補陽還五湯抗腦卒中網(wǎng)絡動力學研究

譙 茹 ，樊啟猛 ，賀 鵬 ，李海英 ，張偉龍 ，李文嬌 ，潘 雪 ，賀福元 ,

1.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南 長沙 410208

2.中藥成藥性與制劑制備湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208

3.湖南中醫(yī)藥大學 中醫(yī)藥超分子機理與數(shù)理特征化實驗室，湖南 長沙 410208

4.中藥藥性與藥效國家中醫(yī)藥管理局重點實驗室，湖南 長沙 410208

缺血性腦卒中是一種由于腦動脈血栓淤積，腦局部供血障礙，腦組織隨即缺血、缺氧，形成局部梗死灶，引發(fā)神經(jīng)功能障礙及機體損傷的疾病[1]。缺血性腦卒中具有發(fā)病率高、復發(fā)率高、致殘率高、致死率高的特點，引起的生理病理級聯(lián)反應可在數(shù)分鐘內(nèi)引起缺血核心區(qū)不可逆神經(jīng)組織功能損傷，嚴重影響患者的身體健康和生活質(zhì)量，給其家庭和社會經(jīng)濟帶來沉重負擔[2]。目前針對缺血性腦卒中的治療，主要采取藥物注射溶栓及機械介入除栓2種方法，然而這2 種方法治療時間窗窄，出血風險大，具有嚴格的適應證，且后遺癥較多，預后效果差，臨床應用范圍受限[3]。

補陽還五湯出自清代醫(yī)學家王清任的《醫(yī)林改錯·卷下·癱痿論》[4]，作為治療缺血性腦卒中的經(jīng)典方劑之一，以氣虛血瘀立論，具有補氣、活血化瘀、通絡的功效，臨床療效顯著[5-6]。而中藥復方制劑具有多成分、多靶點、多途徑的特點，其活性成分的復雜性以及可調(diào)節(jié)靶點的多樣性一直是方劑研究的重點和難點[7]。目前關(guān)于中藥復方成分的藥物動力學研究，多按不同時序分析復方中代表性成分單次或多次給藥、配伍給藥等藥-時曲線下面積變化，成分在不同組織的達峰濃度（Cmax）、達峰時間（Tmax）、半衰期（t1/2）等藥動學參數(shù)大小[8]，簡單回答藥效成分在體內(nèi)的分布及代謝情況，忽略成分與成分在體內(nèi)分布與代謝時相互作用的動力學規(guī)律以及成分之間可能存在的君臣佐使作用關(guān)系，雖有見一成分對另一成分的體內(nèi)代謝作用研究，但也未闡明作用動力學本質(zhì)規(guī)律[9]。而關(guān)于中藥復方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究，主要集中于利用網(wǎng)絡藥理學等分析藥物成分對相關(guān)靶點作用強度關(guān)系，配伍前后化學成分變化，不同提取方法對提取物成分及藥理作用差異，入血藥源成分差異[10]等研究。雖說明了中藥組方成分在體內(nèi)、體外的變化過程，提供一定的參考價值，但仍未闡明成分之間變化規(guī)律。

基于此，本課題組負責人以超分子“印跡模板”理論中的物質(zhì)流量平衡原理建立網(wǎng)絡動力學數(shù)學模型[11-12]，將成分或靶點都視為網(wǎng)絡節(jié)點，對應的質(zhì)量濃度為Ci，各節(jié)點之間相互連接，對于含n個節(jié)點的網(wǎng)絡體系，即可構(gòu)成二維n×n拓撲網(wǎng)絡，用平衡常數(shù)（作用系數(shù)）Kij或Kji表示節(jié)點之間的作用關(guān)系，解釋為第i節(jié)點對第j節(jié)點的作用或第j節(jié)點對第i節(jié)點的作用（圖1）。若體內(nèi)各節(jié)點的濃度達到平衡，各節(jié)點流量的增減取決于該節(jié)點的質(zhì)量濃度和其他節(jié)點的質(zhì)量濃度，為正、負2 種作用方式的代數(shù)和，按多中心同時展開，多節(jié)點同時考慮，由此可推出生物代謝的數(shù)學量變規(guī)律，即各節(jié)點AUC∞與K乘積的代數(shù)和等于各節(jié)點成分的初始質(zhì)量濃度之和，可獲得各節(jié)點質(zhì)量濃度通解表達式為。由此可建立AUC∞、K與初始質(zhì)量濃度的n元線性方程組矩陣，經(jīng)改變各節(jié)點的濃度構(gòu)成，通過克萊姆法、逆拉氏變換等一系列計算后，即可解得矩陣系數(shù)A(K)，進一步計算即可得成分間的K[13]。

圖1 n 節(jié)點網(wǎng)絡動力學通用模型Fig.1 n Node network dynamics general model

本研究以補陽還五湯成分的網(wǎng)絡動力學研究為切入點，研究補陽還五湯成分與成分之間的作用關(guān)系，鎖定主要藥效成分，闡明中藥多成分組合的量變規(guī)律及作用強度關(guān)系，以期為包括補陽還五湯在內(nèi)的中藥復方組分優(yōu)選以及制劑制備提供理論支撐。

1 材料

1.1 動物

SPF 級SD 大鼠330 只，體質(zhì)量220～250 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號SCXK（湘）2016-0002。大鼠均飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF 級動物房，室溫25～27 ℃、相對濕度50%～70%，12 h 光照/12 h 黑暗，適應性喂養(yǎng)3 d 后開始實驗。動物實驗倫理批準號（LLBH-202110220001）。

1.2 藥材

黃芪、當歸、紅花、桃仁、赤芍、川芎、地龍飲片均購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院、益豐大藥房、老百姓大藥房、千金大藥房、養(yǎng)天和大藥房、竹海堂大藥房，共40 批次，編號BYHWT01-BYHWT40。以上藥材均由湖南中醫(yī)藥大學藥學院石繼連教授分別鑒定為豆科植物膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根、傘形科植物當歸Angelicasinensis(Oliv.) Diels 的干燥根、菊科植物紅花CarthamustinctoriusL.的干燥花、薔薇科植物山桃Prunuspersica(L.) Batsch 的干燥成熟種子、毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根、傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖、鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum(E.Perrier)的干燥體，均符合《中國藥典》2020 年版一部規(guī)定。

1.3 藥品與試劑

2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC，批號822S032）購自國藥集團化學試劑有限公司；甲醛（批號190309）購自湖南匯虹試劑有限公司；色譜甲醇（批號1863807647）購自默克股份兩合公司；色譜乙腈（批號100269）購自Brurdick&Jakson 公司；超純水為實驗室自制；青霉素鈉粉針劑購自華北制藥集團有限責任公司；EP 管、采血針、肝素鈉采血管購自瀏陽市三力醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；對照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號111920-201606）、藁本內(nèi)酯（批號111737-201608）、香草醛（批號100491-200901）、阿魏酸（批號110773-201614）、琥珀酸（批號110896-201602）、丁烯苯酞（批號101413-201601）、芒柄花素（批號111703-201504）、羥基紅花黃色素A（批號111637-201810）、苦杏仁苷（批號110820-201607）均購自中國食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分數(shù)均≥98% ； 對照品毛蕊異黃酮（ 批號Y14J8Y39707）、刺芒柄花苷（批號R28O8F46957）、胡蘿卜苷（批號P26F9F54684）、黃芪皂苷I（批號YM0328HA14 ）、異黃芪皂苷 I （ 批號C16J8G37958）、氧化芍藥苷（批號Z20A9S68312）、洋川芎內(nèi)酯H（批號P02F9F54165）、洋川芎內(nèi)酯I（批號 P02F9F54166）、洋川芎內(nèi)酯 A（批號P03J9F64872 ）、洋川芎內(nèi)酯 C （ 批號X22A9L68354）、3-羥基-9,10-二甲氧基紫檀烷（批號Y21A9H68361）均購自上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)均≥98%；其他試劑均為分析純。

1.4 儀器

LC-MS-8050 型島津三重四極桿液質(zhì)譜聯(lián)用儀（島津公司）；RE52 AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海雅榮生物設(shè)備儀器有限公司）；SHZ-DIII 型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；H1850R 型離心機（湖南湘儀公司）；PINE-TREE 型超純水制水機（北京湘順源科技有限公司）；SQP 型十萬分之一分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；移液槍（上海大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司）；2634A4 型大鼠中腦動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）栓線（北京西濃科技有限公司）。

2 方法

2.1 補陽還五湯提取液的制備

按補陽還五湯處方，取黃芪120 g，川芎12 g，當歸、紅花、赤芍、桃仁、地龍各18 g，共222 g，加入8 倍量水，浸泡30 min，回流提取2 次，每次1 h，濾過，合并2 次濾液，減壓濃縮至120 mL，使水提液質(zhì)量濃度為1.85 g/mL，共40 批次，備用。采用UPLC-MS 方法對40 批補陽還五湯水提液中主要成分進行定量分析，其主要成分為毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、芍藥內(nèi)酯苷、阿魏酸、羥基紅花黃素A、丁烯苯酞、苦杏仁苷、洋川芎內(nèi)酯H、藁本內(nèi)酯，質(zhì)量分數(shù)分別為0～3.73%、0.01%～0.57%、0～1.24%、0～6.69%、0～2.22%、1.81%～46.34%、0.02%～4.41%、0～9.09%、0.49%～2.16%、0～2.81%。

2.2 腦缺血模型的制備、分組、給藥及取材

參照改良線栓法[14]制備腦缺血模型，大鼠麻醉后固定于鼠板上，頸部消毒去毛，沿頸部中央偏左剪開，剝離肌肉層，暴露頸部后分離左側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，在頸總動脈上剪一小口，將栓線自左側(cè)頸外動脈處插入，通過頸內(nèi)動脈顱外段及頸總動脈分叉處進入頸內(nèi)動脈顱內(nèi)段，并繼續(xù)深入直到大腦中動脈分支處，剪掉多余的栓線，結(jié)扎頸總動脈，縫合傷口，灑上青霉素粉末。假手術(shù)組僅剪開皮膚和剝離血管，其余操作均相同。造模后采用Longa 5 級4 分制[14]進行神經(jīng)功能評分。無明顯神經(jīng)功能缺失癥狀，記0 分；輕微的神經(jīng)功能損傷，大鼠不能完全伸展腦缺血對側(cè)前爪，記1 分；中度局灶性神經(jīng)功能損傷，向腦缺血對側(cè)轉(zhuǎn)圈，記2 分；重度局灶性神經(jīng)功能損傷，大鼠爬行時向腦缺血對側(cè)傾倒，記3 分；無自發(fā)活動，昏迷狀，意識水平低下，記4 分。剔除得分為0、4 的大鼠，得分為1～3 的大鼠進入后續(xù)分組。

動物分為正常組、假手術(shù)組、模型組和補陽還五湯（11.1 g/kg，以生藥量計）組，補陽還五湯組分別ig 1～40 批次的藥物，且又分為給藥前組和給藥1 h 組，每組3 只，正常組、假手術(shù)組和模型組ig等體積生理鹽水。參照本課題組前期穩(wěn)態(tài)血藥濃度給藥方法[15]，造模后第2 天開始，早晚各1 次，間隔12 h。連續(xù)給藥3 天，于第7 次給藥前及給藥后1 h 分別腹主動脈取血，靜置30 min，4 000 r/min 離心15 min，取上清液，?80 ℃冷凍，備用。各組取材前參考Longa 5 級4 分制進行神經(jīng)功能評分。

2.3 補陽還五湯藥液及血漿樣品的制備

移取補陽還五湯提取液100 μL 至10 mL 量瓶中，稀釋后定容，15 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清液置于進樣小瓶中，待測。

取每組3 mL 血漿樣品混合血漿，加3 倍甲醇除蛋白，渦旋10 min 后4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清液，氮氣吹干，300 μL 甲醇復溶，待超聲完全溶解后，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min 后取上清液，裝入進樣小瓶，?20 ℃冰箱保存，待測。

2.4 含量測定

2.4.1 LC-MS/MS 條件 采用 Waters Acquity UPLC?BEH Shield RP18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～2 min，5% B；2～6 min，5%～40%B；6～10 min，40% B；10～10.1 min，40%～100%B；10.1～13 min，100% B；13～13.1 min，100%～5% B；13.1～15 min，5% B。柱溫25 ℃；體積流量0.2 mL/min；進樣量 4 μL。電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），多反應檢測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，高純氮氣為霧化器和輔助氣，氦氣為碰撞氣，離子源溫度400 ℃，離子傳輸管溫度250 ℃，接口溫度300 ℃，干燥氣體積流量10 L/min，加熱氣體積流量10 L/min，霧化氣體積流量2.7 L/min。

2.4.2 混合對照品溶液和質(zhì)量控制樣品的制備 經(jīng)對比補陽還五湯提取液、入血后成分的離子對、保留時間及分離度等，選擇補陽還五湯及血漿中的20個成分進行定量檢測及方法學考察。精密稱取琥珀酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、藁本內(nèi)酯等20 個對照品適量，用甲醇溶解制成儲備液備用。分別精密吸取各對照品的儲備液逐級稀釋，制備質(zhì)量控制樣品（琥珀酸0.16～1 600 ng/mL、苦杏仁苷0.1～1 000 ng/mL、氧化芍藥苷0.12～1 200 ng/mL、羥基紅花色素黃色素A 7.6～76 000 ng/mL、毛蕊異黃酮葡萄糖苷1.5～15 000 ng/mL、香草醛0.015～150 ng/mL、阿魏酸0.11～1 100 ng/mL、洋川芎內(nèi)酯H 0.24～2 400 ng/mL、洋川芎內(nèi)酯I 0.13～1 300 ng/mL、胡蘿卜苷0.16～1 600 ng/mL、刺芒柄花苷0.38～3 800 ng/mL、藁本內(nèi)酯1～1 000 ng/mL、毛蕊異黃酮0.14～1 400 ng/mL、黃芪皂苷I 0.19～1 900 ng/mL、異黃芪皂苷I 0.22～2 200 ng/mL、3-羥基-9,10-二甲氧基紫檀烷0.698 3～6 983 ng/mL、芒柄花素0.2～2 000 ng/mL、洋川芎內(nèi)酯A 0.36～3 600 ng/mL、洋川芎內(nèi)酯C 0.12～1 200 ng/mL、丁烯苯酞0.4～4 000 ng/mL）。

2.4.3 線性范圍 取空白血漿500 μL，分別加入500 μL 混合對照品溶液，渦旋3 min，12 000 r/min離心5 min，取500 μL 上清液，常溫下氮氣吹干，500 μL 甲醇復溶，超聲溶解，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min 后取上清液，?20 ℃冰箱保存，備用。以峰面積的對數(shù)為縱坐標（Y），質(zhì)量濃度的對數(shù)為橫坐標（X），進行線性回歸，得到琥珀酸等20 個成分的回歸方程。結(jié)果見表1，琥珀酸等20 個成分在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性回歸方程Table 1 Linear regression equations for each component

2.4.4 精密度試驗 取“2.4.2”項下制備的低、中、高質(zhì)量濃度（中間3 個質(zhì)量濃度）的混合對照品溶液，每個質(zhì)量濃度平行制備6 份，在上述色譜條件下，分別在24、48 h 內(nèi)測定。計算各成分質(zhì)量濃度并計算RSD。結(jié)果表明，日內(nèi)精密度RSD為4.22%～8.56%，日間精密度RSD 為4.57～9.16%，表明儀器精密度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 取大鼠空白血漿，加入低、中、高質(zhì)量濃度（中間3 個質(zhì)量濃度）的混合對照品溶液，按“2.4.3”項下制備樣品，每個質(zhì)量濃度平行制備6 份。分別測定制備后穩(wěn)定性（樣品制備后4 ℃保存24 h）、長期穩(wěn)定性（?20 ℃保存2 周）、凍融穩(wěn)定性（?20 ℃ 3 次凍融循環(huán)）。結(jié)果表明，在3 個質(zhì)量濃度下，20 個成分制備后穩(wěn)定性、長期穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性RSD 均小于9.83%，表明3 種不同儲存條件下樣品穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 取大鼠空白血漿，加入低、中、高質(zhì)量濃度（中間3 個質(zhì)量濃度）的混合對照品溶液，按“2.4.3”項下制備樣品，各質(zhì)量濃度平行制備6 份，按回歸方程計算各成分質(zhì)量濃度，計算相對回收率。結(jié)果表明，加樣回收率均在84.25%～108.76%，RSD 均小于3.64%，回收率良好。

2.4.7 基質(zhì)效應 取大鼠空白血漿，按“2.3”項下處理后，殘渣加入低、中、高質(zhì)量濃度（中間3 個質(zhì)量濃度）的混合對照品溶液，每個質(zhì)量濃度平行制備6 份，渦旋混勻，氮氣吹干，殘渣加入甲醇渦旋充分溶解，12 000 r/min 離心15 min，取上清液進樣分析，記錄各成分峰面積（A）。另取低、中、高質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，用甲醇代替空白血漿，每個質(zhì)量濃度平行制備6 份，按“2.3”項下處理，殘渣加入甲醇，渦旋溶解，12 000 r/min 離心15 min，取上清液進樣分析，記錄各成分峰面積（B），計算基質(zhì)效應（A/B）。結(jié)果表明，基質(zhì)效應均在77.92%～108.1%，RSD 均小于9.70%，符合要求。

2.5 平衡常數(shù)及其相似度計算

利用所測得的血漿樣品成分含量，計算出各組動物給藥達到穩(wěn)態(tài)后再一次給藥前后體內(nèi)血樣中琥珀酸、苦杏仁苷、氧化芍藥苷、羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、香草醛、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯H 等20 個入血成分的含量，計算其在1 個給藥間隔內(nèi)的藥時曲線下面積（AUC），根據(jù)網(wǎng)絡動力學平衡常數(shù)模型[13]，利用MATLAB 編程，求得系數(shù)矩陣A(K)，進一步計算得補陽還五湯成分群間的網(wǎng)絡平衡常數(shù)與平衡常數(shù)之間相似度。

3 結(jié)果

3.1 補陽還五湯中成分含量及MCAO 大鼠血漿中成分含量測定結(jié)果

補陽還五湯藥液、對照品給藥后血漿以及空白血漿總離子流圖見圖2。40 組補陽還五湯中20 個成分的含量結(jié)果見圖3，40 組補陽還五湯最后1 次給藥前后血漿中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、藁本內(nèi)酯等20 個成分的含量結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示各批補陽還五湯中所含成分數(shù)目和含量不相同，給藥后大鼠體內(nèi)的成分數(shù)目及含量也存在一定差異。這可能與中藥成分隨域、隨時、隨株變化相關(guān)，從而導致不用批次間中藥材成分含量的差異性。但其整體“印跡模板”存在相似性，即不同批次的補陽還五湯質(zhì)量穩(wěn)定，宏觀上表現(xiàn)出不同批次的藥物藥理作用相同[16]。

圖2 對照品 (A)、補陽還五湯藥液 (B)、補陽還五湯給藥后血漿樣品 (C)、空白血漿樣品 (D) 的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion flow chromatography of reference substance (A), Buyang Huanwu Decoction (B), plasma sample after administration of Buyang Huanwu Decoction(C), blank plasma sample (D)

圖3 40 組補陽還五湯藥液中20 種成分的含量歸一化比較Fig.3 Normalized comparison of 20 components in 40 groups of Buyang Huanwu Decoction

圖4 40 組補陽還五湯最后1 次給藥前后大鼠血漿中20 種成分含量歸一化比較Fig.4 Normalized comparison of 20 components in plasma of 40 groups before and after last administration of Buyang Huanwu Decoction

3.2 補陽還五湯入血成分網(wǎng)絡動力學平衡常數(shù)

補陽還五湯入血20 個成分的網(wǎng)絡動力學平衡常數(shù)見表2。平衡常數(shù)絕對值越大，成分-成分間的作用速度越快、影響越大、聯(lián)系越緊密[17]。正負表示作用的方向，作用為負，表明成分與成分之間為拮抗作用；系數(shù)為正，表明成分與成分之間為促進作用，二者可能形成了超分子[18]。根據(jù)表2 結(jié)果，以藁本內(nèi)酯為例，藁本內(nèi)酯對丁烯苯酞、洋川芎內(nèi)酯C、3-羥基-9,10-二甲氧基紫檀烷、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯I 的作用方向為正，對其他成分作用方向為負，且對洋川芎內(nèi)酯C（71.75）的正向作用強度最大，對洋川芎內(nèi)酯A（?87.95）負向作用強度最大，對阿魏酸（?3.16）的影響最小；同理可知其他成分對除此成分的作用方向與強度大小，從而解析各成分之間的作用關(guān)系。

表2 補陽還五湯入血成分網(wǎng)絡動力學平衡常數(shù)Table 2 Dynamic equilibrium constant of Buyang Huanwu Decoction in blood component network

依據(jù)平衡常數(shù)計算結(jié)果可知，產(chǎn)生正向作用的有10 個成分，按作用大小排序為異黃芪皂苷I（970.51）＞琥珀酸（934.39）＞刺芒柄花苷（916.91）＞洋川芎內(nèi)酯H（729.49）＞洋川芎內(nèi)酯I（637.18）＞香草醛（377.03）＞丁烯苯酞（273.81）＞苦杏仁苷（236.82）＞氧化芍藥苷（102.15）＞3-羥基-9,10-二甲氧基紫檀烷（52.19）；產(chǎn)生負向作用的為另外10 個成分，按作用大小排序為黃芪皂苷I（?3110.90）＞洋川芎內(nèi)酯C（?599.52）＞阿魏酸（?568.56）＞羥基紅花黃色素A（?532.92）＞藁本內(nèi)酯（?527.63）＞胡蘿卜苷（?513.75）＞洋川芎內(nèi)酯A（?139.03）＞毛蕊異黃酮（?128.45）＞芒柄花素（?117.36）＞毛蕊異黃酮葡萄糖苷（?92.06），由此可知黃芪皂苷I、異黃芪皂苷I 等對成分群間的網(wǎng)絡影響較大，推測其可能對補陽還五湯成分群的體內(nèi)過程的貢獻程度較大，在入血成分中作用最強，為主要藥效成分。這2 種成分主要來源于黃芪[19]，這也與補陽還五湯中黃芪為君藥相印證。

通過計算20 入血成分之間的相似度（圖5）發(fā)現(xiàn)，各成分之間的相似度均較小，說明各成分在體內(nèi)代謝速度不近相似，表明成分與機體作用的方式與路徑存在一定差別。

圖5 20 個成分間網(wǎng)絡動力學平衡常數(shù)相似度Fig.5 Similarity of network dynamics equilibrium constants between 20 components

4 討論

補陽還五湯是目前廣泛用于治療缺血性心腦血管疾病和腦卒中致殘的中藥復方制劑[20]，其藥理、藥效和質(zhì)量標準已有較多的研究和報道。補陽還五湯作為一種中藥復方制劑，其進入體內(nèi)后發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)有可能是藥物原型、代謝產(chǎn)物[21]，甚至是藥物成分彼此之間形成成分簇的巨復分子體[22]。目前對于中藥復方物質(zhì)基礎(chǔ)的理論研究集中于網(wǎng)絡藥理學研究，實驗研究集中于藥效成分分析、藥效組分分析或代謝物分析[23]，將2 種方法結(jié)合起來即可有效闡明中藥復方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。但這2 種方法都忽略了中藥成分進入體內(nèi)后由于結(jié)構(gòu)相似或藥效基團碰撞、藥效成分吸收與消除等作用的動力學過程。同時，中藥復方相較于單成分化學藥的優(yōu)點就在于配伍用藥，利用不同藥味之間的君臣佐使、升降浮沉性質(zhì)，但整方藥研究起來難度大，化學成分多，各物質(zhì)成分含量差異大，體內(nèi)外活性成分不一致，難以確定真正的藥效物質(zhì)成分，且單一活性成分難以體現(xiàn)中藥復方用藥內(nèi)涵，極大地限制了中藥復方的發(fā)展。

本課題組負責人構(gòu)建的超分子“印跡模板”網(wǎng)絡動力學平衡常數(shù)模型即可解決這一問題，獲得復方各成分之間效應作用大小、活度系數(shù)正負號等，從而獲得各成分的作用強度、作用和反作用方向、單位作用能力等表征藥物效應體系作用程度的參數(shù)，解析各成分作用強度關(guān)系，揭示成分之間量-量作用關(guān)系，反映印跡作用強弱，確定成分之間的“君臣佐使”作用關(guān)系[22]。但需注意的是中藥各成分中效應系數(shù)大者不一定代謝時間長，代謝時間長者不一定效應系數(shù)大，整體效應應向代謝時間長且效應系數(shù)大者靠近。

本研究通過建立的網(wǎng)絡動力學數(shù)學模型，計算出補陽還五湯中20 個成分的網(wǎng)絡動力學平衡常數(shù)，確定黃芪皂苷I、異黃芪皂苷I、琥珀酸、刺芒柄花苷、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯C、阿魏酸、羥基紅花色素A 等為補陽還五湯復方中作用強度最大的幾種成分，其中黃芪皂苷I、異黃芪皂苷I、刺芒柄花苷主要來源于黃芪，琥珀酸來源于地龍，但目前未見這幾種外源性成分的藥理作用研究。其中內(nèi)源性琥珀酸作為琥珀酸脫氫酶的底物，在維持細胞結(jié)構(gòu)完整性方面發(fā)揮作用。研究表明，TP53誘導的糖酵解調(diào)節(jié)磷酸酶（TP53-induced glycolysis regulatory phosphatase，TIGAR）可通過調(diào)控琥珀酸脫氫酶從而上調(diào)琥珀酸，對神經(jīng)元中線粒體功能產(chǎn)生保護作用，減輕腦損傷[24]。洋川芎內(nèi)酯H、I、C來源于當歸和川芎，研究表明洋川芎內(nèi)酯H 可通過激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路，抑制核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的表達，從而減少神經(jīng)細胞凋亡[25]；洋川芎內(nèi)酯I可能通過激活環(huán)腺苷酸反應元件結(jié)合蛋白（cyclic-AMP response binding protein，CREB）通路，增加糖氧剝奪/復氧大鼠腦皮層神經(jīng)元細胞線粒體電勢，調(diào)控活性氧和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的生成，抑制腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β 等炎癥因子的表達及NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）磷酸化，從而保護神經(jīng)元細胞[26-27]。阿魏酸來源于當歸和川芎，可通過抑制NF-κB p65 核轉(zhuǎn)位減輕缺血再灌注大鼠腦神經(jīng)細胞炎癥反應，抑制 p38 MAPK 通路，保護星形膠質(zhì)細胞，維持腦部正常形態(tài)[28-29]。羥基紅花色素A 作為紅花的主要藥理活性成分之一，可對腦缺血大鼠發(fā)揮抗炎、抗氧化、維持血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能完整性的作用[30-31]。

同時，補陽還五湯中的大部分化學成分由于結(jié)構(gòu)單位過大以及脂溶性過低等特性而難以透過正常環(huán)境下的血腦屏障，但其中的一些小分子物質(zhì)，如綠原酸、芒柄花素、羥基紅花色素A 等可透過正常環(huán)境下的血腦屏障，且當使用芳香開竅藥冰片時，又可引藥上行，增加其在腦組織內(nèi)的濃度，增強治療效果[32-33]。也有研究表明活血行氣藥川芎可促進芍藥苷、松果菊苷、天麻素等苷類物質(zhì)進入血腦屏障，這可能與川芎中藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯I 等藥理活性物質(zhì)抑制P-糖蛋白、多藥耐藥蛋白1 表達有關(guān)[34]。

本研究通過對網(wǎng)絡動力學關(guān)鍵問題的深入分析，闡明中藥成分之間復雜關(guān)系以及化學成分對藥效作用貢獻的大小，將會對中藥的有效性、安全性和新藥研究等，對推動中藥國際化、科學化和標準化產(chǎn)生重大影響。網(wǎng)絡動力學方法不僅為中藥復方關(guān)鍵成分群篩選、多成分配伍用藥與復方藥味加減提供可測可算的實驗方法與依據(jù)，也為下一步進行體內(nèi)超分子成分群與靶點群網(wǎng)絡動力學研究與實驗結(jié)果驗證奠定基礎(chǔ)，同時給中藥復方的數(shù)字化、現(xiàn)代化研究提供新方法。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突