整合生物信息學與實驗驗證解析黃芪-莪術藥對抗肝癌配伍機制

鮑 寧 ，陳子超，劉名玉，趙春芹，李 肖*，張 振*

1.山東中醫藥大學 中醫藥創新研究院，山東 濟南 250355

2.山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355

3.山東中醫藥大學 實驗中心，山東 濟南 250355

原發性肝癌是我國第4 位常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因，其中約90%為肝細胞癌[1]。肝癌的發生、發展機制復雜，涉及多個原癌基因以及信號通路[2]。近年來，中藥在肝癌的預防、控制轉移與復發等方面所具有的優勢，使其成為抗肝癌新藥研發的熱點和方向[3-5]。目前中醫藥界對于肝癌的理論及治療研究逐漸增多，并形成了較為統一的認識，其病機在于氣虛血瘀，其治法以益氣活血為主[6]。黃芪-莪術是益氣活血法代表性藥對，源于張錫純所著《醫學衷中參西錄》中的理沖湯，主治氣虛血瘀證[7]。從中醫理論講，黃芪味甘性微溫，可補氣升陽，為“補中益氣之要藥”[8]；莪術辛散苦泄，能破血散瘀，又能行氣化積，是“破血化瘀之重藥”[9]；兩藥配伍使用“破中有補，補中有行，相得益彰”從而達到“補而不滯”之效，為益氣活血配伍的典型代表[10]。孫桂芝教授擅用桃紅芪術軟肝煎起益氣活血之效，認為黃芪-莪術配伍治療肝癌時能夠補脾胃、破癥消積，對肝癌有很好的抑制作用，在臨床實踐中運用此法與化療聯合使用，能夠明顯改善肝癌患者的生存質量，在提高肝癌遠期療效上具有一定優勢[11-13]。黃芪-莪術藥對配伍治療肝癌的作用確切，在抗肝癌中藥中具有重要地位，但是黃芪-莪術藥對抗肝癌的配伍機制尚不明確。本研究整合生物信息學與網絡藥理學預測黃芪-莪術藥對治療肝癌的相關靶點和通路，將篩選得到的核心成分與靶點進行分子對接，探究黃芪-莪術藥對的多成分、多靶點、多通路的配伍協同作用機制，并采用體外細胞實驗對核心成分和靶點進行驗證。系統研究黃芪-莪術藥對抗肝癌配伍機制，不僅可為含有該藥對的抗肝癌系列類方的研究提供參考，而且有利于指導中醫臨床的合理用藥，同時為該類方的質量控制和新藥研發提供重要的科學依據，為肝癌這一發病率日趨升高、嚴重威脅人類健康的重大疑難疾病治療做出貢獻。

1 材料

1.1 細胞株

人肝癌HepG2 細胞、人正常LO2 肝細胞購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥品與試劑

DMEM 高糖培養基（批號G4511-500ML）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號GC203002-100ml）購自武漢塞維爾生物科技有限公司；胰蛋白酶（批號C0208-500ml）、RIPA 強裂解液（批號P0013B）、MTT（批號ST316）購自上海碧云天生物科技有限公司；黃芪皂苷II（批號SJMN1426）、黃芪甲苷（批號SJ-MN0659）、芒柄花素（批號SJ-MN0281）、姜黃素（批號SJ-MN0060）、莪術醇（批號SJ-MN0198）、雙去甲氧基姜黃素（批號SJ-MN1811）購自山東思科捷生物技術有限公司，質量分數均≥98%；細胞周期蛋白依賴性激酶1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）抗體（批號db12527）、細胞周期蛋白B1（cyclin B1，CCNB1）抗體（批號db13323）購自杭州戴格生物技術有限公司；β-actin 抗體（批號PTG81115-1-RR）購自武漢三鷹生物技術有限公司；HRP 標記的山羊抗兔單克隆抗體（批號AS014）購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.3 儀器

BB150 型CO2細胞恒溫培養箱、NanoDrop?Lite 微量分光光度計、Multiskan SkyHigh 全波長酶標儀號（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；電泳儀、ChemiDoc XRS＋凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司）；Centrifuge 5425R 型低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司）；Accuri C6 Plus 型流式細胞儀（美國BD 公司）。

2 方法

2.1 生物信息學分析

2.1.1 肝癌靶點篩選 以“ hepatocellular carcinoma”為關鍵詞在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）GEO 數據庫中檢索并下載與肝癌相關的GSE57957[14]、GSE60502[15]、GSE84402[16]基因表達譜，芯片平臺分別為 GPL10558、GPL96[HGU133A]、GPL570[HG-U133_Plus_2]，共收集142（78、36、28）例樣本，其中肝癌組織樣本71（39、18、14）例，癌旁組織樣本71（39、18、14）例。將以上3 個基因表達譜通過歸一化和基于log2轉化進行定量，之后使用R 軟件包stats（version 3.6.0）進行主成分分析（principal component analysis，PCA）[17]，同時使用R 軟件包“Limma”包[18]（version 3.40.6）進行差異表達基因（differential expression genes，DEGs）篩選，篩選條件為|log2FC|＞1[FC 表示倍數變化（fold change）]和P值＜0.05，將3 組數據集篩選得到的DEGs 合并，作為肝癌靶點。

2.1.2 肝癌關鍵靶點篩選 通過STRING（https://cn.string-db.org/）數據庫對“2.1.1”項下肝癌靶點進行分析，設置物種為“Homo sapiens”，所有參數選擇默認值，導出tsv 格式的數據并輸入到Cytoscape（version 3.9.1）軟件中構建蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡，然后利用MCODE 插件對PPI 網絡中聯系緊密的功能模塊進行分析，分析條件為“Degree Cutoff＝2、Node Score Cutoff＝0.2、k-Core＝2、Max.Depth＝100”。將得分最高的功能模塊的子網中所含靶點作為肝癌關鍵靶點[19]。

2.1.3 黃芪、莪術化學成分收集及潛在活性成分篩選 在TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）數據庫中對黃芪、莪術成分進行檢索；將人體口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18 的成分作為潛在活性成分，并結合文獻報道，將具有體內外抗癌活性的黃芪、莪術成分補充到潛在活性成分中[20-21]。

2.1.4 黃芪、莪術活性成分靶點預測與抗肝癌靶點篩選 在PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中檢索“2.1.3”項下活性成分的Isomeric SMILES 數據，將該數據輸入SEA（http://sea.bkslab.org/）和 SwissTargetPrediction（http://www.swiss targetprediction.ch/）2 個數據庫，預測成分靶點，與TCMSP 數據庫中的靶點取并集得到潛在活性成分作用靶點，并在Uniprot 數據庫中對靶點基因名稱進行校正，使蛋白質靶點信息標準化[22]。將成分作用靶點與“2.1.1”項下所篩選肝癌靶點取交集，得到黃芪、莪術抗肝癌靶點。

2.1.5 黃芪、莪術抗肝癌關鍵成分篩選 將“2.1.4”項下潛在活性成分靶點與“2.1.2”項下所篩選肝癌關鍵靶點取交集，采取疾病關鍵靶點“反向鉤釣”關鍵潛在活性成分的方式，得到黃芪、莪術抗肝癌關鍵成分及其靶點。

2.1.6 黃芪、莪術抗肝癌靶點及關鍵靶點京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 通過KEGG rest API（https://www.kegg.jp/kegg/rest/keggapi.html）獲取最新KEGG 通路基因注釋，使用R 軟件包cluster Profiler（version 3.14.3）進行富集分析，設定閾值最小基因集為5、最大基因集為5 000、P＜0.05、FDR＜0.1，根據包含靶點數量篩選排名靠前的KEGG 富集信息[23]。

2.1.7 拓撲網絡構建與分析 采用 Cytoscape（version 3.9.1）軟件構建肝癌關鍵靶點的PPI 網絡、成分-靶點網絡、關鍵成分-靶點-通路網絡。通過Network Analyzer 插件對關鍵成分-靶點-通路網絡的拓撲性質進行分析，獲取成分、靶點、通路相關介數值。

2.1.8 黃芪、莪術抗肝癌核心成分及其抗肝癌核心靶點篩選 通過1 種網絡貢獻指數（CI）評價黃芪-莪術抗肝癌成分發揮抗肝癌作用的貢獻大小[24]。

i為成分的數量；j為靶點的數量；ωei為網絡節點參數；Aij為根據ωei值確定的親和力指數；CAi為黃芪關鍵成分-靶點-通路網絡中每種抗肝癌成分的介數；CBi為莪術關鍵成分-靶點-通路網絡中每種抗肝癌成分的介數，Ci為每種抗肝癌成分的介數；Pj為每種靶點的介數，以參數由關鍵成分-靶點-通路網絡中獲得；NEi為網絡中1 種抗肝癌成分的網絡貢獻；CI 為抗肝癌成分發揮抗肝癌作用的貢獻大小

以“hepatocellular carcinoma”和“liver cancer”及活性成分的常用名稱用作為關鍵詞，檢索1990—2018 年出版于PubMed 和CNKI 數據庫中的相關文獻。如果前N個成分的CI 總和超過50%，則認為這些相關的N個成分對黃芪和莪術發揮抗肝癌作用的貢獻最大；CI 總和超過90%，則認為這些相關的N個成分對黃芪和莪術發揮抗肝癌作用的貢獻最主要。核心成分在關鍵成分-靶點-通路網絡中所調節的介數大于5 的靶點為抗肝癌核心靶點。

2.1.9 黃芪、莪術抗肝癌核心成分與靶點分子對接驗證 在PubChem 數據庫中獲得化合物的SDF 文件，然后通過Open Babel 3.1.1 軟件將獲得的SDF 文件轉化為MOL2 格式；從AlphaFold 蛋白質結構數據庫（AlphaFold Protein Structure Database，https://alphafold.ebi.ac.uk/）獲取抗肝癌核心靶點的PDB 文件；靶蛋白與化合物均使用Auto Dock Tools1.5.6 去除水分子、加氫、計算電荷等前處理，轉化為PDBQT格式；利用Autodock Vina 1.1.2 軟件進行分子對接，分子對接的結合能越低表示構象越穩定，對結果進行分析，繪制分子對接結合能熱圖[21]。

2.1.10 核心基因在腫瘤及正常組織表達量差異分析 在癌癥基因組圖譜（cancer genome atlas，TCGA）網站中得到核心基因在腫瘤組織及正常組織中的表達量，進行差異表達分析[25]。

2.2 細胞實驗驗證

2.2.1 MTT 實驗 將處于對數生長期的HepG2 和LO2 細胞分別以5 000 個/孔接種到96 孔板中，培養24 h 后，分別給予不同濃度的黃芪皂苷II、黃芪甲苷、芒柄花素、莪術醇、姜黃素、雙去甲氧基姜黃素，對照組加入不含藥物的培養基，同時設置調零孔（不接種細胞），處理24、48、72 h，處理后每孔加入10 μL MTT（5 mg/mL），37 ℃孵育4 h；去上清，加入100 μL DMSO 終止孵育，使用酶標儀測定570 nm 處的吸光度（A）值，計算細胞存活率。

細胞存活率＝(A給藥－A調零)/(A對照－A調零)

2.2.2 藥物協同作用研究 根據“2.2.1”項結果，從黃芪、莪術各成分中各選1 個作用效果最佳的單體，進行藥物協同作用研究。細胞存活率的結果通過Chou-Talalay 模型進行分析，以評價黃芪-莪術成分配伍的協同作用，明確最佳協同劑量，CompuSyn軟件采用Chou-Talalay 模型計算藥物組合的組合指數，組合指數＝1 為加和效應，組合指數＜1 為協同作用，組合指數＞1 為拮抗作用[24]。

2.2.3 流式細胞術檢測細胞周期 將HepG2 細胞以2.5×105個/孔接種于6 孔板中，培養24 h 后分別給予黃芪皂苷II（5 μmol/L）、雙去甲氧基姜黃素（5 μmol/L）及黃芪皂苷II（2.5 μmol/L）＋雙去甲氧基姜黃素（2.5 μmol/L），以不含藥液的培養基作為對照，處理24 h 后收集細胞，細胞密度調整為1×106個/mL，用預冷的PBS 洗滌2 次，然后加入500 μL預冷的70%乙醇固定，?4 ℃過夜，細胞離心后在沉淀中加入100 μL RNaseA 溶液，37 ℃孵育30 min，加入400 μL 碘化丙啶（PI）染色液，于4 ℃避光孵育30 min 后上機檢測[26]。

2.2.4 Western blotting 法檢測蛋白表達 選擇“2.2.2”項單體對應的靶點在Pymol 軟件中進行分子對接可視化，并通過Western blotting 實驗驗證單體對蛋白表達的影響。分組與給藥同“2.2.3”項，收集藥物作用后的HepG2 細胞，加入細胞裂解液提取總蛋白，使用Nanodrop lite 檢測蛋白濃度，蛋白樣品經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜，經5%脫脂奶粉封閉后，加入一抗，4 ℃孵育過夜；加入二抗，37 ℃孵育2 h，使用ECL 化學發光試劑盒顯影，采用Image J 軟件分析條帶灰度值。

2.2.5 統計學分析 數據使用Graphpad Prism 9.5軟件處理，采用單因素方差分析進行組間統計。

3 結果

3.1 肝癌靶點及關鍵肝癌靶點

對GSE57957、GSE60502、GSE84402 肝癌基因表達數據進行PCA，結果顯示在3 個數據集中，肝癌組織與癌旁組織基因表達均能明顯區分（圖1-A～C）；進一步Limma 分析，結果顯示在3 組數據中DEGs 分別有353 個（上調85 個，下調268 個）、1 241 個（上調575 個，下調666 個）、1 689 個（上調1 031 個，下調658 個，圖1-D～F）；將以上3 組數據中的DEGs 取并集，共得到肝癌靶點2 766 個（圖1-G）；進一步疾病關鍵靶點分析，結果顯示PPI網絡中得分最大為97.33 的MCODE 功能模塊所含有的112 個靶點為肝癌關鍵靶點（圖1-H）。

3.2 黃芪、莪術活性成分及其抗肝癌靶點和KEGG通路

通過檢索TCMIP 數據庫，得到黃芪化學成分87 種，經篩選潛在活性成分26 種，其中OB≥30%、DL≥0.18 的成分20 種（AR-1～AR-20），通過文獻補充的成分6 種（AR-21～AR-26）；得到莪術化學成分81 種，經篩選潛在活性成分13 種，其中OB≥30%、DL≥0.18 的成分3 種（CR-1～CR-3），通過文獻補充的成分10 種（CR-4～CR-13），黃芪與莪術共有成分1 種（常春藤皂苷元），共得到黃芪-莪術藥對潛在活性成分38 種（表1）。

采用TCMSP、SEA、SwisstargetPrediction 數據庫預測得到38 種潛在活性成分靶點1 177 個，與“3.1”項下2 766 個肝癌靶點取交集，得到黃芪-莪術抗肝癌活性成分33 個，其中黃芪22 個（無AR-7、AR-13、AR-15、AR-20），莪術12 個（無CR-9），兩者共有成分1 個（AR-3、CR-1），對應抗肝癌靶點180 個，其中黃芪獨有靶點77 個、莪術獨有靶點14 個、兩者共有靶點89 個（圖2-A）。

圖2 黃芪-莪術抗肝癌成分-靶點網絡 (A) 和KEGG 富集分析 (B)Fig.2 Anti-hepatocellular carcinoma component of Astragali Radix-Curcumae Rhizoma-target network (A) and KEGGenrichment analysis (B)

分別對黃芪166 個靶點、莪術103 個靶點進行KEGG 富集分析，根據包含靶點數量篩選排名前20的通路，結果顯示，黃芪與莪術所調節的20 條通路中，共有通路有9 條；其中黃芪中排名前5 位的通路分別為代謝途徑、癌癥的通路、神經活性配體-受體相互作用、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路、細胞周期，莪術中排名前5 位的通路分別為代謝途徑、癌癥的通路、類固醇激素生物合成、膽汁分泌、化學致癌（圖2-B）。

3.3 黃芪、莪術抗肝癌關鍵成分及其靶點和KEGG通路

通過肝癌關鍵靶點進行“反向鉤釣”，得到黃芪-莪術抗肝癌關鍵成分29 種，其中黃芪抗肝癌關鍵成分22 種、莪術抗肝癌關鍵成分8 種，兩者共有抗肝癌關鍵成分1 種（常春藤皂苷元，圖3-A）。29 種黃芪-莪術抗肝癌關鍵成分所調節抗肝癌關鍵靶點15 個，對以上靶點進行KEGG 富集分析，共得到17 條通路，其中最為重要的細胞過程包含細胞周期、細胞衰老、p53 信號通路、卵母細胞減數分裂、細胞凋亡-多個物種共5 條信號通路（圖3-B）。

圖3 黃芪-莪術抗肝癌關鍵成分-靶點-通路網絡 (A) 和KEGG 富集分析 (B)Fig.3 Key component of Astragali Radix-Curcumae Rhizoma against hepatocellular carcinoma-target-pathway network (A)and KEGG enrichment analysis (B)

3.4 黃芪、莪術抗肝癌核心成分和靶點的分子對接

通過網絡貢獻指數模型，計算黃芪-莪術抗肝癌29 種關鍵成分的抗肝癌作用貢獻指數。根據計算結果，CI 值合計為55.67%的前6 種成分均為黃芪成分，表明其抗腫瘤作用貢獻最大；CI 值合計為90.64%的前17 種成分中莪術成分有2 種，在一定程度上表明黃芪-莪術配伍發揮協同抗腫瘤作用（圖4-A）。根據成分CI 值及其所在中藥中的相對特異性，選取黃芪中的黃芪皂苷II、黃芪甲苷、芒柄花素與莪術中的莪術醇、姜黃素、雙去甲氧基姜黃素共6 種成分作為黃芪-莪術藥對的核心代表性成分，與之相對應的 CDK1、DNA 拓撲異構酶 2A（topoisomerase 2A，TOP2A）、極光激酶B（aurora B，AURKB）、檢查點蛋白激酶1（check point kinase 1，CHEK1）、AURKA 共5 個靶點為核心靶點。對分子對接得分進行熱圖分析，結果顯示CDK1 與這6 個核心成分均有較好的結合活性（結合能均＜?5 kJ/moL，圖4-B）。將上述5 個靶點在腫瘤組織與正常組織之間的表達量差異進行分析，結果顯示以上5 個靶點在肝癌組織及正常組織中的表達均有較大差異（圖4-C）。

圖4 黃芪-莪術抗肝癌關鍵成分貢獻指數圖 (A)、分子對接得分熱圖 (B)、正常組織和腫瘤組織核心靶點基因表達 (C)Fig.4 Contribution index plot of key components of Astragali Radix-Curcumae Rhizoma against hepatocellular (A),molecular docking score heat map (B), gene expressions of core targets between normal and tumor tissues (C)

3.5 黃芪、莪術活性成分對HepG2 細胞增殖的抑制作用

如圖5 所示，不同濃度的黃芪皂苷II、黃芪甲苷、芒柄花素、姜黃素、莪術醇、雙去甲氧基姜黃素對HepG2 細胞均有一定的抑制作用，且呈劑量相關性，應用Graphpad Prism 9.5 軟件計算各單體作用于HepG2 細胞 24 h 的半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）分別為黃芪皂苷II 12.22 μmol/L、芒柄花素34.03 μmol/L、黃芪甲苷223.9 μmol/L、雙去甲氧基姜黃素9.797 μmol/L、姜黃素46.31 μmol/L、莪術醇206.7 μmol/L。黃芪甲苷（0～25 μmol/L）、黃芪皂苷II（0～20 μmol/L）、芒柄花素（0～20 μmol/L）、姜黃素（0～20 μmol/L）、雙去甲氧基姜黃素（0～20 μmol/L）、莪術醇（0～50 μmol/L）在一定的濃度范圍內對LO2 細胞活性幾乎無影響。

圖5 黃芪-莪術藥對活性成分對HepG2 (A) 及LO2 (B) 細胞活性的影響 (±s, n = 3)Fig.5 Effect of active ingredients of Astragali Radix-Curcumae Rhizoma herb pair on viability of HepG2 (A) and LO2 (B)cells (±s , n = 3)

3.6 藥物協同作用研究

為了評價黃芪-莪術藥對成分配伍的體外抗腫瘤協同作用，選擇雙去甲氧基姜黃素和黃芪皂苷II進行協同作用研究，通過Chou-Talalay 數學模型進行協同作用效果評價[27]。結果如圖6 所示，與單獨藥物作用相比，聯合組的細胞活力顯著降低（P＜0.05、0.01）。為了查明該組合是否起到加和作用或協同作用，使用CompuSyn 軟件進一步分析細胞活性數據，結果表明各濃度的雙去甲氧基姜黃素和黃芪皂苷II 在中位有效劑量（組合指數＜1）時均表現出協同作用，其最佳協同劑量為0.625 μmol/L 黃芪皂苷II 和0.625 μmol/L 雙去甲氧基姜黃素。

圖6 雙去甲氧基姜黃素和黃芪皂苷II 的協同抗肝癌作用 (±s, n = 3)Fig.6 Synergistic anti-hepatocellular carcinoma effect of bisdemethoxycurcumin and astragaloside II (±s, n = 3)

3.7 雙去甲氧基姜黃素與黃芪皂苷II 對Hep G2 細胞周期的影響

細胞周期檢測結果顯示，黃芪皂苷II（5 μmol/L）和雙去甲氧基姜黃素（5 μmol/L）以及聯合給藥（黃芪皂苷 II 2.5 μmol/L＋雙去甲氧基姜黃素 2.5 μmol/L）處理HepG2 細胞24 h 后可導致細胞周期異常。如圖7 所示，與對照組比較，不同組別藥物處理HepG2 細胞24 h 后，各組G2/M 期的細胞比例均升高。與單用黃芪皂苷II 和雙去甲氧基姜黃素組相比，聯合組G2/M 期細胞比例顯著升高（P＜0.01），上述結果提示黃芪皂苷II 與雙去甲氧基姜黃素均能誘導HepG2 細胞周期停滯于G2/M 期，且聯用效果更佳（P＜0.01）。

圖7 雙去甲氧基姜黃素、黃芪皂苷II 以及聯合組對HepG2 細胞周期的影響 (±s , n = 3)Fig.7 Effect of bisdemethoxycurcumin, astragaloside II and combination group on cycle of HepG2 cells (±s , n = 3)

3.8 分子對接及Western blotting 法檢測蛋白表達

利用Pymol 軟件將“3.4”項的黃芪皂苷II、雙去甲氧基姜黃素與CDK1 的對接情況進行可視化，結果如圖8-A 所示，黃芪皂苷II 與CDK1 結合能力較強，分別在ASP-92、GLN-132、THR-14 形成H 鍵，結合能為?6.27 kJ/mol；雙去甲氧基姜黃素與CDK1結合能力較強，分別在THR-14、THR-47 形成H 鍵，結合能為?7.04 kJ/mol。蛋白表達結果顯示，黃芪皂苷II（5 μmol/L）組、雙去甲氧基姜黃素（5 μmol/L）組以及聯合組細胞CDK1 和CCNB1 蛋白表達水平均顯著低于對照組（P＜0.05、0.01），且聯合組效果較單藥組顯著（P＜0.05、0.01，圖8-B）。

圖8 雙去甲氧基姜黃素、黃芪皂苷II 與CDK1 的分子對接 (A) 和雙去甲氧基姜黃素、黃芪皂苷II 以及聯合組對HepG2細胞周期蛋白表達 (B) 的影響 (±s , n = 3)Fig.8 Docking of bisdemethoxycurcumin and astragaloside II to CDK1 (A), effect of bisdemethoxycurcumin, astragaloside II and combination group on cyclin protein expressions (B) in HepG2 cells (±s , n = 3)

4 討論

古今醫家多認為正氣虧虛為肝癌的發病內因和前提，瘀血凝滯是肝癌發病的基本病理因素，正氣不足、瘀血阻滯始終伴隨著肝癌的發生、發展和轉移[28]。因此臨床治療肝癌常將黃芪、莪術等益氣藥與活血藥配伍使用，不僅可輔助正氣，同時能行氣活血，兩者兼顧，共湊扶正祛邪之效[11-13,29-30]。

本研究利用生物信息學結合網絡藥理學與分子對接技術探究黃芪-莪術藥對治療肝癌的活性成分、潛在靶點和信號通路，進而揭示其配伍機制。結果顯示，黃芪-莪術抗肝癌活性成分33 種，其中黃芪22 種、莪術12 種、兩者共有成分1 種；對應抗肝癌靶點180 個，其中黃芪調節77 個、莪術調節14個、兩者共同調節89 個；KEGG 通路富集分析顯示黃芪-莪術藥對調節抗肝癌通路31 條，其中黃芪調節20 條、莪術調節20 條、共同調節9 條。以上結果從成分、靶點、通路3 個方面揭示了黃芪、莪術配伍協同抗肝癌的科學內涵。

KEGG 通路結果顯示黃芪-莪術藥對主要通過細胞周期、細胞衰老、p53 信號通路、細胞凋亡、代謝通路等發揮抗肝癌作用。其中細胞周期、p53 信號通路是與腫瘤發生發展密切相關的信號通路，在調控肝癌細胞周期、增殖、凋亡、細胞代謝等行為上發揮重要作用。p53 作為一種轉錄因子，通過調節其下游基因的表達來調控細胞周期阻滯、細胞衰老、DNA 修復和細胞凋亡等過程，p53 缺失不僅會引起細胞分裂的增加和細胞存活率的提高，還會引起更具侵襲性的行為和基因組不穩定性的增加[31]。p53 下游靶蛋白p21 和CDK2 調控細胞周期的進行，CDK2 與CCNA、CCNE 相互作用可使Rb 蛋白磷酸化，從而促進細胞從G1期進入S 期，p21 可以抑制其相互作用從而抑制細胞周期進程[32-33]。

經篩選得到的6 個核心成分（黃芪甲苷、黃芪皂苷II、芒柄花素、姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、莪術醇），均具有不同程度的抗腫瘤作用，其調控的5 個核心基因（CDK1、CHEK1、TOP2A、AURKA、AURKB），在腫瘤發生發展過程中同樣具有重要的調控作用。研究表明，AURK 是一類絲/蘇氨酸激酶，可以通過干擾中心體、紡錘體以及染色體的功能影響細胞的有絲分裂，AURKA 調節有絲分裂早期中心體成熟，參與建立雙極紡錘體，其功能的有效發揮離不開周期蛋白B 與CDK 復合物（cyclin BCDK1）的正常作用，活化的cyclin B-CDK1 可以使蛋白磷酸酶1（protein phosphatase 1，PP1）失活，PP1 可以抑制AURKA 活性[34]。CDK1 是調控細胞周期的關鍵蛋白，CHEK1 為調控CDK 蛋白的上游蛋白，CHEK1 的磷酸化能夠導致細胞分裂周期因子25A/C（cell division cyclin 25A/C，CDC25A/C）的磷酸化失活，從而抑制CDK1 進入有絲分裂G2/M期[35]。分子對接結果顯示核心成分（黃芪甲苷、黃芪皂苷II、芒柄花素、姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、莪術醇）與核心靶點（CDK1、CHEK1、TOP2A、AURKB、AURKA）結合能較強，可能存在較好的結合活性。研究發現，芒柄花素通過環氧合酶-2/CCND 軸將人肝癌Bel-7402 細胞和HepG2 細胞阻滯于G0/G1期[36-37]；莪術醇可以阻滯HepG2 細胞于G1期[38]；黃芪甲苷能夠上調具有低轉移潛能和高轉移潛能的人肝癌Huh7 細胞和人肝癌MHCC97-H 細胞中E-鈣黏蛋白的蛋白水平并促進其在細胞膜上積累，使得細胞間連接更加緊密從而降低轉移擴散能力；姜黃素能夠通過激活Huh7 細胞內死亡受體介導的通路誘導凋亡[39]；且黃芪甲苷與姜黃素聯用對血管生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、基質金屬蛋白酶2（matrix metallopeptidase 2，MMP2）、成纖維細胞生長因子-2（fibroblast growth factor-2，FGF-2）、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）以及血栓形成相關因子組織因子（tissue factor，TF）和凝血因子VII 有協同抑制作用[40]。

通過體外細胞實驗驗證了黃芪-莪術藥對6 個核心成分對HepG2 細胞的增殖均具有明顯的抑制作用。協同作用分析結果顯示，黃芪中的黃芪皂苷II 和莪術中的雙去甲氧基姜黃素配伍有協同作用，其最佳協同劑量為黃芪皂苷II 0.625 μmol/L、雙去甲氧基姜黃素0.625 μmol/L。2 個成分配伍使用可協同增效抑制周期調控蛋白CDK1 和CCNB1 的表達，進而誘導HepG2 細胞停滯于G2/M 期。

本研究基于生物信息學數據，結合網絡藥理學方法與分子對接技術及細胞實驗證明了黃芪、莪術配伍能夠通過多成分、多靶點、多通路在肝癌治療中發揮協同作用，為更準確尋找、確認和優化黃芪、莪術發揮抗肝癌效應的有效成分與靶點的作用，推動臨床應用提供新的見解。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突