡總數和穿過“十”字線的肺泡間隔數，結果顯示，與空白組比較，模型組MAN 顯著降低（P＜0.01），MLI 顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，Rac1 抑制劑組和淫羊藿苷低、高劑量組MAN顯著升高（P＜0.01），MLI 顯著降低（P＜0.01）。

圖2 各組小鼠穿過“十”字線肺泡間隔數 (HE, ×200)Fig.2 Number of alveolar intervals across cross line in each group of mice (HE, × 200)

表8 各組小鼠MAN、MLI 定量分析 (±s , n = 6)Table 8 Analysis of MAN and MLI in each group of mice(±s , n = 6)

表8 各組小鼠MAN、MLI 定量分析 (±s , n = 6)Table 8 Analysis of MAN and MLI in each group of mice(±s , n = 6)

組別 劑量/(mg·kg?1) MAN/mm2 MLI/μm空白 — 453.48±35.98 43.15±1.54模型 — 298.13±52.94** 70.17±6.10**Rac1 抑制劑 2.5 427.87±85.96## 45.17±4.91##淫羊藿苷 40 400.67±49.60## 45.20±5.00##80 442.65±43.09## 47.84±5.34##

3.5 小鼠肺泡巨噬細胞胞葬、吞噬功能及M1/M2分型檢測

如表9 和圖3 所示，與空白組比較，模型組小鼠肺泡巨噬細胞胞葬及吞噬功能顯著降低（P＜0.05、0.01），促炎M1 型巨噬細胞表達增加（P＜0.05），抑炎M2 型巨噬細胞表達降低（P＜0.01）；與模型組比較，給予Rac1 抑制劑后M2 型巨噬細胞比例增加（P＜0.01），低、高劑量淫羊藿苷干預后胞葬功能增加（P＜0.05、0.01），吞噬功能改善，M1型巨噬細胞比例降低（P＜0.05、0.01），M2 型巨噬細胞顯著增加（P＜0.05、0.01）。

圖3 小鼠肺泡巨噬細胞M1/M2 分型Fig.3 Mouse alveolar macrophage M1/M2 phenotyping

表9 各組肺泡巨噬細胞胞葬、吞噬功能及M1/M2 分型變化 (±s, n = 3)Table 9 Efferocytosis, phagocytosis and M1/M2 phenotype of alveolar macrophage in each group (±s, n = 3)

表9 各組肺泡巨噬細胞胞葬、吞噬功能及M1/M2 分型變化 (±s, n = 3)Table 9 Efferocytosis, phagocytosis and M1/M2 phenotype of alveolar macrophage in each group (±s, n = 3)

組別 劑量/(mg·kg?1) 胞葬平均熒光強度 吞噬平均熒光強度 M1/% M2/%空白 — 752.33±125.92 451.33±37.74 12.50±7.44 32.23±3.88模型 — 147.00±19.00* 208.00±67.27** 24.13±4.59* 13.07±2.15**Rac1 抑制劑 2.5 197.33±15.18 205.67±51.40 19.50±2.31 23.07±1.70##淫羊藿苷 40 549.67±41.02## 276.33±241.71 3.45±1.88## 20.77±4.73#80 454.00±43.35# 241.00±22.27 11.90±6.89# 27.60±4.45##

3.6 小鼠肺組織炎癥因子及胞葬輔助因子含量比較

如表10 所示，與空白組比較，模型組小鼠肺組織勻漿中炎癥因子IL-4、IL-6、TNF-α 水平顯著增加（P＜0.05、0.01），胞葬輔助因子MFG-E8、GAS6水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，Rac1 抑制劑組炎癥因子IL-4、TNF-α 水平顯著降低（P＜0.05、0.01），淫羊藿苷低、高劑量組均能顯著降低相關炎癥因子水平，促進胞葬相關輔助因子的分泌（P＜0.05、0.01）。

表10 各組小鼠肺組織炎癥因子及胞葬輔助因子表達 (±s, n = 6)Table 10 Expressions of inflammatory factors and efferocytosis cofactors in lung tissue of mice in each group (±s , n = 6)

表10 各組小鼠肺組織炎癥因子及胞葬輔助因子表達 (±s, n = 6)Table 10 Expressions of inflammatory factors and efferocytosis cofactors in lung tissue of mice in each group (±s , n = 6)

組別 劑量/(mg·kg?1) IL-4/(pg·mL?1) IL-6/(pg·mL?1) TNF-α/(pg·mL?1) MFG-E8/(pg·mL?1) GAS6/(pg·mL?1)空白 — 43.94±3.15 31.83±2.26 47.24±19.69 73.90±13.04 798.80±190.96模型 — 51.45±6.72* 55.67±13.15* 177.17±10.97** 48.24±5.03* 443.68±77.00*Rac1 抑制劑 2.5 44.09±4.37# 59.17±24.43 52.29±20.30## 47.93±13.61 554.29±135.74淫羊藿苷 40 37.40±4.46## 25.02±2.01# 44.46±1.33## 115.20±27.44# 589.80±15.93#80 46.92±4.81 27.84±4.69# 67.37±13.77## 124.21±18.40# 579.36±8.49#

3.7 小鼠肺組織Rac1、PAK mRNA 表達變化

如表11 所示，與空白組比較，模型組小鼠肺組織Rac1、PAKmRNA 表達水平顯著升高（P＜0.05、0.01）；與模型組比較，各給藥組Rac1、PAKmRNA表達水平顯著降低（P＜0.01）。

表11 各組小鼠肺組織Rac1、PAK mRNA 表達 (±s, n = 3)Table 11 Rac1 and PAK mRNA expressions in lung tissue of mice in each group (±s, n = 3)

表11 各組小鼠肺組織Rac1、PAK mRNA 表達 (±s, n = 3)Table 11 Rac1 and PAK mRNA expressions in lung tissue of mice in each group (±s, n = 3)

組別 劑量/(mg·kg?1) mRNA 相對表達量Rac1 PAK空白 — 1.00±0.00 1.00±0.00模型 — 1.25±0.13* 1.69±0.08**Rac1 抑制劑 2.5 0.91±0.10## 0.57±0.03##淫羊藿苷 40 0.83±0.12## 0.84±0.10##80 0.66±0.20## 0.74±0.07##

3.8 小鼠肺組織Rac1、PAK 蛋白表達

如圖4 和表12 所示，與空白組比較，模型組小鼠肺組織Rac1、PAK 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05、0.01）；與模型組比較，各給藥組Rac1、PAK蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05、0.01）。

圖4 各組小鼠肺組織PAK、Rac1 蛋白表達Fig.4 PAK and Rac1 protein expressions in lung tissue of mice in each group

表12 各組小鼠肺組織PAK、Rac1 蛋白表達 (±s, n = 3)Table 12 PAK and Rac1 protein expressions in lung tissue of mice in each group (±s, n = 3)

表12 各組小鼠肺組織PAK、Rac1 蛋白表達 (±s, n = 3)Table 12 PAK and Rac1 protein expressions in lung tissue of mice in each group (±s, n = 3)

組別 劑量/(mg·kg?1) 蛋白相對表達量Rac1 PAK空白 — 1.38±0.13 0.57±0.18模型 — 2.40±0.54** 1.03±0.26*Rac1 抑制劑 2.5 1.33±0.08## 1.20±0.29淫羊藿苷 40 1.09±0.37## 0.53±0.08#80 0.98±0.31## 0.61±0.06#

3.9 小鼠肺泡巨噬細胞細胞骨架變化

如圖5 所示，與空白組比較，模型組小鼠肺泡巨噬細胞形態僵硬，肌動蛋白絲排列紊亂，吞噬E.coli較少，偽足伸出數量較少；與模型組比較，Rac1抑制劑組和淫羊藿苷低、高劑量組小鼠肺泡巨噬細胞形態明顯改善，吞噬E.coli變多，絲狀偽足伸出。

圖5 小鼠肺泡巨噬細胞骨架形態變化 (×400)Fig.5 Morphologic changes in cytoskeleton of mouse alveolar macrophages (× 400)

4 討論

COPD 在中醫學屬“肺脹”“喘證”范疇，病位主要在肺、脾、腎三臟，以肺虛為始而腎虛為基，且隨著患者病情發展，肺、脾、腎功能受損而導致水谷精微等營養物質化生不足，病人營養不良的風險隨之增加。本研究造模期間發現，在香煙煙霧熏吸下，小鼠的精神狀態及毛發色澤變差，體質量增長緩慢。藥物干預后體質量及一般情況有所改善。肺功能是檢測及評估COPD 的金標準，通過無束縛小動物全身體積描記儀測定無創肺功能，檢測TV、MV、EF50、PEF 評估小鼠肺功能，發現模型組小鼠TV、MV、EF50、PEF 均有一定程度受損，通過肺組織病理切片也可以看出，模型組小鼠肺泡大小不一，斷裂融合較多，有明顯的萎縮塌陷情況，肺泡腔可見大量炎癥細胞浸潤，支氣管壁明顯增厚，纖毛排列不整齊，管腔內外大量炎癥細胞浸潤，MAN顯著降低，MLI 顯著上升；而與模型組比較，Rac1抑制劑組與淫羊藿苷低、高劑量組小鼠肺功能指標有一定程度升高，肺組織損傷減輕，表明淫羊藿苷可以改善COPD 小鼠一般狀態及肺功能損傷。

COPD 的特征性表現——慢性氣道炎癥、持續性的呼吸道癥狀以及進行性的氣流阻塞等，與肺泡巨噬細胞吞噬及胞葬功能受損有關。巨噬細胞在肺內分布廣泛，占肺內免疫細胞的90%以上[2]，巨噬細胞作為前哨細胞，在抗原呈遞、釋放炎性介質的、募集炎性細胞中起重要作用，在清除死亡或凋亡細胞及組織碎片、結束炎癥反應和組織修復中也起重要作用[21-23]。凋亡細胞能夠快速被吞噬細胞吞噬，這一過程可以預防死亡細胞釋放胞內抗原引起的炎癥反應和自身免疫應答是維持內環境穩態的重要基礎[24-27]。本研究結果顯示，煙霧刺激下小鼠肺泡巨噬細胞吞噬及胞葬功能降低，巨噬細胞以促炎M1型為主，使用Rac1 抑制劑及低、高劑量淫羊藿苷干預后，巨噬細胞吞噬及胞葬功能有所恢復，巨噬細胞由促炎M1 型向抑炎M2 型轉化。COPD 患者的肺泡巨噬細胞不僅對流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌的吞噬能力較差，導致細菌定植及感染的反復發生，而且巨噬細胞對細胞碎片、死亡或凋亡細胞清除的胞葬功能也受到抑制，使壞死物質在肺中積累，從而導致炎癥持續存在，加重患者病情[28]。此外，在香煙煙霧刺激下，慢性持續性炎癥反應導致TNF-α、IL-6、IL-8 等炎癥介質的釋放，高表達的TNF-α 負向調節胞葬相關受體分子的表達，使凋亡細胞不能有效清除從而加重炎癥反應，而正常的巨噬細胞胞葬亦可以有效減少TNF-α 等炎癥因子的分泌，且TNF-α、IL-6 等炎性標志物與COPD 嚴重程度密切相關，在COPD 穩定期患者血清和痰液中較正常人升高，并在急性加重期進一步升高[29-30]。巨噬細胞對凋亡細胞的清除是結束炎癥反應的關鍵，MFG-E8、GAS6 作為吞噬細胞表面胞葬輔助因子，是吞噬細胞與凋亡細胞之間的紐帶[31-33]。研究表明，香煙煙霧暴露下的小鼠肺組織凋亡細胞增加，MFG-E8 水平降低，從而引起巨噬細胞胞葬功能的障礙[34]，炎癥刺激下GAS6 被抑制導致巨噬細胞胞葬功能降低[35]。本研究通過檢測肺組織勻漿中炎癥因子與胞葬輔助因子含量，發現模型組小鼠炎癥因子IL-4、IL-6、TNF-α 水平增加，胞葬輔助因子MFGE8、GAS6 水平受到抑制，而給予Rac1 抑制劑及淫羊藿苷干預后，炎癥有所緩解，胞葬輔助因子水平增加，巨噬細胞吞噬及胞葬功能障礙均得到一定程度的改善。說明淫羊藿苷可以改善香煙煙霧引起的小鼠肺泡巨噬細胞胞葬與吞噬功能障礙，該機制可能與Rac1 通路相關。

現有研究表明，活化的Rac1 介導炎癥反應及氧化應激，Rac1 還通過還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶介導活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生[36]。香煙煙霧刺激下會引起肺部炎癥反應并導致ROS 大量堆積，進而產生氧化應激導致肺組織損傷[37]。體內外研究發現，暴露在香煙煙霧下的小鼠肺組織Rac1 表達升高并介導肺泡-上皮間充質轉化[38]。此外，Rac1 在調控細胞骨架重排中發揮重要作用，巨噬細胞發揮吞噬作用需要細胞骨架形態的變化，通過細胞膜結構的改變形成吞噬杯進而包裹被吞噬物[39-40]，其主要過程包括①初始吞噬杯形成：巨噬細胞通過膜表面受體識別病原微生物后，細胞膜內側產生大量肌動蛋白，聚合的肌動蛋白形成初始吞噬杯；②延展：吞噬杯包繞顆粒物使肌動蛋白大量聚集，根據顆粒物形態動態調整其形態和延展方向；③吞噬杯延伸至最大：隨著細胞機械張力的增加，吞噬杯延伸至最大程度，細胞前緣肌動蛋白不斷聚合并伴隨著后方解聚，保持細胞極性及動態平衡[41-43]；④吞噬杯關閉：吞噬杯內包裹顆粒物并完全封閉[39]。肌動蛋白的聚合與解聚、絲的斷裂、末端加帽、絲的集束等動態變化被稱為“肌動蛋白細胞骨架重構”[44]。Rac1 作為Rho家族的小三磷酸鳥苷酶主要研究對象之一，活躍在細胞前沿，形成膜褶皺及板狀偽足，膜褶皺與胞吞作用相關，板狀偽足的形成在細胞遷移中發揮重要作用。本研究收集了小鼠肺泡巨噬細胞，使其吞噬滅活的熒光標記大腸桿菌，共聚焦顯微鏡下觀察發現，模型組小鼠巨噬細胞吞噬大腸桿菌較少，形態變圓且僵硬，大量肌動蛋白絲聚合，排列紊亂，而給予Rac1 抑制劑或淫羊藿苷干預后，巨噬細胞吞噬大腸桿菌變多，細胞形態有所改善。Rac1 與下游效應分子結合，協同完成肌動蛋白聚合與解聚，從而使巨噬細胞發揮正常的吞噬和胞葬功能，Rac1 通過胰島素受體酪氨酸激酶底物p53 蛋白（insulin receptor substrate p53，IRSp53）與WASP 家族蛋白WAVE 結合，刺激Arp2/3 成核肌動蛋白聚合；或通過磷酸化其下游效應器PAK 激活LIM 激酶（LIM kinase，LIMK），活化的LIMK 使得肌動蛋白解聚蛋白cofilin 失活，從而穩定肌動蛋白，此時cofilin可以與突起前緣的Arp2/3 復合物協同作用來促進肌動蛋白聚合，且進一步穩定所形成的板狀偽足或膜褶皺[45]。從mRNA 及蛋白表達結果來看，香煙煙霧制備COPD 模型小鼠肺組織中Rac1、PAK 蛋白及mRNA 的表達上調，使用Rac1 抑制劑及低、高劑量淫羊藿苷干預后可下調其相關表達。說明在香煙煙霧刺激下，Rac1 等相關促進肌動蛋白聚合的分子表達均上調，Rac1 作為細胞前緣膜突起形成的關鍵因子，通過與WAVE 蛋白結合激活Arp2/3 復合物使肌動蛋白聚合排列，使肌動蛋白在細胞前緣不斷堆積，作用于巨噬細胞吞噬杯的早期形成，吞噬杯的形成與包裹閉合是1 個動態過程，香煙煙霧導致Rac1 的持續活化使吞噬杯不能完全閉合，細胞骨架重排障礙進而導致吞噬功能障礙。淫羊藿苷可以通過調節Rac1 及其下游分子的表達，介導巨噬細胞骨架結構重排改善其吞噬及胞葬功能障礙。

此外，Rac1 在吞噬過程中被上調，然后在吞噬體成熟之前被下調[46]，Rac1 在不斷的激活和失活中調控細胞骨架重排，使巨噬細胞發揮吞噬功能，Rac1 活化可以激活巨噬細胞的吞噬功能，但Rac1持續活化則會導致炎癥反應加劇，吞噬杯延伸停滯而無法關閉，導致巨噬細胞吞噬功能障礙，同樣，Rac1 低表達會下調巨噬細胞攝取顆粒物的活性，抑制吞噬體的閉合。通過體內外實驗發現，淫羊藿苷可以調控Rac1 及其下游效應分子的表達，使其恢復正常的激活-失活狀態，從而介導巨噬細胞骨架重排，改善COPD 所致肺功能、肺組織損傷，抑制炎癥反應。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突