基于斑馬魚模型的補骨脂不同炮制品水提物急性毒性及肝毒性差異比較

趙竟成，李治建, ，霍仕霞, ，祖力皮卡爾·吾斯曼，鐘雅韻，張數數，高姝燕，麥麗克姆·麥圖如孜，張 云,

1.新疆醫科大學藥學院，新疆 烏魯木齊 830011

2.新疆維吾爾自治區維吾爾醫醫院，新疆 烏魯木齊 830049

3.齊魯工業大學（山東省科學院），山東省科學院生物研究所，山東 濟南 250103

4.山東省人類疾病斑馬魚模型與藥物篩選工程技術研究中心，山東 濟南 250103

補骨脂是豆科植物補骨脂PsoraleacorylifoliaL.的干燥成熟果實，在我國被廣泛用作補益中藥，《中國藥典》2020 年版中有63 種含補骨脂的成方制劑[1]。然而近年來，越來越多的研究報道了補骨脂的不良反應，尤其是肝損害[2-5]。國家藥品監督管理局先后通報了補骨脂及部分制劑致肝損傷的風險。古代本草認為制補骨脂有毒，通過炮制可降低其毒性。歷代醫籍和本草記載了多種補骨脂炮制方法[6]。補骨脂的炮制方法始載于《雷公炮灸論》：“凡使，性本大燥，毒，用酒浸一宿后，漉出，卻用東流水浸三日夜，卻，蒸，從巳至申，出，日干用”，宋代《證類本草》記載：“補骨脂一斤，酒浸一宿，放干，卻用烏油麻一斤和炒，令麻子聲絕，即播去，只取補骨脂，為末”[7]。又如宋代《圣濟總錄》記載：“炒令黃焦”[8]。另從古至今記載有藥汁制、童便制、焙制等炮制方法[9]，《壽世保元》并參考《中國藥典》鹽炙法，維吾爾醫也常用鹽炙法炮制補骨脂[10]。不同炮制法對補骨脂減毒效果的影響尚缺少系統的比較和研究[11]。斑馬魚近年來已成為用于藥物活性篩選和安全性評價的新興模式動物[12]。斑馬魚繁殖速度快、產卵數量高，胚胎和個體較小，通體透明且發育迅速，通常從受試物在斑馬魚上進行暴露到完成評價實驗僅需3 d 左右，可開展實驗室條件下短周期低成本的多樣本快速評價。轉基因熒光標記斑馬魚可在對應激發光下顯現標記位置，如本研究使用的肝臟細胞綠色熒光標記轉基因斑馬魚 Tg（lfabp: EGFP）在激發光下可通過觀察記錄其清晰的熒光肝臟形態，定量分析斑馬魚肝臟熒光面積、熒光強度和熒光3D 成像體積，為器官形態觀察與指標測量提供方便。同時基因測序表明斑馬魚與人類基因同源性高達87%，斑馬魚肝臟和機體免疫炎癥細胞對外源性藥物的反應與人類高度相似。斑馬魚屬于非哺乳類脊椎動物，在實驗動物倫理方面的限制小，符合實驗動物福利保護的國際“3R”原則。

為此本研究選取歷代醫籍記載的炮制方法，利用斑馬魚為模型，系統比較不同炮制方法對補骨脂減毒效果的影響，為優選補骨脂炮制方法提供參考，為補骨脂安全的開發利用提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

斑馬魚養殖系統（北京愛生科技有限公司）；XW-80A 型混合儀（上海滬西分析器廠）；HPG280BX 型光照培養箱（哈爾濱東聯電子技術開發有限公司）；Agilent 1290 UPLC 儀（美國安捷倫有限公司）；API 4000 三重四級桿質譜（美國SCIEX公司）；FSX16 型體視熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；RM2245 型切片機（德國Leica 公司）；KDBMII 型生物組織自動包埋機、KD-TS3D 型生物組織自動脫水機（浙江科迪儀器設備有限公司）；KZPG-1A 型攤片烤片機（天津天利航空機電有限公司）；PCRSCIENTZ-II D 型超聲破碎機（浙江新芝生物科技股份有限公司）；Allegra X-30R Centrifuge型離心機（美國Beckman Coulter 公司）；CFX96 Touch C1000 Thermal Cycler 型實時熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad 公司）；NANODROP ONEC 超微量紫外可見分光光度計（美國 Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 藥材

補骨脂購自新奇康（新疆）藥業股份有限公司，由新疆維吾爾自治區維吾爾醫醫院霍仕霞研究員鑒定為豆科植物補骨脂P.corylifoliaL.的干燥成熟果實。

1.3 藥品與試劑

補骨脂素（批號10376，質量分數99.8%）、異補骨脂素（批號14592，質量分數99.6%）購自詩丹德（上海）標準技術服務有限公司；乙腈（批號I1133829105，質譜純）、甲醇（批號I1139035113，質譜純）購自美國 Merck 公司；甲酸（批號B2307725，質譜純）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三卡因（批號A5040）、拍照用魚體固定液羧甲基纖維素鈉（ sodium carboxy methyl cellulose，CMC-Na，批號419281）購自美國Sigma-Aldrich 公司；多聚甲醛（批號CR2209049）購自塞維爾（武漢）生物科技有限公司；PBS 漂洗緩沖液（批號SADKZ）、組織細胞RNA 快速提取試劑盒（批號DMQTQ）購自思科捷（山東）生物技術有限公司；99%生物技術級聚山梨酯 20（批號C13720975）購自麥克林（上海）生化科技有限公司；NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus （ 批號05256502）購自近岸（上海）蛋白質科技有限公司；HiScript III RT DuperMix for qPCR（批號R323-01）購自諾唯贊（南京）生物科技有限公司。

1.4 動物

AB 野生型斑馬魚、Tg（lfabp: EGFP）型肝臟細胞綠色熒光標記轉基因斑馬魚和 Tg（lysc:DsRed2）型中性粒細胞紅色熒光標記轉基因斑馬魚品系為山東省科學院生物研究所斑馬魚藥物篩選平臺提供。

2 方法

2.1 斑馬魚的養殖與繁育

雌雄斑馬魚隔離喂養，交替照明14 h/黑暗10 h，每日按時投喂剛孵化的豐年蝦幼體和人工餌料。采集受精卵時取性成熟的健康斑馬魚按雌雄1∶1 或1∶2的比例放入帶隔板的缸中，次日給予照明（8: 00 時）同時去除隔板，9: 00～11: 00 時收獲受精卵。對受精卵進行消毒和洗滌后移入斑馬魚胚胎培養用水中，28 ℃下控光培養。

2.2 補骨脂不同炮制品水提物制備、含量測定與斑馬魚給藥溶液的制備

2.2.1 補骨脂不同炮制品水提物制備 炮制的方法參照各典籍，每次實驗嚴格控制操作的溫度和時間。本研究使用的是補骨脂不同炮制品的水提物。水提步驟為粉碎后經10 倍量純化水煮沸提取3 次，3 次提取液混合后蒸發、回流、烘干。補骨脂干燥果實水提得補骨脂生品，記錄出膏率；依據《雷公炮炙論》法炮制得補骨脂雷公法制品[13]，水提后記錄出膏率；據《太平圣惠方》法炮制得補骨脂清炒法制品[13]，水提后記錄出膏率；依據《洪氏集驗方》法[13]炮制得補骨脂酒炙法制品，水提后記錄出膏率；依據《壽世保元》法和《中國藥典》2020 年版炮制得補骨脂鹽炙法制品[14-15]，水提后記錄出膏率。水提生品出膏率26.22%，雷公法出膏率11.75%，清炒法出膏率22.24%，酒炙法出膏率21.32%，鹽炙法出膏率23.75%。

2.2.2 補骨脂不同炮制品水提物含量測定

（1）對照品儲備液的制備：取對照品補骨脂素和異補骨脂素各5 mg，精密稱定，分別置5 mL 量瓶中，加甲醇適量，超聲（功率250 W、頻率40 kHz）使溶解，加甲醇至刻度，搖勻，即得質量濃度為5 mg/mL 的對照品儲備液。

（2）線性溶液的制備：分別精密移取對照品儲備液適量，置于不同規格量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配制成一系列濃度的線性溶液，搖勻，即得。

（3）樣品制備：取補骨脂生品、補骨脂清炒法制品、補骨脂酒炙法制品、補骨脂鹽炙法制品、補骨脂雷公法制品25 mg，精密稱定，置25 mL 量瓶中，加50%甲醇適量，超聲（功率250 W、頻率40 kHz）處理30 min，放冷，加50%甲醇至刻度，搖勻，精密移取1 mL，置5 mL 量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，取2 mL，12 000 r/min 離心5 min，取上清液，即得。

（4）色譜條件：Agilent Poroshell SB-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；柱溫30 ℃；體積流量0.3 mL/min；進樣量2 μL；檢測波長190～400 nm；流動相為0.1%甲酸乙腈溶液（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～2 min，10%～15% A；2～5 min，15%～20% A；5～7 min，20%～40% A；7～10 min，40% A；10～15 min，40%～50% A；15～17 min，50%～70% A；17～19 min，70%～90% A；19～22 min，90% A。

（5）質譜條件：電噴霧離子源（ESI）；三重四級桿液質聯用儀ESI 正、負離子檢測模式；離子源溫度550 ℃；噴霧氣壓力344.75 kPa；輔助加熱氣壓力275.8 kPa；氣簾氣壓力137.9 kPa；離子化電壓5 500 V/?4 500V；各化合物質譜多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）參數見表1。

表1 MRM 參數Table 1 MRM parameters

2.2.3 斑馬魚給藥溶液的制備 精密稱取補骨脂生品、補骨脂雷公法制品、補骨脂清炒法制品、補骨脂酒炙法制品和補骨脂鹽炙法制品，分別置于1.5 mL EP 管中，以1 mL 純凈水溶解配制得到各炮制品相當生藥質量濃度200 mg/mL 的母液，后各取100 μL 母液于另一1.5 mL EP 管中，加900 μL 斑馬魚胚胎培養用水稀釋至相當生藥質量濃度 20 mg/mL 的分裝藥液用于后續實驗給藥，125、250、500 μg/mL 生藥質量濃度給藥體系分別為取用各炮制品分裝溶液12.5、25、50 μL 于每孔總養魚水2 mL 的24 孔板中配制所得。

斑馬魚胚胎培養水為1 L 純凈水中加入0.633 g KCl、2.452 g CaCl2、14.658 g NaCl、4.06 g MgSO4·7H2O。麻醉劑為純凈水配制的0.16 mg/mL三卡因溶液。

2.3 斑馬魚急性毒性分析

AB 野生型斑馬魚卵受精發育72 h 后（hours post-fertilization，hpf），在體視顯微鏡下挑選正常的斑馬魚胚胎，移入24 孔板中，每孔15 條。以出膏率換算同等生藥量設定各炮制品組給藥質量濃度（125、250、500、600、700、800、1 000 μg/mL），除空白對照組外胚胎培養用水中給藥補骨脂不同炮制品處理72 h。每次每組3 個重復孔。每孔用胚胎培養用水加至總體積為2 mL。然后加蓋，置于光照培養箱（28 ℃）讓胚胎繼續發育。連續3 d 記錄各組死亡情況，藥物處理72 h 后，取10～15 條于適量三卡因中麻醉，在體視顯微鏡下固定于甲基纖維素溶液中，使斑馬魚對眼側臥于載玻片上，觀察斑馬魚白光下全身情況并拍照，參考斑馬魚畸形評分標準[16]并運用軟件統計各組斑馬魚全身毒性情況。

2.4 斑馬魚肝臟形態分析

利用72 hpf Tg（lfabp: EGFP）型肝臟細胞綠色熒光標記轉基因斑馬魚，同“2.3”項下方法給藥造模72 h 后，取10～15 條于適量三卡因中麻醉，在體視顯微鏡下固定于甲基纖維素溶液中，使斑馬魚對眼側臥于載玻片上，觀察斑馬魚在激發光線下熒光肝臟情況并拍照，統計補骨脂不同炮制品對熒光肝臟面積、熒光強度影響，并進行高內涵成像分析肝臟3D 形態差異。

2.5 斑馬魚肝臟組織病理切片分析

利用72 hpf AB 野生型斑馬魚，同“2.3”項下方法給藥造模72 h 后，取5～10 條于適量三卡因中麻醉，再轉入4%多聚甲醛對斑馬魚進行固定96 h后用梯度乙醇、醇苯、二甲苯脫水，在包埋機中以石蠟包埋后4 μm 切片，脫蠟至水，純凈水沖洗后進行蘇木素-伊紅（HE）染色，洗凈切片放入梯度乙醇；二甲苯中脫水至透明，晾干，用中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 斑馬魚炎癥檢測

2.6.1 斑馬魚肝臟區域炎癥統計 利用72 hpf Tg（lysc: DsRed2）型中性粒細胞紅色熒光標記轉基因斑馬魚，同“2.3”項下方法給藥造模72 h 后，隨機取15～20 條于適量三卡因中麻醉，在體視顯微鏡下固定于甲基纖維素溶液中，使斑馬魚對眼側臥于載玻片上，觀察斑馬魚白光下和激發光線下肝臟區域紅色熒光中性粒細胞情況并拍照，統計補骨脂不同炮制品對肝臟區域熒光中性粒細胞計數影響。

2.6.2 斑馬魚炎癥相關因子基因表達檢測 利用72 hpf AB 野生型斑馬魚，同“2.3”項下方法給藥造模72 h 后，將各組斑馬魚取20 條，轉移至1.5 mL無酶滅菌EP 管中，純凈水漂洗2 次后去除水分，按照試劑盒說明書提取總RNA 并合成cDNA，進行qRT-PCR 分析。引物序列見表2。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

2.7 統計學分析

3 結果

3.1 補骨脂不同炮制品水提物含量測定

使用UPLC-QqQ/MS 在MRM 模式下，測定補骨脂不同炮制品提取物中補骨脂素和異補骨脂素的含量（色譜圖見圖1），采用標準曲線法，補骨脂素在8.38～3 350.79 ng/mL 配制5 個稀釋質量濃度，補骨脂素在16.58～3 315.68 ng/mL 配制5 個稀釋質量濃度。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），用最小二乘法進行線性回歸分析，繪制線性方程，回歸方程及線性范圍結果見表3，含量測定結果見表4。在相對生藥量500 μg/mL 的補骨脂生品、補骨脂雷公法制品、補骨脂清炒法制品、補骨脂酒炙法制品和補骨脂鹽炙法制品溶液中，補骨脂素濃度分別為5.25、4.42、4.29、4.57、4.66 μmol/L，異補骨脂素濃度分別為4.19、2.01、3.37、3.55、3.69 μmol/L。

圖1 對照品與炮制品的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of reference substance and processed product

表3 回歸方程及線性范圍Table 3 Regression equation and linear range

表4 5 批樣品的含量測定Table 4 Content determination of five batches of samples

3.2 補骨脂不同炮制品水提物對斑馬魚急性毒性差異

如圖2 所示，空白對照組無死亡；補骨脂生品的半數致死濃度（median lethal concentration，LC50）為718.0 μg/mL，最小致死濃度（minimum lethal concentration，LC1）為425.1 μg/mL；補骨脂酒炙法制品的LC50為730.1 μg/mL，LC1為520.8 μg/mL，補骨脂鹽炙法制品的LC50為731.0 μg/mL，LC1為563.5 μg/mL；補骨脂清炒法制品和補骨脂雷公法制品的LC50為890.4 μg/mL，LC1為723.0 μg/mL。補骨脂不同炮制品水提物的LC50和LC1由大到小排序為補骨脂雷公法制品＝補骨脂清炒法制品＞補骨脂鹽炙法制品＞補骨脂酒炙法制品＞補骨脂生品。

圖2 補骨脂不同炮制品水提物對斑馬魚急性毒性Fig.2 Acute toxicity of water extracts from different processed products of Psoraleae Fructus to zebrafish

高質量濃度下補骨脂生品、補骨脂酒炙法制品和補骨脂鹽炙法制品的水提物導致了斑馬魚明顯的脊柱彎曲和魚鰾丟失。

如圖3-A 所示，補骨脂生品對斑馬魚有明顯的致畸毒性，在高質量濃度下斑馬魚卵黃囊吸收顯著遲緩且肝臟和卵黃囊區域明顯發黑、脊柱明顯彎曲、魚鰾完全缺失、出現明顯心包水腫；補骨脂鹽炙法制品高質量濃度組和補骨脂酒炙法制品高質量濃度組有顯著的致畸毒性，脊柱出現明顯彎曲，卵黃囊吸收明顯減緩且肝臟和卵黃囊區域輕微發黑，魚鰾幾乎缺失，同時鹽炙法制品高質量濃度組還伴有輕微心包水腫；清炒法制品高質量濃度組有較明顯的致畸毒性，卵黃囊吸收較明顯減緩，出現輕微脊柱彎曲，伴有魚鰾減小和輕微心包水腫；雷公法制品高質量濃度對全身無明顯毒性。補骨脂不同炮制品水提物魚鰾缺失毒性由強到弱排序為補骨脂生品＞補骨脂酒炙法制品＞補骨脂鹽炙法制品＞補骨脂清炒法制品＞補骨脂雷公法制品。補骨脂不同炮制品水提物心包水腫毒性由強到弱排序為補骨脂生品＞補骨脂酒炙法制品＞補骨脂鹽炙法制品＞補骨脂清炒法制品＞補骨脂雷公法制品。

圖3 補骨脂不同炮制品水提物（500 μg·mL?1）對斑馬魚致畸毒性Fig.3 Teratogenic toxicity of water extracts from different processed products of Psoraleae Fructus (500 μg·mL?1) to zebrafish

如圖3-B 所示，與空白對照組的脊柱彎曲角度相比，補骨脂生品、清炒法制品、酒炙法制品和鹽炙法制品對斑馬魚有顯著的脊椎彎曲毒性（P＜0.05、0.001），補骨脂雷公法制品脊椎無顯著性差異。與補骨脂生品組比較，雷公法、清炒法、酒炙法和鹽炙法均顯著降低了補骨脂對斑馬魚的脊柱彎曲毒性（P＜0.05、0.001），補骨脂補骨脂不同炮制品水提物脊柱彎曲毒性由強到弱排序為補骨脂生品＞補骨脂酒炙法制品＝補骨脂鹽炙法制品＞補骨脂清炒法制品＞補骨脂雷公法制品。

如圖3-C 所示，與空白對照組的卵黃囊面積相比，補骨脂生品、清炒法制品、酒炙法制品和鹽炙法制品對斑馬魚有顯著的卵黃囊吸收減緩毒性（P＜0.01、0.001），補骨脂雷公法制品卵黃囊面積無顯著性差異。相比于補骨脂生品，雷公法、清炒法、酒炙法和鹽炙法均顯著降低了補骨脂對斑馬魚的卵黃囊吸收減緩毒性（P＜0.05、0.01、0.001），補骨脂不同炮制品水提物卵黃囊吸收減緩毒性由強到弱排序為補骨脂生品＞補骨脂酒炙法制品＝補骨脂鹽炙法制品＞補骨脂清炒法制品＞補骨脂雷公法制品。

如圖3-D 所示，與空白對照組的全身畸形情況相比，補骨脂生品、酒炙法制品、鹽炙法制品和清炒法制品對斑馬魚有顯著的致畸毒性（P＜0.001），補骨脂雷公法制品整體體態無顯著差異。相比于補骨脂生品，雷公法和清炒法顯著降低了補骨脂對斑馬魚的致畸毒性（P＜0.001），酒炙法和鹽炙法對補骨脂致畸毒性的影響無顯著性差異，補骨脂不同炮制品水提物畸形評分由大到小排序為補骨脂生品＞補骨脂酒炙法制品＝補骨脂鹽炙法制品＞補骨脂清炒法制品＞補骨脂雷公法制品。

3.3 補骨脂不同炮制品水提物對斑馬魚肝臟形態影響差異

如圖4-A 所示，與空白對照組比較，補骨脂生品、酒炙法制品和鹽炙法制品高濃度組斑馬魚肝臟形態有明顯缺失而清炒法和雷公法高濃度組對斑馬魚肝臟形態無明顯改變。

圖4 補骨脂不同炮制品水提物（500 μg·mL?1）對斑馬魚肝臟形態的影響 (2D)Fig.4 Effect of water extracts from different processed products of Psoraleae Fructus (500 μg·mL?1) on liver morphology of zebrafish (2D)

如圖4-B 所示，對斑馬魚肝臟熒光面積影響最大的炮制品是補骨脂鹽炙法制品，其顯著降低了斑馬魚肝臟熒光面積大小（P＜0.001），甚至影響程度大于補骨脂生品組，這表明發生了強烈肝損傷；補骨脂清炒法制品對肝臟熒光面積有影響趨勢，肝臟熒光面積影響排序為補骨脂鹽炙法制品＞補骨脂生品＞清炒法＞補骨脂酒炙法制品＝補骨脂雷公法制品。

如圖4-C 所示，對斑馬魚肝臟熒光強度影響較大的炮制品是補骨脂清炒法制品，其明顯降低了肝臟的熒光強度（P＜0.05），其次為補骨脂生品和補骨脂鹽炙法制品（P＜0.05），這表明肝細胞密度明顯減小，肝臟熒光強度影響排序為補骨脂清炒法制品＞補骨脂生品＞補骨脂鹽炙法制品＞補骨脂酒炙法制品＝補骨脂雷公法制品。

如圖5-A 所示，用高內涵成像系統捕獲空白對照組和補骨脂不同炮制品高質量濃度（500 μg/mL）組3D 肝臟形態。與空白對照組比較，在補骨脂生品、補骨脂酒炙法制品和補骨脂鹽炙法制品影響下斑馬魚的肝葉出現缺失情況。

圖5 補骨脂不同炮制品水提物（500 μg·mL?1）對斑馬魚肝臟形態的影響 (3D)Fig.5 Effect of water extracts from different processed products of Psoraleae Fructus (500 μg·mL?1) on liver morphology of zebrafish (3D)

如圖5-B 所示，與空白對照組比較，補骨脂生品、酒炙法制品、鹽炙法制品、清炒法和雷公法顯著減小了斑馬魚肝臟熒光體積（P＜0.05、0.001）。相比于補骨脂生品組，補骨脂鹽炙法、清炒法和雷公法制品組肝臟熒光體積有明顯的回升（P＜0.05、0.001）。肝臟熒光體積影響排序為補骨脂生品＞補骨脂酒炙法制品＞補骨脂鹽炙法制品＞補骨脂清炒法制品＞補骨脂雷公法制品。

3.4 補骨脂不同炮制品水提物對斑馬魚肝臟組織病理切片的影響

如圖6 所示，與空白對照組比較，補骨脂雷公法制品對肝臟病理切片影響無顯著差異，而在補骨脂生品、補骨脂鹽炙法制品、補骨脂清炒法制品和補骨脂酒炙法制品的影響下斑馬魚肝臟細胞間出現明顯空泡，表明肝臟結構存在嚴重缺陷，且肝臟細胞邊界不清晰，細胞結構受損。肝臟組織病理結構影響排序為補骨脂生品＞補骨脂鹽炙法制品＞補骨脂清炒法制品＞補骨脂酒炙法制品＞補骨脂雷公法制品。

3.5 補骨脂不同炮制品對斑馬魚機體炎癥的影響

3.5.1 補骨脂不同炮制品對斑馬魚肝臟區域炎癥的影響 如圖7-A 所示，與空白對照組比較，補骨脂生品、鹽炙法制品、酒炙法制品和清炒法制品導致了斑馬魚肝臟區域中性粒細胞的大量聚集，補骨脂雷公法制品對斑馬魚肝臟區域的中性粒細胞有輕微聚集作用。如圖7-B 所示，與空白對照組比較，補骨脂生品、鹽炙法制品、酒炙法制品、清炒法制品和雷公法制品顯著增加了斑馬魚肝臟區域中性粒細胞的數量（P＜0.05、0.001）；相比補骨脂生品組，補骨脂鹽炙法制品明顯增加肝臟區域中性粒細胞數量（P＜0.05），補骨脂雷公法制品顯著減少了斑馬魚肝臟區域中性粒細胞的數量（P＜0.001）。肝臟區域中性粒細胞數量由高到底排序為補骨脂鹽炙法制品＞補骨脂生品＞補骨脂酒炙法制品＞補骨脂清炒法制品＞補骨脂雷公法制品。

3.5.2 補骨脂不同炮制品水提物對斑馬魚炎癥相關因子mRNA 表達的影響 如圖8 所示，與空白對照組比較，補骨脂生品顯著提高了斑馬魚體內炎癥相關基因IL-1β、NLRP3、TNF-α、NF-κBmRNA 表達水平（P＜0.05、0.01、0.001），顯著降低了斑馬魚體內抗炎相關基因IL-2mRNA 表達水平（P＜0.05）。與補骨脂生品組比較，補骨脂雷公法制品顯著逆轉了TNF-αmRNA 改變并恢復正常水平（P＜0.001），同時對IL-1β、NLRP3、NF-κBmRNA 表達有逆轉趨勢。清炒法、酒炙法及鹽炙法相比空白對照組顯著提升了IL-1βmRNA 水平（P＜0.01、0.001），且相對補骨脂生品進一步提高了NLRP3和NF-κBmRNA 水平，但清炒法和酒炙法明顯逆轉了補骨脂生品對IL-2mRNA 水平的下降（P＜0.05），且只有清炒法制品降低了IL-10mRNA 水平（P＜0.05）。

圖8 補骨脂不同炮制品水提物（500 μg·mL?1）對斑馬魚炎癥相關因子mRNA 表達的影響 (±s , n = 3)Fig.8 Effects of water extracts from different processed products of Psoraleae Fructus (500 μg·mL?1) on mRNA expressions of inflammation-related factors of zebrafish (±s , n = 3)

4 討論

古籍中記載著豐富且復雜的補骨脂“炮制減毒”[17]方法，如酒炙法、雷公法、清炒法、鹽炙法等，但不同炮制法的減毒效果及其科學內涵尚未進行系統研究。本研究根據歷代本草記載的炮制方法，對比補骨脂不同炮制方法的減毒效果差異，為優選減毒炮制提供參考。

本研究前期通過HPLC 明確各補骨脂炮制品的主要成分補骨脂素和異補骨脂素含量，符合《中國藥典》2020 年版補骨脂含補骨脂素和異補骨脂素的總量不得少于0.70%的規定，并以出膏率換算同等炮制前生藥量500 μg/mL，同等生藥量下，補骨脂生品的補骨脂素和異補骨脂素含量最高，雷公法制品的異補骨脂素含量最低，清炒法制品的補骨脂素含量最低。

本研究通過統計給藥后斑馬魚脊椎彎曲程度、卵黃囊面積、魚鰾缺失情況、心包水腫情況[18]以獲得畸形評分[19]評價急性毒性強弱，發現基于斑馬魚模型補骨脂不同的炮制品水提物急性毒性存在差異，補骨脂生品急性毒性最強，與補骨脂不同炮制品相比同等生藥量給藥下補骨脂生品更易導致斑馬魚出現急性中毒死亡與嚴重的全身器官畸形，而不同炮制法可減輕急性毒性強度，其中雷公法的急性毒性減毒效果最佳。

本研究通過統計給藥后轉基因肝臟細胞綠色熒光標記斑馬魚肝臟熒光的強度、面積、體積[20]，肝臟病理切片情況和轉基因中性粒細胞紅色熒光標記斑馬魚肝臟熒光中性粒細胞數量[21-22]來評價補骨脂不同炮制品的肝毒性強度，發現補骨脂不同的炮制品水提物肝臟毒性存在差異，補骨脂雷公法制品肝臟形態毒性、肝臟病理結構毒性、肝臟區域促炎毒性減毒效果均最為優異[23-24]，這可能與雷公法導致補骨脂苷、異補骨脂苷、補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂酚的含量明顯減少和（異）補骨脂苷轉化為活性成分（異）補骨脂素有關[25-26]。而相較于補骨脂生品，補骨脂鹽炙法制品則進一步減弱了斑馬魚的肝臟熒光面積，加劇了肝細胞間空泡化并在補骨脂生品的肝臟促炎毒性基礎上加重了肝臟區域中性粒細胞的積累，這與其他學者所得“與補骨脂生品相比補骨脂鹽炙法制品肝毒性更強且補骨脂生品和鹽炙法制品導致炎癥升高”的實驗結果[26]一致，這可能與鹽炙法使補骨脂素、補骨脂二氫黃酮、補骨脂異黃酮、異補骨脂查耳酮、補骨脂查耳酮含量增加有關[15,27-29]。補骨脂清炒法制品則顯著降低了斑馬魚的肝臟熒光強度，這可能與清炒法導致補骨脂苷、異補骨脂苷的總含量提高有關[30]。

炎癥在藥物性肝損傷等肝臟疾病發生發展中發揮關鍵作用[31]。IL-1β 是一種重要的促炎細胞因子，除補骨脂雷公法制品外，各炮制品組IL-1βmRNA表達水平均明顯升高，提示補骨脂生品、補骨脂鹽炙法制品、補骨脂酒炙法制品和補骨脂清炒法制品導致斑馬魚機體發生炎癥反應。NLRP3 炎癥小體是一種胞質多蛋白復合物，其異常激活與各種炎癥性疾病的發病機制有關[32]，除補骨脂雷公法制品外，各炮制品組NLRP3mRNA 表達水平均顯著升高，補骨脂鹽炙法制品組與補骨脂生品組斑馬魚相比炎癥水平更高。TNF-α 是一種在炎癥反應中起關鍵作用的細胞因子[33]，補骨脂生品組顯著上調了TNF-α的mRNA 表達水平，而不同炮制品顯著逆轉了炎癥的發生，其中雷公法制品與空白對照組無顯著差別。NF-κB 是炎癥介質的轉錄激活劑[34-35]，各補骨脂炮制品均顯著上調了NF-κB的mRNA 表達水平，與生品相比，雷公法制品逆轉了炎癥水平的上升，而鹽炙法、酒炙法、清炒法制品則加劇了炎癥水平的上升。IL-2 是一種細胞因子，主要參與CD4+T 輔助亞群和CD4+T 調節細胞的分化和存活以及細胞毒性效應淋巴細胞的活化[36]，補骨脂生品、雷公法制品、鹽炙法制品組IL-2的mRNA 表達水平明顯下降，提示免疫能力下降。IL-10 是一種抗炎細胞因子，在大多數免疫過程中都具有有效的抗炎和調節活性[37]，提示只有清炒法明顯下調了抗炎能力。不同炮制品給藥組斑馬魚幼體內炎癥相關因子IL-1β、NLRP3、TNF-α、NF-κBmRNA 水平與肝臟區域中性粒細胞數量結果趨勢相符，提示基于斑馬魚模型補骨脂生品可能通過引起肝臟部位炎癥反應導致肝損傷[38]，而鹽炙法可加重炎癥的發生，雷公法則可減輕炎癥的發生。

綜上，補骨脂水提物對斑馬魚的急性毒性可通過炮制而減弱，而其肝毒性通過不同炮制除減毒外也存在增毒的情況。其中雷公法炮制對急性毒性和肝毒性的減毒效果最佳。本研究為補骨脂炮制減毒提供斑馬魚模型實驗依據，表明采用合理的炮制方法可降低補骨脂急性毒性和肝臟毒性，推測補骨脂通過炮制對肝毒性的減毒機制與炎癥有關。但仍需通過進一步研究揭示補骨脂炮制減毒的物質基礎與作用機制，為補骨脂炮制方法的選擇提供理論依據，從而達到降低補骨脂用藥過程中的不良反應提升其藥用價值的目的。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突