基于膽汁酸代謝組學探討芍藥苷改善α-萘異硫氰酸酯誘導膽汁淤積的作用機制

鄧昕雨，吳和霏，李煜兵，章方玲，胡啟超，陳 沅，張雯雯，馬 驍

成都中醫藥大學，西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137

膽汁淤積是指機體膽汁形成異常或膽汁流動障礙，導致膽汁酸無法正常排出而在肝臟和膽管大量蓄積的一種病理狀態，臨床表現為黃疸、瘙癢等[1]。肝內膽汁淤積由肝內小膽管梗阻性病變或肝細胞功能缺陷引起，病情發展至后期發生膽管炎進一步轉化為膽道纖維化、肝硬化，嚴重者導致肝功能衰竭甚至死亡[2]。膽汁淤積的病因多樣，發病機制復雜，嚴重制約了膽汁淤積相關藥物的開發。代表性治療藥物熊去氧膽酸（ursodesoxycholic acid，UDCA）仍存在超40%患者無法響應，約10%患者不耐受的現象。奧貝膽酸能夠有效提高UDCA 治療反應不佳或耐受患者的生存率，但其治療過程存在嚴重的瘙癢不良反應[3]。因此，尋找有效治療膽汁淤積且不良反應小的相關藥物仍是當前研究的熱點。

傳統中醫藥理論將膽汁淤積歸屬于“黃疸”范疇，“濕熱瘀滯”為其主要病機[4]。赤芍清熱涼血、散瘀止痛、清肝火，清瀉肝膽濕熱，改善脈道瘀阻，益膽汁，能夠有效改善膽汁淤積癥狀[5]。現代研究提示芍藥苷是赤芍發揮保肝利膽作用的主要成分，具有廣泛的藥理活性[6]。相關研究也表明芍藥苷能夠調控核因子E2 相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）/NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor pyrin domain containing 3，NLRP3）信號抑制肝臟氧化應激和細胞炎癥；靶向磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號抑制肝細胞鐵死亡；抑制Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號，緩解多種因素誘導的膽汁淤積[7-9]。然而，膽汁淤積的發生發展機制復雜，涉及多種級聯反應和信號的交互，同時伴隨膽汁酸組成和比例的變化[10]。

初級膽汁酸以膽固醇為原料在肝臟中直接合成后，進入腸道通過7-α 脫羥作用生成次級膽汁酸[11]。膽汁酸池由儲存于膽囊中的次級膽汁酸和菌群代謝后的次級膽汁酸2 部分組成[12]。生理狀態下，膽汁酸池的組成和比例趨于穩定狀態，但當膽汁淤積發生后，膽汁酸池的穩態被擾亂，一方面，疏水膽汁酸濾過脂質成分破壞細胞膜，造成膽汁酸排出障礙，進一步損傷肝細胞；另一方面，膽汁排泄紊亂伴隨著膽汁酸組成和比例的改變，毒性疏水膽汁酸大量蓄積加重膽汁淤積，進而損傷肝細胞[13]。因此，關注膽汁酸在膽汁淤積中的變化有助于了解疾病發展進程，明確藥物治療的影響。

代謝組學能夠表征外界干擾或內在因素影響下機體中代謝產物的動態變化，應用信息技術確定細胞、器官或排泄中的代謝變化，能夠監測疾病發生發展過程，捕獲藥物干預疾病的生物標志物，進而闡明藥物機制[14]。因此，本研究基于膽汁酸代謝組學技術分析膽汁淤積過程中膽汁酸結構和成分的變化，利用分子生物學方法對相關靶點進行驗證，探究其作用機制，有助于進一步闡明膽汁淤積的致病機制，并為膽汁淤積的臨床用藥提供參考。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠，體質量（210±10）g，6～7 周齡，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物生產許可證號SCXK（京）2019-0010，合格證號No.110324220102750123。動物飼養于成都中醫藥大學SPF 級實驗動物中心，溫度（25±3）℃，相對濕度（50±5）%，12 h 光暗交替環境，動物使用許可證SYXK（川）2020-124，動物在飼養期間可自由獲取標準飼料和水源。本研究中所有動物護理和實驗程序均經成都中醫藥大學動物倫理委員會批準（批準號No.TCM-2022-305）。

1.2 藥品與試劑

芍藥苷（質量分數≥95%，批號CHB190124）購自成都克洛瑪生物科技有限公司；α-萘異硫氰酸酯（α-naphthylisothiocyanate，ANIT，質量分數≥98%，批號L2104215）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；UDCA（批號L21056A）購自德國Losan Pharma Gmbh 公司；丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒（批號C009-2-1）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒（批號C010-2-1）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）試劑盒（批號C019-1-1）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBIL）試劑盒（批號C019-2-1）、總膽汁酸（total bile acid，TBA）試劑盒（批號 E003-2-1 ）、γ- 谷氨酰轉移酶（ γglutamyltranspeptidase，γ-GT）試劑盒（批號C017-2-1）均購自南京建成生物工程研究所；膽汁酸檢測試劑盒（批號R21006）購自深圳繪云生物科技有限公司；法尼醇X 受體（farnesoid X receptor，FXR）抗體（批號A5942）、β-actin 抗體（批號AC026）購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；膽酸鹽外排泵（bile salt export pump，BSEP）抗體（批號PB9414）購自武漢博士德生物工程有限公司；引物序列由北京擎科生物科技有限公司合成；Foregene RNA 提取試劑盒（批號RE-03011/03014）購自成都福際生物技術有限公司。

1.3 儀器

超高效液相色譜串聯質譜儀（UPLC-MS/MS，美國Waters 公司）；Mill-Q 型濾膜超純水系統（美國Millipore 公司）；1600R 型低溫離心機（上海力申科學儀器有限公司）；FreeZone 4.5 Liter-50C 型冷凍干燥機（美國Labconco 公司）；FLX800T 型酶標儀（美國Bio-Tek 公司）；Forma900 型超低溫冰箱（美國Themo Fisher Scientific 公司）；TBS380 型熒光計（美國Promega 公司）；JA5003 型電子分析天平（上海舜宇平科學儀器有限公司）；CI-S 型倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）；MiSeq Sequencing Platform測序儀（美國Illumina 公司）；2100 型生物分析儀（美國Agilent 公司）。

2 方法

2.1 藥物配制

芍藥苷與UDCA 均溶解于生理鹽水，振蕩搖勻后放置使用。因造模劑ANIT 難溶于水，采用橄欖油溶解，振蕩搖勻，以獲得黃色澄清透明液體為佳。

2.2 分組、給藥與造模

動物適應性喂養1 周后，隨機分為對照組、模型組、UDCA（60 mg/kg）組和芍藥苷低、中、高劑量（50、100、200 mg/kg）組，每組8 只。除對照組和模型組給予等體積生理鹽水外，其余各組ig 相應藥物（10 mL/kg），連續給藥7 d。給藥第4 天，給藥2 h 后，除對照組外，其余各組均單次ig ANIT（60 mg/kg）建立膽汁淤積模型，對照組則給予等體積橄欖油。實驗第7 天，末次給藥1 h 后，各組大鼠ip 烏拉坦，取血清、肝臟組織，?80 ℃冷凍保存。

2.3 生化指標測定

各組大鼠腹部主動脈取血后，于室溫、黑暗條件靜置，4 ℃、3 000 r/min 離心10 min，分離血清。根據試劑盒說明書測定血清中各肝功能指標。

2.4 肝組織病理染色

各組肝臟樣本用4%多聚甲醛保存，于梯度分級乙醇中脫水。將肝臟標本固定并包埋在石蠟塊中，依次用蘇木素-伊紅（HE）染色，并置于顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 膽汁樣本采集

大鼠ip 烏拉坦溶液麻醉，按照前期實驗方法[15]采集大鼠膽總管膽汁，于?80 ℃冷凍保存，以膽汁收集量與流出時間比值代表膽汁體積流量。

2.6 膽汁酸測定

2.6.1 樣本處理 取各組膽汁樣本，冰浴放置以減少樣本降解，并用50%甲醇稀釋100 倍。取50 μL稀釋后的膽汁樣本，加入400 μL 含膽汁酸內標的乙腈-甲醇（8∶2）混合溶劑。振蕩離心后取上清液250 μL，冷凍干燥。干燥后的實際樣品和質控樣本粉末加入40 μL 乙腈-甲醇混合溶液，10 ℃、650 r/min振蕩20 min。加入去離子水60 μL，10 ℃、650 r/min振蕩20 min，混合樣品放在?20 ℃冷凍20 min，4 ℃、1 350 r/min 離心30 min，待測。

2.6.2 色譜條件 流動相A 為10 mmol/L 乙酸銨-0.25%醋酸，流動相B 為乙腈-甲醇-異丙醇（8∶1∶1），梯度洗脫：0～0.3 min，5% B；0.3～0.5 min，5%～10% B；0.5～2 min，10%～15% B；2～3 min，15%～30% B；3～6 min，30% B；6～8 min，30%～35% B；8～9 min，35%～40% B；9～10 min，40%B；10～15 min，40%～75% B；15～15.5 min，75%～100% B；15.5～16.2 min，100% B；16.2～16.3 min，100%～5% B；16.3～17 min，5% B。進樣量為5 μL。

2.6.3 質譜條件 電噴霧電離源（ESI?）；柱溫30 ℃；樣品室溫度10 ℃；毛細管電壓2.0 kV；離子源溫度150 ℃；洗脫溶劑溫度550 ℃；洗脫溶劑體積流量1 000 L/h。

2.6.4 數據處理 UPLC-MS/MS 原始數據通過Masslynx v4.1 軟件處理，對樣品所含膽汁酸進行積分、建立標準曲線和定量分析。iMAP v1.0 軟件用于統計分析，包括主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘-判別分析（ orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）和單維統計檢驗等。PCA 和OPLS-DA 取VIP＞1 且P＜0.05 的代謝物交集作為顯著差異代謝物。

2.7 分子對接

采用分子對接技術模擬芍藥苷與FXR 蛋白的相互作用。通過PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取芍藥苷（CID：442534）的結構，并從蛋白質數據庫（PDB，http://www.rcsb.org/）搜索FXR 的蛋白質信息并以PDB 格式文件下載。獲得的PDBQT 蛋白受體文件，在AutoDock4 中通過去除水并以氫原子代替的方法進行純化，小分子化合物也進行相同操作，并以蛋白質為受體，化合物為配體進行對接模擬，以獲得合適的最小結合能。最終使用PyMol 2.5 對PDB 格式的合成文件進行可視化。

2.8 qRT-PCR 檢測肝組織FXR 和BSEP mRNA表達

按照試劑盒說明書提取各組肝組織總RNA 并合成cDNA，進行qRT-PCR 分析。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.9 Western blotting 檢測肝組織FXR 和BSEP 蛋白表達

取各組肝組織樣本，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液提取蛋白。采用BCA 蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜，封閉1 h，TBST 清洗3 次，加入一抗孵育過夜，TBST 清洗3 次。加入二抗孵育1 h，TBST 清洗3 次，加入ECL 試劑顯影，使用Image J 對條帶灰度值進行統計。

2.10 統計學分析

3 結果

3.1 藥效學研究

3.1.1 芍藥苷對膽汁淤積大鼠的保護作用 記錄實驗期間大鼠體質量的變化（圖1-A），結果顯示膽汁淤積模型建立后，大鼠體質量下降，即出現明顯的膽汁淤積臨床癥狀，如食欲不振、體質量減輕等。實驗第7 天，與對照組比較，模型組大鼠體質量顯著下降（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠體質量下降得到緩解，其中UDCA 組和芍藥苷中、高劑量組體質量均明顯升高（P＜0.05、0.01）。為進一步驗證芍藥苷對膽汁淤積大鼠的改善作用，測定肝臟中的幾種特異性標志物ALT、AST、TBA、TBIL、DBIL 和γ-GT 的含量。如圖1-B～G 所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中以上標志物水平均顯著升高（P＜0.01），提示膽汁淤積模型建立成功。與模型組比較，各給藥組ALT、AST、TBA、TBIL、DBIL 和γ-GT 水平均顯著降低（P＜0.01），且呈劑量相關性。

圖1 芍藥苷對膽汁淤積大鼠藥效學的影響Fig.1 Effect of paeoniflorin on pharmacodynamics of rats with cholestasis

病理結果（圖1-H）顯示，對照組大鼠肝小葉完整，肝細胞呈索狀緊密排列，肝竇明顯。模型組大鼠肝組織結構紊亂，匯管區和肝竇炎癥因子浸潤，伴有明顯的水腫和膽管增生，清晰可見肝細胞脂肪變性。與模型組比較，各給藥組大鼠肝臟水腫和脂肪變性均有明顯改善。此外，UDCA 組和芍藥苷中、高劑量組膽管增生明顯減輕。上述結果提示，芍藥苷具有明顯的肝臟保護作用，能夠改善ANIT 誘導的大鼠肝功能指標升高，抵抗體質量下降，緩解肝組織膽管增生、水腫和脂肪變性，并以200 mg/kg 劑量最佳。

3.1.2 芍藥苷對膽汁淤積大鼠膽汁體積流量的影響綜合上述實驗結果，選擇芍藥苷高劑量（200 mg/kg）組進行后續實驗研究。通過插管法獲取對照組、模型組和芍藥苷高劑量組的膽汁用于后續的膽汁酸代謝差異分析研究。以總流量與實驗時間比值代表每組大鼠膽汁體積流量，結果如表2 所示，與對照組比較，模型組大鼠膽汁體積流量明顯降低（P＜0.05），提示膽汁淤積模型大鼠膽管阻滯，導致膽汁體積流量下降；給予芍藥苷后，膽汁體積流量明顯升高（P＜0.05），表明膽道阻塞得到緩解。芍藥苷能夠改善模型大鼠膽道阻塞，恢復膽汁酸正常運行。

表2 芍藥苷對膽汁淤積大鼠膽汁體積流量的影響(±s , n = 6)Table 2 Effect of paeoniflorin on bile flow rate in rats with cholestasis (±s , n = 6)

表2 芍藥苷對膽汁淤積大鼠膽汁體積流量的影響(±s , n = 6)Table 2 Effect of paeoniflorin on bile flow rate in rats with cholestasis (±s , n = 6)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05。*P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs model group.

組別 劑量/(mg·kg?1) 體積流量/(μL·min?1)對照 — 18.13±1.09模型 — 5.52±0.67*芍藥苷 200 11.02±0.83#

3.2 膽汁酸代謝組學分析

3.2.1 膽汁酸代謝組學輪廓分析 采用UPLCMS/MS 采集對照組、模型組和芍藥苷高劑量組大鼠膽汁酸數據，質量控制結果見圖2-A，所有樣本均在控制界限之內，提示實驗樣本質量可控，數據可靠。分析各組膽汁酸的相對含量（圖2-B），結果顯示對照組、模型組與芍藥苷高劑量組的初級（次級）膽汁酸含量分別為 78.02%（21.87%）、96.14%（12.06%）、87.95%（12.05%），提示ANIT 阻斷膽汁酸的轉化，而給予芍藥苷后能夠恢復該過程。

圖2 大鼠膽汁酸代謝組學分析 (n = 6)Fig.2 Metabolomic analysis of bile acids in rats (n = 6)

PCA 作為一種降維的統計方法，通過正交變換將一組潛在的相關變量轉換為線性不相關變量[16]。首先采用PCA 方法研究對照組、模型組和芍藥苷高劑量組之間的差異（圖2-C、D）。結果顯示，3 組樣本組內分析一致，對照組與模型組組間差異顯著而在模型組與芍藥苷高劑量組組間不明顯。

為了最大限度地分離3 組樣本，采用OPLS-DA方法分析膽汁酸數據，OPLS-DA 得分圖見圖2-F、H，結果表明對照組、模型組、芍藥苷高劑量組3 組間存在顯著差異。置換檢驗用于判斷模型是否過擬合（圖2-E、H），結果顯示對照組與模型組R2Y＝0.972、Q2Y＝0.925，模型組與芍藥苷高劑量組R2Y＝0.822、Q2Y＝0.617，均大于0.5，表明模型質量良好且未出現過擬合。這些參數表明各組間差異成分可靠，結果具有準確的預測特征。

3.2.2 膽汁酸差異代謝物篩選及分析 基于VIP≥1 及P＜0.05 標準篩選差異數據，通過匹配膽汁酸對照品確認差異膽汁酸，總共獲得22 個差異膽汁酸。結果顯示，與對照組比較，模型組有17 種差異膽汁酸，其中初級膽汁酸8 種、次級膽汁酸9 種。與模型組比較，芍藥苷高劑量組的差異膽汁酸包含9 種初級膽汁酸和7 種次級膽汁酸。進一步分析差異膽汁酸，模型組膽汁酸含量顯著降低且特異膽汁酸集中于次級膽汁酸。而芍藥苷治療后，膽汁酸含量明顯升高（P＜0.05），其中6 個差異膽汁酸回調顯著（P＜0.01）。聚類分析3 組差異膽汁酸的分布規律，結果顯示，差異膽汁酸在不同組間區別明顯，組內聚類理想（圖3-A）。Z-score 結果顯示同一水平下，不同差異膽汁酸含量以模型組最低（圖3-B）。

圖3 大鼠差異膽汁酸分析Fig.3 Analysis of differential bile acids in rats

差異膽汁酸含量分析（表3、4）結果顯示，模型組中，牛磺膽酸（taurocholate acid，TCA）、牛磺α 鼠膽酸（tauro-α-muricholic acid sodium，TαMCA）、膽酸（cholic acid，CA）、牛磺熊脫氧膽酸（tauroursodeoxycholic acid，TUDCA）、甘氨熊脫氧膽酸（glycoursodeoxycholic acid，GUDCA）、甘氨鵝脫氧膽酸（glycochenodeoxycholic acid，GCDCA）、甘氨膽酸（glycocholic acid，GCA）、熊脫氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA-7S）、牛磺石膽酸（taurocholic acid，TLCA）、牛磺豬脫氧膽酸（taurohyodeoxycholic acid，THDCA）、甘氨豬膽酸（glycohyocholic acid，GHCA）、甘氨脫氧膽酸（glycodeoxycholic acid，GDCA）、甘氨豬脫氧膽酸（glycohyodeoxycholic acid，GHDCA）、甘氨石膽酸（glycolithocholic acid，GLCA）、熊膽酸（ursocholic acid，UCA）、牛磺脫氧膽酸（taurodeoxycholate acid，TDCA）的含量明顯降低（P＜0.05、0.01），而牛磺β 鼠膽酸（tauro-β-muricholic acid sodium，TβMCA）的含量升高顯著（P＜0.01）。給予芍藥苷后，初級膽汁酸βMCA、TαMCA、UDCA-7S、UCA、GCDCA、CA、GCA、GUDCA、α 鼠膽酸（α-muricholic acid，αMCA）的含量明顯升高（P＜0.05），而TβMCA 含量顯著減少（P＜0.01）。次級膽汁酸TLCA、GHDCA、HDCA、GDCA、GLCA、NorCA 的含量也回調明顯（P＜0.05）。為進一步明確芍藥苷對膽汁酸代謝的影響，分析3 組間的差異膽汁酸，結果顯示芍藥苷能夠提高6 種初級膽汁酸（TαMCA、CA、UDCA-7S、GUDCA、GCA、GCDCA）和5 種次級膽汁酸（GHDCA、UCA、TLCA、GLCA、GDCA）的含量，降低初級膽汁酸TβMCA 的含量。上述結果表明芍藥苷能夠調節膽汁酸池組成和結構的變化，促進初級膽汁酸向次級膽汁酸轉化，降低毒性膽汁酸含量，進而改善ANIT 誘導的膽汁淤積。

表3 差異初級膽汁酸分析 (±s, n = 6)Table 3 Differential primary bile acid analysis (±s , n = 6)

表3 差異初級膽汁酸分析 (±s, n = 6)Table 3 Differential primary bile acid analysis (±s , n = 6)

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，表4 同。*P < 0.05 **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05 ##P < 0.01 vs model group, same as table 4.

組別 劑量/(mg·kg?1) TαMCA/(μmol·L?1) TβMCA/(μmol·L?1) TCA/(μmol·L?1) TUDCA/(μmol·L?1) αMCA/(μmol·L?1) βMCA/(μmol·L?1)對照 — 2 143.53±140.36 1 788.22±258.08 10 213.76±957.62 379.85±53.38 34.94±11.20 24.84±8.73模型 — 184.97±53.38** 6 738.84±821.15* 3 827.96±597.16** 130.14±18.02** 1.14±0.53** 3.62±1.65*芍藥苷 200 1 271.53±342.03## 2 368.79±1 129.25## 3 426.10±864.85 168.47±18.33 49.06±21.25## 21.57±7.01#組別 劑量/(mg·kg?1) CA/(μmol·L?1) GCA/(μmol·L?1) GUDCA/(μmol·L?1) GCDCA/(μmol·L?1) UDCA-7S/(μmol·L?1)對照 — 160.13±48.93 2 895.55±216.73 237.33±33.84 523.67±73.75 4.61±0.80模型 — 4.80±1.93** 85.55±32.26** 11.26±2.16** 37.95±13.51** 0.24±0.03**芍藥苷 200 89.84±36.09# 1 604.52±648.53# 315.46±133.80## 653.46±207.07# 2.84±0.62#

表4 差異次級膽汁酸分析 (±s, n = 6)Table 4 Differential secondary bile acid analysis (±s , n = 6)

表4 差異次級膽汁酸分析 (±s, n = 6)Table 4 Differential secondary bile acid analysis (±s , n = 6)

組別 劑量/(mg·kg?1) THDCA/(μmol·L?1) TDCA/(μmol·L?1) TLCA/(μmol·L?1) UCA/(μmol·L?1) GHCA/(μmol·L?1) NorCA/(μmol·L?1)對照 — 3 734.78±815.03 752.38±176.74 8.79±1.55 1.01±0.26 2.06±0.40 0.77±0.31模型 — 201.59±69.99** 51.65±32.75** 0.78±0.33** 0.04±0.01** 0.21±0.15 0.04±0.02**芍藥苷 200 715.64±344.90 185.75±75.52 4.04±0.92# 0.59±0.20# 7.53±4.05# 0.84±0.29##組別 劑量/(mg·kg?1) GHDCA/(μmol·L?1) GDCA/(μmol·L?1) GLCA/(μmol·L?1) HDCA/(μmol·L?1) DCA-3S/(μmol·L?1)對照 — 489.67±92.38 155.75±16.62 1.32±0.20 2.09±0.71 0.21±0.06模型 — 4.29±4.83** 1.81±1.42** 0.02±0.02** 0.03±0.01** 0.06±0.01*芍藥苷 200 141.44±58.11# 80.87±33.25# 2.61±1.05## 0.55±0.20# 0.30±0.12#

3.3 芍藥苷對膽汁淤積大鼠膽汁酸受體的影響

3.3.1 芍藥苷與膽汁酸核受體FXR 的分子對接基于上述膽汁酸代謝的結果，進一步探索芍藥苷與膽汁酸代謝相關受體的關系。FXR 是調控膽汁酸穩態的核心靶點，既通過激活膽汁酸轉運體BSEP 等的表達促進膽汁酸的外排，又抑制膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）的活性進而影響膽汁酸的合成[17]。采用分子對接技術模擬芍藥苷與FXR 的結合，對接結果見圖4-A。芍藥苷通過2 個氫鍵與FXR 的HIS444 位點發生相互作用。另一方面，受體與配體間的結合能越低，兩者親和力越好，所形成的構象越穩定。二者結合能為?10.11 kJ/mol（＜?5 kJ/mol），提示芍藥苷與FXR 具有較高親和力。因此，FXR 可能是芍藥苷調控膽汁酸代謝的關鍵靶點。

圖4 芍藥苷對膽汁酸受體的影響Fig.4 Effects of paeoniflorin on bile acid receptors

3.3.2 芍藥苷對膽汁酸受體FXR、BSEP的mRNA及蛋白表達的影響 為進一步研究膽汁酸受體在芍藥苷改善ANIT 誘導膽汁淤積中的作用，對核受體FXR 和外排轉運受體BSEP 的表達進行測定。如圖4-B～F 所示，與對照組比較，模型組大鼠肝組織FXR和BSEP的mRNA 和蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05、0.01）；與模型組比較，芍藥苷高劑量組大鼠肝組織BSEP的mRNA 和蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05），FXR的mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.01）；芍藥苷中劑量組FXR 的蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。表明芍藥苷能夠恢復膽汁淤積狀態下膽汁酸受體的抑制，改善膽汁酸的合成和轉運，發揮肝臟保護作用。

4 討論

芍藥苷是從赤芍中分離提取的水溶性單萜苷類化合物，能夠治療多種肝膽疾病[18]。課題組前期已經確證赤芍及其關鍵成分芍藥苷治療膽汁淤積效果顯著，然而，膽汁淤積致病成因復雜，芍藥苷在其中發揮作用的機制尚不完全清楚。本研究在明確芍藥苷改善膽汁淤積藥效研究的基礎上采用膽汁酸代謝組學技術，深入膽汁酸動態變化過程，探索二者的作用關系，進一步說明芍藥苷發揮作用的關鍵機制。

ANIT 是常用的肝內膽汁淤積造模劑，該模型具有較好的重現性。ANIT 能夠結合膽汁中的谷胱甘肽造成膽汁分泌和流動的中斷，進而破壞膽管上皮細胞細胞膜，引發肝內膽管增殖，阻塞膽管。ANIT與谷胱甘肽結合的同時，大量活性氧被釋放，激活炎性因子，誘發膽管炎癥而在病理組織中顯示出明顯的炎癥浸潤和膽管增生[19-20]。膽汁淤積的早期生化標志物以γ-GT 為主，隨后在黃疸階段出現高水平的DBIL 和TBIL[21]。而ALT 和AST 是肝臟功能損傷的黃金指標，其活性的升高有助于臨床診斷肝膽疾病[22]。本研究結果顯示，模型組大鼠血清肝功能指標均顯著升高，組織病理學能夠觀察到肝竇及匯管區大量炎性浸潤的發生且匯管區周圍伴隨膽管增生和肝細胞脂肪變性，與文獻報道相對應，提示ANIT 誘導的膽汁淤積模型建立成功[23]。芍藥苷治療后，大鼠膽汁淤積癥狀明顯減輕體質量得到恢復，ALT、AST、TBIL 等肝功能指標較模型組呈劑量相關性下降。各給藥組肝小葉緊密排列，肝細胞脂肪變性，匯管區增生膽管減少，水腫及炎性浸潤被有效抑制。此外，膽汁體積流量測定結果提示芍藥苷緩解ANIT 導致的膽道阻塞，提高膽汁體積流量。表明芍藥苷能夠有效緩解ANIT 誘導的膽汁淤積，發揮肝臟保護作用。

生理狀態下，膽汁酸首先在肝竇門靜脈中被攝取，由肝細胞內轉運，并排泄至膽管，轉運過程伴隨著膽汁酸的化學修飾，如葡萄糖醛酸化或與氨基酸結合、羥基化、磺化等[24]。分泌到腸道的膽汁酸經過腸肝循環能夠高效捕獲大約90%的膽汁酸經門靜脈返回肝臟并在肝細胞中再攝取[25]。膽汁酸代謝穩態失衡后，以疏水膽汁酸為主的毒性膽汁酸積聚肝臟進而引發膽汁淤積[26]。因此收集各組大鼠膽汁探索給藥前后膽汁酸成分及比例的變化。結果顯示ANIT 刺激后，包括TCA、GCA 和GCDCA 在內的7 種初級膽汁酸含量明顯減少而TβMAC 的含量顯著增加。芍藥苷治療能夠逆轉模型組初級膽汁酸的減少，恢復膽汁酸含量但對TβMAC 呈現降低作用。有趣的是，不同于CA、CDCA，TβMAC 是一種FXR拮抗劑，能夠抑制FXR 活性影響膽汁酸合成[26]。針對這一膽汁酸成分的變化，對FXR 受體進行測定，Western blotting 結果顯示ANIT 誘導后，該蛋白的表達被明顯抑制，給藥后該作用被逆轉；PCR 實驗也提示高劑量芍藥苷顯著上調FXR 表達。因此，我們推測芍藥苷通過降低模型大鼠TβMAC 的含量恢復被拮抗的FXR 活性，促進膽汁酸代謝趨于平衡。

相關研究證實膽汁酸的解毒過程伴隨FXR 的激活，激活后的FXR 進一步誘導BSEP 活性的增強加速毒性膽汁酸的外排[27]。BSEP 作為膽汁酸由肝細胞進入膽汁的主要轉運體，能夠運輸包括CA、CDCA 在內的牛磺酸和甘氨酸綴合類膽汁酸[28]。結合代謝組學和分子實驗，結果顯示CA、CDCA 等膽汁酸的含量在模型組顯著降低，BSEP 蛋白和基因表達均受到抑制，提示BSEP 抑制后，CA 等膽汁酸無法由肝細胞轉入膽汁而在肝細胞中大量蓄積誘導肝內膽汁淤積。而芍藥苷治療后，膽汁中CA、CDCA 的含量明顯增加，BSEP 活性得到改善。這些結果說明ANIT 刺激下，CA 等膽汁酸含量的降低和TβMAC 含量的升高抑制FXR 的激活進而影響轉運體BSEP 活性，大量膽汁酸蓄積肝細胞，最終誘發肝內膽汁淤積。而芍藥苷能夠調節膽汁酸的成分和比例，恢復膽汁酸池穩態從而改善FXR 和BSEP 活性，促進肝內膽汁酸外排而緩解膽汁淤積。

綜上，芍藥苷能夠顯著改善膽汁淤積導致的生化指標異常，緩解肝臟病理損傷，通過調節膽汁酸池組成，促進膽汁酸轉化，降低毒性膽汁酸含量恢復膽汁酸核受體FXR、膽汁酸轉運體BSEP 的活性，改善膽汁酸的合成及轉運過程對抗膽汁淤積。然而，膽汁淤積的發生發展涉及多個器官因子的相互串擾，本研究僅從膽汁成分變化反映疾病的機制是不全面的，后續研究應當結合分析血清、尿液中的膽汁酸代謝物組成，進一步明確芍藥苷發揮作用的關鍵成分及其變化趨勢。此外，膽汁酸的調控有賴于膽汁酸受體和腸道菌群的共同作用，一方面疏水性膽汁酸在菌群的作用下進行修飾轉化為毒性較小的親水性膽汁酸，另一方面菌群可間接作用于腸道FXR、成纖維細胞生長因子19（fibroblast growth factor 19，FGF19）等受體改善膽汁酸的重吸收，因此后續研究可以結合腸道菌群分析、菌群移植等技術，進一步明確“肝臟-腸道”系統作用下的膽汁酸的動態變化特征。

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