川芎調節血腦屏障通透性的作用及機制研究

劉明妍 ，劉力榕 ，馮夢晗 ，朱美霞 ，張銀環 ，閆曉寧 ，方 聰 ，屈碧瓊 ，賈志鑫, ，劉 潔, ，肖紅斌, *

1.北京中醫藥大學中藥學院，北京 102400

2.北京中醫藥大學 中藥分析與轉化研究中心，北京 102400

3.北京中醫藥大學 北京中醫藥研究院，北京 102400

血腦屏障存在于哺乳動物腦部結構中，為神經元功能創造離子穩態[1]，調節營養物質或代謝物在血液和大腦之間的運輸，保護中樞神經系統免受外來物質的傷害[2]。相比其他組織屏障，血腦屏障具有低通透性、高選擇性及低胞飲特點，其對物質運輸的嚴格調控使得藥物的腦靶向運輸成為難題[3-4]。適當地調節血腦屏障的通透性是臨床中常采用的手段[5]。

川芎ChuangxiongRhizoma是現代臨床中治療頭痛的常用中藥之一[6-7]。《醫學啟源》（金·張元素）記載：“川芎屬風藥，能升散，輕清上達，充塞頭頂，引藥上行至腦，直達病所[8]”。一項探析風藥對血管性癡呆各種證型治療效果的研究發現川芎可引他藥直達腦絡[9]。研究發現川芎與復方舒郁健腦方配伍可增加酸棗仁皂苷A 在小鼠腦組織中的蓄積[10]，與天麻配伍可提高天麻素苷元在腦內的生物利用度[11]。Zheng 等[12]進一步發現川芎成分藁本內酯、洋川芎內酯A、洋川芎內酯I 可降低MDCK-MDR1 細胞單培養血腦屏障模型的跨細胞內皮電阻值，增加芍藥苷、松果菊苷從頂端側到基底側方向上的表觀滲透系數。川芎具有引導他藥通過血腦屏障上行于頭部[13]的作用，但目前缺乏具體闡述川芎對血腦屏障通透性的研究數據，且對體外血腦屏障模型通透性的研究只集中在少數成分（藁本內酯、洋川芎內酯A、洋川芎內酯I）。故本研究考察川芎對血腦屏障通透性的作用及機制，以期為相關研究提供依據。

1 材料

1.1 動物及細胞系

SPF 級雄性昆明小鼠118 只，體質量19～22 g，購自北京斯貝福生物技術有限公司，實驗動物使用許可證號SCXK（京）2020-0033，飼養于北京中醫藥大學動物房屏障環境中（倫理批準號1117052400125），24 h 光照和黑暗循環，溫度（20±2）℃，相對濕度（50±10）%，正常飲食，自由飲水。

小鼠腦微血管內皮細胞bEnd.3 由北京博奧凱美科技有限公司提供。

1.2 藥品與試劑

川芎飲片（批號2104040）購自北京太洋樹康藥業有限責任公司，經北京中醫藥大學王學勇教授鑒定為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖；對照品洋川芎內酯I（批號Y-085-170609）、洋川芎內酯A（批號Y-083-200326）、洋川芎內酯H（批號Y-084-180408）、藁本內酯（批號G01001909024）、歐當歸內酯A（批號O002006004）、阿魏酸（批號A-002-161216）均購自成都瑞芬思生物科技有限公司，質量分數＞98%；4-羥基-3-丁基苯酞為實驗室分離制備得到，經核磁共振波譜與高效液相色譜檢測確定質量分數＞98%；SDS-PAGE配膠試劑盒（批號20200328）購自北京索萊寶科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（批號9232）、RIPA裂解液（批號9116）均購自愛必信（上海）生物科技有限公司；異硫氰酸熒光素-葡聚糖[fluorescein isothiocyanate-dextran，FITC-dextran，批號46944（相對分子質量4×103）、批號FD40S（相對分子質量4×104）、批號46945（相對分子質量7×104）、批號46946（相對分子質量1.5×105）]均購自默克西格瑪公司；熒光素鈉（fluorescein sodium，Na-F，批號S19188）購自上海源葉生物科技有限公司；CCK-8試劑盒（批號K001062211）購自北京蘭博利德生物科技有限公司；嵌入式細胞培養小室（批號665640）購自德國格瑞納公司；閉鎖蛋白（Occludin）抗體（批號27260-1-AP）、閉鎖小帶蛋白1（zonula occluden-1，ZO-1）抗體（批號21773-1-AP）、血管內皮細胞鈣黏合素（VE-cadherin）抗體（批號27956-1-AP）、P 糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）抗體（批號22336-1-AP）、β-actin 抗體（批號81115-1-RR）均購自武漢三鷹生物技術有限公司；埃茲蛋白/根蛋白/膜突蛋白（ezrin/radixin/mesin，ERM）抗體（批號DF12396）購自Affinity Bioscience 公司；p-ERM 抗體（批號ab76247）購自艾博康（上海）貿易有限公司；HRP 標記的山羊抗鼠/兔二抗（批號20040/20039）、蛋白酶抑制劑（PMSF，批號36978）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；磷酸酶抑制劑混合型（批號1861281）、甲醇（批號206403）購自美國賽默飛世爾科技公司；DMEM 高糖培養基（批號8121451）購自Invitrogen 公司；胎牛血清（批號1928700）購自Biological Industries；胰酶蛋白酶-EDTA 消化液（批號202011229）購自江蘇凱基生物技術有限公司；人血漿纖連蛋白（批號F-2006）購自默克西格瑪公司；0.05 mol/L Tris-HCl（批號R00237）購自北京雷根生物技術有限公司。

1.3 儀器

Milli-Q Advantage A10 型純水儀制備系統、旋轉蒸發儀（東京理化器械株式會社，配備有N-1300型旋轉支架、OSB-2200 型水浴鍋、WELCH 真空泵）；Infinite M200Pro 型多功能酶標儀[帝肯（上海）實驗器材有限公司]；MM400 型珠式樣品勻漿儀（上海弗爾德上海儀器設備有限公司）；Mini-PROTEAN Tetra Cell and PowerPac Basic Power 垂直電泳系統套裝（伯樂生命醫學產品有限公司）；Amersham Imager 680 型化學發光成像儀[思拓凡生物科技（杭州）有限公司]；SQP-PRACTUM224-1CN 型分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；3K15 型高速冷凍離心機（默克西格瑪公司）；ERS-2 型跨內皮電阻儀（密理博中國有限公司）。

2 方法

2.1 川芎提取物的制備

川芎飲片分別以12 倍量、10 倍量95%乙醇加熱回流提取2 次，濾過，濾渣以10 倍量水加熱回流提取2 次，濾過，合并濾液濃縮，得到質量濃度為1 g/mL 的川芎提取液。

2.2 川芎提取物含量測定

2.2.1 樣品制備 川芎提取物稀釋至1 μg/mL，0.22μm 微孔濾膜濾過，轉移至棕色液相小瓶，待測。

2.2.2 色譜條件 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相A 為0.1%乙酸-10 mmol/L 乙酸銨-水溶液，流動相B 為乙腈，梯度洗脫，正離子：0～5 min，80%～60% A；5～6 min，60%～40% A；6～8 min，40%～20% A；8～10 min，20%～5% A；10～12 min，5% A。負離子：0～3 min，98%～70% A；3～6 min，70%～5%A；6～7 min，5% A。體積流量0.4 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量5 μL。

2.2.3 質譜條件 Dual AJS 電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），正、負離子多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）掃描模式，干燥氣溫度300 ℃，干燥氣體積流量9 L/min，鞘氣溫度250 ℃，鞘氣體積流量11 L/min，毛細管電壓＋4 kV、?3.5 kV，具體參數見表1。

表1 7 個化合物的質譜參數Table 1 Mass spectrometry parameters of seven compounds

2.3 動物分組與給藥

實驗前動物禁食12 h，自由飲水。小鼠隨機分7 組（n＝10），其中1 組為對照組，其他6 組均為給藥組。對照組ig 生理鹽水后麻醉，給藥組ig 川芎提取物（5.8 g/kg，以生藥量計），分別于給藥0.5、1、2、4、6、8 h 后麻醉，iv FITC-dextran（30 μg/g，相對分子質量4×103），循環5 min，從心臟灌流生理鹽水后取腦組織。

另取同一批次的小鼠48 只，隨機按FITCdextran 相對分子質量（4×104、7×104、1.5×105）分成3 組（n＝16），每組再分為對照組和給藥組（n＝8），對照組ig 生理鹽水0.5 h 后麻醉，給藥組ig 川芎提取物0.5 h 后麻醉，iv 不同相對分子質量的FITC-dextran（30 μg/g），循環5 min，從心臟灌流生理鹽水后取腦組織。

2.4 腦組織樣品處理[14]

腦組織加入等倍量的Tris-HCl（pH 7.6），勻漿10 min，4 500 r/min 離心取上清液，上清液中加入等體積甲醇沉蛋白，15 000 r/min 離心取上清液。采用多功能酶標儀（Ex＝485 nm，Em＝535 nm，n＝3）測定各組腦組織上清液的熒光強度，計算單位腦組織質量含有的FITC-dextran 含量。

2.5 體外血腦屏障模型構建及川芎單體成分透過血腦屏障通透性實驗

2.5.1 細胞培養 bEnd.3 細胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素（10 U/mL）的高糖DMEM 培養基，于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，按1∶3 傳代，0.25%胰酶（含0.05% EDTA）消化。凍存液為胎牛血清-二甲基亞砜（9∶1），每管細胞數≥1×106個/mL。復蘇時在37 ℃條件下快速解凍轉移至預熱完全培養基中，吹打離心后常規培養。

2.5.2 血腦屏障模型構建及評價 取生長密度80%的bEnd.3 細胞，消化計數，調整細胞密度為2×105個/mL。取內表面鋪被人血漿纖連蛋白[15]的Transwell 小室，供給池加入0.5 mL 細胞溶液，接收池加入1.5 mL 完全培養基，細胞沉降后轉移至培養箱中。供給池每天換液，接收池隔天換液。

細胞貼壁后使用跨內皮電阻儀檢測跨內皮電阻（transepithelial resistance，Teer），計算組織電阻Ω，Ω最高且維持穩定認為血腦屏障基本形成。

Ω＝(Ω實驗－Ω對照)×S

Ω實驗為細胞模型小室Teer 值，Ω空白為對照小室Teer 值，S為小室底膜面積（1.1 cm2）

2.5.3 分組及給藥 實驗分為對照組和不同濃度的洋川芎內酯A、洋川芎內酯H、阿魏酸、洋川芎內酯I、藁本內酯、歐當歸內酯A、4-羥基-3-丁基苯酞給藥組。對照組供給池加入含終質量濃度為1 μg/mL Na-F 的完全培養基0.5 mL，接收池加入空白完全培養基1.5 mL；給藥組供給池分別加入含終質量濃度為1 μg/mL Na-F 和不同濃度（1、10、100 μmol/L）藥物的完全培養基0.5 mL，接收池均加入空白完全培養基1.5 mL。

給藥后0.5、1、2、4、6、8 h 于接收池取樣100 μL，取樣后補充相同體積培養基至接收池。樣品采用多功能酶標儀（Ex＝485 nm，Em＝535 nm）檢測，計算Na-F 的表觀滲透系數（apparent permeability coefficient，Papp）。

Papp＝(dQ/dt)×1/A×1/C0

dQ/dt表示轉運時間dt內的藥物轉運速率（μg/s），A表示小室單層膜表面積（cm2），C0表示初始熒光素鈉藥物質量濃度（1 μg/mL）

血腦屏障模型成功與否采用Teer[16-17]及Na-F[18]的Papp評價。

2.6 Western blotting 檢測蛋白表達

取“2.3”項下給予川芎提取物0、0.5、1、2、4、8 h 的小鼠腦組織，加入含1% PMSF、2%磷酸酶抑制劑的裂解液，低溫勻漿靜置，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，收集上清。取“2.5.3”項下給予10 μmol/L 洋川芎內酯I 0、0.5、1、2、4、8 h 的bEnd.3細胞，收集細胞沉淀，加入含1% PMSF、2%磷酸酶抑制劑的裂解液吹散，低溫靜置，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清。采用BCA 試劑盒定量蛋白，沸水浴10 min 使蛋白變性。蛋白樣品經4%～15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜，加入5%牛血清白蛋白室溫封閉，腦組織蛋白樣品孵育Occludin（1∶2 500）、VE-cadherin（1∶300）、ZO-1（1∶6 000）、P-gp（1∶800）一抗，細胞蛋白樣品孵育p-ERM（1∶1 000）、ERM（1∶1 200）、ZO-1（1∶6 000）、Occludin（1∶6 000）、P-gp（1∶1 250）一抗，4 ℃孵育過夜。洗滌，加入二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h，采用化學發光成像儀分析成像。

2.7 統計學分析

3 結果

3.1 川芎提取物對小鼠血腦屏障的作用

3.1.1 川芎提取物各成分含量 采用外標兩點法測定得川芎提取物中各成分質量分數由高到低依次為洋川芎內酯A 7.1 mg/g、藁本內酯4.37 mg/g、阿魏酸1.9 mg/g、洋川芎內酯I 1.1 mg/g、歐當歸內酯A 0.71 mg/g、洋川芎內酯H 0.21 mg/g、4-羥基-3-丁基苯酞0.057 mg/g。

3.1.2 川芎影響血腦屏障通透性的定量結果 如圖1 所示，與對照組比較，給予川芎提取液0.5 h 后，單位腦質量中相對分子質量為4×103的FITCdextran 含量顯著增加（P＜0.001），隨給藥時間延長，含量逐漸降低至對照組水平。如圖2 所示，與對照組比較，給予川芎提取物0.5 h 后，相對分子質量為4×104、7×104、1.5×105的FITC-dextran 在小鼠腦組織中的含量無顯著性差異。

圖1 給予川芎提取物不同時間后FITC-dextran（相對分子質量4×103）在腦組織中的透過量 (±s, n = 10)Fig.1 Extravasation of FITC-dextran (molecular weight 4 × 103) in brain tissue after Chuanxiong Rhizoma extract treatment for different time (±s, n = 10)

圖2 給予川芎提取物0.5 h 后不同相對分子質量FITCdextran 在腦組織中的透過量 (±s , n = 8)Fig.2 Extravasation of FITC-dextran with different molecular weight in brain tissue after treatment with Chuanxiong Rhizoma extract for 0.5 h (±s, n = 8)

3.1.3 川芎提取物不同給藥時間腦組織中Occludin、ZO-1、VE-cadherin、P-gp 蛋白表達 如圖3 所示，給予川芎提取物0.5、1、2、4、8 h 后小鼠腦組織中Occludin、ZO-1 蛋白表達量呈先降低后增加而后再降低的趨勢：給藥后0.5 h Occludin 蛋白表達量降低，給藥后1、2、4 h 顯著增加（P＜0.05、0.01），給藥后8 h 降低至對照組水平；給藥后0.5 h ZO-1 蛋白表達量顯著降低（P＜0.05），給藥后2 h顯著增加（P＜0.05），給藥后8 h 降低至對照組水平；給藥后0.5 h P-gp 蛋白表達量升高，給藥后2 h顯著降低（P＜0.01），給藥后4、8 h 升高至對照組水平；給藥后VE-cadherin 蛋白表達基本無變化。

圖3 給予川芎提取物不同時間后小鼠腦組織中Occludin、ZO-1、P-gp、VE-cadherin 蛋白表達的變化 (±s, n = 3)Fig.3 Changes in Occludin, ZO-1, P-gp, and VE-cadherin protein expressions in brain tissue of mice after different durations of administration of Chuanxiong Rhizoma extract (±s , n = 3)

3.2 川芎單體成分對血腦屏障細胞模型的作用

3.2.1 血腦屏障細胞模型評價 采用單層內皮細胞模擬正常狀態血腦屏障。bEnd.3 細胞呈多邊形，匯合成片后呈現典型的鋪路石樣結構。模型在培養第5 天時，Teer 值穩定為60 Ω·cm2，（與報道[19]中的70 Ω·cm2基本一致），Na-F 的Papp值為0.5×10?6cm/s，（與報道[20]中甘露醇4.9×10?7cm/s 基本一致），說明本研究中血腦屏障模型構建成功，可用于探究藥物對通透性的影響。

3.2.2 川芎單體成分對血腦屏障細胞模型通透性的影響 給予0～100 μmol/L 的洋川芎內酯A、洋川芎內酯H、阿魏酸、洋川芎內酯I、藁本內酯、歐當歸內酯A、4-羥基-3-丁基苯酞后，bEnd.3 細胞存活率均大于90%。

川芎7 個單體成分對血腦屏障細胞模型中Na-F 表觀滲透系數的影響見圖4，給藥0.5、1、2、4、6 h 后，1、10、100 μmol/L 洋川芎內酯A、洋川芎內酯H、洋川芎內酯I 及阿魏酸均能顯著增加Na-F的Papp（P＜0.05、0.01、0.001）；給藥8 h 后，10、100 μmol/L 洋川芎內酯A、洋川芎內酯H、洋川芎內酯I 及阿魏酸均能顯著增加Na-F 的Papp（P＜0.01、0.001），隨給藥時間延長，Na-F 的Papp逐漸降低至對照組水平。給藥1 h 后，10 μmol/L 藁本內酯顯著增加Na-F 的Papp（P＜0.05）。歐當歸內酯A、4-羥基-3-丁基苯酞對Na-F 的Papp無影響。

圖4 7 個單體成分作用不同時間下Na-F 的Papp (±s, n = 3)Fig.4 Papp of Na-F at different times of action of seven active components (±s , n = 3)

進一步比較給藥后0.5 h 洋川芎內酯A、洋川芎內酯H、洋川芎內酯I、阿魏酸的Na-FPapp百分比（給藥組與對照組Na-F 的Papp比值）探討其促透作用的強弱[17]，結果見表2，相同濃度下洋川芎內酯I 的Papp百分比最高，表明洋川芎內酯I 在bEnd.3單培養血腦屏障細胞模型中促透效應最強。

表2 不同濃度藥物給藥0.5 h 時的Papp 百分比 (±s, n = 3)Table 2 Papp percentage at 0.5 h of drug administration with different concentrations (±s , n = 3)

表2 不同濃度藥物給藥0.5 h 時的Papp 百分比 (±s, n = 3)Table 2 Papp percentage at 0.5 h of drug administration with different concentrations (±s , n = 3)

成分 濃度/(μmol·L?1) Papp 百分比/% 成分 濃度/(μmol·L?1) Papp 百分比/%洋川芎內酯A 1 390.42±131.30 洋川芎內酯H 1 558.03±124.11 10 652.08±91.32 10 980.47±91.79 100 774.22±32.24 100 1 115.67±67.54阿魏酸 1 555.15±204.68 洋川芎內酯I 1 740.31±288.67 10 924.10±117.03 10 1 358.86±273.03 100 1 063.77±128.82 100 1 617.55±177.64

3.2.3 洋川芎內酯I 對bEnd.3 細胞中Occludin、ZO-1、P-gp、p-ERM/ERM 蛋白表達的影響 如圖5所示，與對照組比較，洋川芎內酯I（10 μmol/L）作用bEnd.3 細胞0.5 h 時Occludin 蛋白表達量顯著降低（P＜0.01），給藥1、2 h 時表達量顯著增加（P＜0.05、0.01），給藥4、8 h 時，表達量降低至對照組水平；給藥0.5 h 時ZO-1 蛋白表達量降低，給藥1、2、4 h 時表達量顯著增加（P＜0.05、0.01），給藥8 h 時表達量降低至對照組水平；給藥0.5 h 時p-ERM/ERM 蛋白表達量降低，給藥1、2、4 h 時表達量顯著增加（P＜0.05、0.01），給藥8 h 時表達量降低至對照組水平。P-gp 蛋白表達量呈先降低后升高趨勢。

圖5 洋川芎內酯I 對bEnd.3 細胞中P-gp、Occludin、ZO-1、p-ERM/ERM 蛋白表達的影響 (±s, n = 3)Fig.5 Effect of senkyunolide I on P-gp, Occludin, ZO-1 and p-ERM/ERM protein expressions in bEnd.3 cells (±s, n = 3)

4 討論

本研究采用FITC-dextran、Na-F 作為示蹤劑，研究川芎提取物及單體成分對血腦屏障通透性的影響，通過Western blotting 檢測給藥后腦組織或模型細胞中細胞間連接蛋白的表達變化，明確川芎對血腦屏障通透性的作用和機制。

FITC-dextran 是評估體內血腦屏障通透性常用的指示劑，具有分子惰性、檢測靈敏度高、體內清除速度快等優勢[21]，同時具有利用自身不同相對分子質量評價多種物質（溶質、離子和蛋白質）在血腦屏障上通透性的優勢[22]。生理狀態下0.2%冰片可促進FITC-dextran（相對分子質量4×103）經角膜滲透，這說明了冰片作為眼部藥物穿透促進劑的安全性[23]。3 種標志物肌酐、FITC-dextran（相對分子質量4×103）和羅丹明-dextran（相對分子質量7×104）根據不同相對分子質量可對應確定腸道屏障中孔隙途徑、滲漏途徑和不受分子大小限制的病理性途徑的通透性變化，用以區分腸道疾病中屏障特性的喪失屬于緊密連接通透性增加還是上皮損傷從而輔助確認病程[24]。本研究結果顯示，小鼠給予川芎提取物0.5 h 后，可顯著增加FITC-dextran（相對分子質量4×103）在腦組織中的外滲量，但對相對分子質量4×104、7×104、1.5×105的FITC-dextran 外滲量無影響，說明川芎提取物給藥后小鼠血腦屏障通透性增加，但對途經血腦屏障的物質分子直徑有所限制；給藥8 h 后FITC-dextran（相對分子質量4×103）的外滲量降低至對照組水平，說明川芎提取物增加血腦屏障通透性的作用具有時效性，作用強度由強至弱。

體外血腦屏障細胞模型是快速篩選出具有良好血腦屏障滲透性的中樞神經系統疾病候選藥物的有力工具。本研究結果顯示，川芎中的洋川芎內酯I、A、H 及阿魏酸在給藥時間內能顯著增加Na-F 的Papp，表明其均具有促透作用。已有研究發現，洋川芎內酯I、A 在MDCK-MDR1 血腦屏障模型中具有促透性，能夠增加水溶性物質松果菊苷的Papp[12]，與本研究結果一致。洋川芎內酯H 和阿魏酸的促透性為本研究首次報道。洋川芎內酯H 與洋川芎內酯I 互為手性異構體，二者均易入腦，已有研究學者發現洋川芎內酯H 可用于防治腦卒中[25]，本研究證明其在血腦屏障模型中具有促透性，但洋川芎內酯H作用強度不如洋川芎內酯I，分析原因可能是二者結構上的差別造成本身活性不同。阿魏酸及其衍生化產物可入腦[26-27]，常用于中樞神經系統疾病的治療[28]。值得注意的是，本研究中藁本內酯未顯著改變Na-F 的Papp。然而有研究報道藁本內酯可下調Pgp 的表達，從而增加芍藥苷在MDCK-MDR1 血腦屏障細胞模型中的轉運[29]。本研究中使用的示蹤劑非外排蛋白P-gp 底物[23]，這可能是藁本內酯未顯著改變Na-FPapp的原因。

血腦屏障對大腦微環境嚴格的保護作用限制了藥物靶向到達腦組織中的病變部位。增大細胞旁通透性是親水性藥物更可能透過血腦屏障的途徑[30]。細胞旁通透性由緊密連接蛋白、黏附連接蛋白及彼此間相互作用控制。Na-F 為水溶性小分子物質，主要通過細胞旁途徑運輸，常將其滲透情況作為評價體外模型旁路通透性的指標[31]。Na-F 在血腦屏障模型中的高透過率與模型的低TEER 值保持一致，表明其滲透情況與模型的緊密程度有關[32]。洋川芎內酯I 作用0.5 h 時，Na-F 的Papp最高，隨給藥時間延長，其有回到對照組水平的趨勢，這與洋川芎內酯I 調節bEnd.3 細胞中緊密連接蛋白ZO-1、Occludin 及pERM/ERM 表達水平的結果基本一致。ZO-1 聯結跨膜連接蛋白與肌動蛋白細胞骨架[33]，ZO-1 失活將破壞緊密連接的實質結構[34]。Occludin與其他緊密連接蛋白的順式相互作用增加緊密連接的復雜性，從而增強血腦屏障的屏障完整性[35]。各緊密連接蛋白與肌動蛋白或細胞骨架之間相互作用的改變會導致血腦屏障通透性增加[36]，如ERM 蛋白是維持細胞間蛋白質膜定位所必需的錨定蛋白[37]，研究報道銀杏內酯可通過影響p-ERM/ERM 的表達水平增加Na-F 在HCMEC/D3 和HEB 共培養血腦屏障細胞模型中的透過量[32]。

冰片是應用廣泛的緊密連接調節劑。研究表明，大鼠給藥冰片0.5 h 時，大鼠血-視網膜屏障中內皮細胞的Claudin-5 和Occludin 發生細胞膜-細胞質向易位，1 h 時胞質中Claudin-5 和Occludin 表達量達到峰值，4 h 時表達量開始下降，8 h 時恢復至對照組水平[38]。本研究表明，川芎提取物給藥0.5 h 時Occludin、ZO-1 表達量降低，P-gp 表達量增高；給藥2 h 時Occludin、ZO-1 表達量達到峰值，Occludin、ZO-1 表達量達到谷值；給藥8 h 時三者恢復至對照組水平。洋川芎內酯I 給藥0.5 h 后，bEnd.3 細胞中Occludin、ZO-1、p-ERM/ERM 蛋白表達量降低；給藥1 h 后均顯著高于對照組水平；給藥8 h 后恢復至對照組水平，因此推測川芎具有與冰片類似的可逆性調節血腦屏障通透性的性質，其影響血腦屏障通透性的機制可能與可逆性調節Occludin、ZO-1、P-gp 及p-ERM/ERM 蛋白表達水平有關。

綜上，川芎在一定程度上可增加血腦屏障通透性，且該作用具有時效性，是緊密連接調節劑的潛在開發對象，洋川芎內酯I 是良好的候選成分。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突