加味柴胡疏肝散基準(zhǔn)樣品HPLC 指紋圖譜及關(guān)鍵質(zhì)量屬性量值傳遞規(guī)律研究

姜艷雯 ，鄒愷平，陳夢(mèng)嬌 ，劉 順，江志偉，曹 園*，龔冠聞*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210000

2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210000

柴胡疏肝散（Chaihu Shugan Powder，CSP）是理氣劑的代表方，載于明末醫(yī)家張介賓所著《景岳全書(shū)》，主治脅肋疼痛、肝失疏泄等疾病[1]。加味柴胡疏肝散（Modified Chaihu Shugan Powder，MCSP）是在CSP 的基礎(chǔ)上將芍藥定為赤芍，加砂仁、法半夏、麩炒白術(shù)、木香以及厚樸花而成。本方以柴胡疏肝解郁、調(diào)暢肝氣為君藥，醋香附行氣解郁，川芎活血止痛，二藥相合共為臣藥，助君藥解肝膽氣滯，促進(jìn)氣血津液的運(yùn)行[2]。以陳皮、麩炒枳殼理氣健脾[3]，法半夏、麩炒白術(shù)降逆和胃，砂仁、木香、厚樸花消食行滯，赤芍養(yǎng)血柔肝、緩急止痛為佐藥，甘草補(bǔ)益脾氣，兼調(diào)諸藥，亦為使藥之用。雖由CSP加味，卻可使其疏肝解郁、行氣止痛之力大增，同時(shí)增加脾胃調(diào)理之用，脾胃健運(yùn)，臟腑才能和順協(xié)調(diào)，肝氣調(diào)達(dá)，元?dú)獠拍艹渑妫虼吮痉礁m用于膽源性胰腺炎的治療。

該方能有效減輕患者臨床癥狀、改善黃疸指標(biāo)、促進(jìn)胰腺周?chē)鷿B出的吸收，而且能促進(jìn)早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)的應(yīng)用，幫助患者減少膿毒癥和器官功能不全的發(fā)生率，對(duì)于控制慢性膽囊炎、膽囊術(shù)后綜合征也有非常好的療效[4-6]。關(guān)于MCSP 的量值傳遞以及飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究尚未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道。對(duì)MCSP 進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)是保證臨床用藥安全有效的基礎(chǔ)，亦是中藥生產(chǎn)現(xiàn)代化和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)科學(xué)化的關(guān)鍵[7-9]。當(dāng)前制劑的研究應(yīng)以中藥中特定核心質(zhì)量物質(zhì)的溯源和傳遞進(jìn)行分析，對(duì)整體質(zhì)量的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行控制，為MCSP 的可行性及質(zhì)量提供保障[10-11]，因此有必要開(kāi)展MCSP 的量值傳遞規(guī)律研究以及飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

本研究制備了40 批MCSP 基準(zhǔn)樣品，建立其指紋圖譜，利用主成分分析（principal component analysis，PCA）和因子分析等化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，結(jié)合指標(biāo)性成分含量以及轉(zhuǎn)移率，進(jìn)行量值傳遞分析及整體質(zhì)量研究，為中藥復(fù)方制劑后續(xù)開(kāi)發(fā)提供科學(xué)理論依據(jù)，也為經(jīng)典名方CSP 的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters Acquity Arc 型高效液相色譜儀，沃特世科技中國(guó)有限公司；Kudos SK6200H 型超聲波清洗器，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；Cmdieip 型黑晶電陶爐3500 W，德國(guó)凱盟迪艾普公司；BP-211D 型電子分析天平，十萬(wàn)分之一，德國(guó)賽多利斯公司；AX224 型電子分析天平，萬(wàn)分之一，美國(guó)歐豪斯公司；HH-S6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司；RT-02A 型高速粉碎機(jī)，泓荃制藥機(jī)械公司；HGZF-9203 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；煎藥壺3.6 L，康舒旗艦店。

1.2 試劑

對(duì)照品去氫木香內(nèi)酯（批號(hào)B21026）、蕓香柚皮苷（批號(hào)220106）、新橙皮苷（批號(hào)B21390）、阿魏酸（批號(hào)131110A）、橙皮素（批號(hào)B20184）、橙皮苷（批號(hào)B20182）、咖啡酸（批號(hào)B20660）、柚皮苷（批號(hào)B21594）、芍藥苷（批號(hào)B21148）、芍藥內(nèi)酯苷（批號(hào)B21149）、柴胡皂苷A（批號(hào)B20146）、柴胡皂苷D（批號(hào)B20150）、甘草苷（批號(hào)Z10J8X39611），質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%，均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；對(duì)照品甘草酸（批號(hào)160902，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、川陳皮素（批號(hào)210710，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥93%）均購(gòu)自南京聚康醫(yī)藥化工有限公司。乙腈，色譜純，美國(guó)Tedia 公司；磷酸，分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；屈臣氏純凈水，長(zhǎng)江和記有限公司；其他試劑為分析純。

1.3 飲片

不同產(chǎn)地及批次飲片經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院江蘇省中醫(yī)院制劑部周琴妹主任中藥師鑒定，柴胡為傘形科柴胡屬植物柴胡BupleurumchinenseDC.的干燥根、陳皮為蕓香科柑橘屬植物橘Citrus reticulataBlanco 的干燥成熟果皮、香附為莎草科莎草屬植物莎草CyperusrotundusL.的干燥根莖、川芎為傘形科藁本屬植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖、枳殼為蕓香科柑橘屬植物酸橙CitrusaurantiumL.的干燥未成熟果實(shí)、甘草為豆科甘草屬植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖、赤芍為毛茛科芍藥屬植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根、木香為菊科風(fēng)毛菊屬植物木香AucklandialappaDecne.的干燥根、砂仁為姜科豆蔻屬植物陽(yáng)春砂AmomumvillosumLour.的干燥成熟果實(shí)、半夏為天南星科半夏屬植物半夏Pinellia ternate(Thunb.) Breit.的干燥塊莖、厚樸花為木蘭科厚樸屬植物厚樸MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.的干燥花蕾、白術(shù)為菊科蒼術(shù)屬植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖，以上飲片符合《中國(guó)藥典》2020 年版項(xiàng)下相關(guān)規(guī)定。

通過(guò)隨機(jī)數(shù)表法對(duì)表1 中MCSP 的飲片進(jìn)行隨機(jī)組合，其中對(duì)柴胡、川芎、陳皮、麩炒枳殼、木香及赤芍的指標(biāo)性成分需進(jìn)行產(chǎn)地分析，因此收集了不同產(chǎn)地多批次的飲片，其余6 味作為共有藥味，重復(fù)使用，分別為厚樸花（批號(hào)220701，產(chǎn)地四川）、麩炒白術(shù)（批號(hào)220703，產(chǎn)地安徽）、法半夏（批號(hào)2207016，產(chǎn)地甘肅）、砂仁（批號(hào)20220901-01，產(chǎn)地云南）、醋香附（批號(hào)220702，產(chǎn)地河南）、甘草（批號(hào)220601，產(chǎn)地甘肅），隨機(jī)組合結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 MCSP 飲片來(lái)源信息Table 1 Source information of MCSP herbal pieces

表2 MCSP 隨機(jī)組合Table 2 Random combination of MCSP

2 方法與結(jié)果

2.1 MCSP 基準(zhǔn)樣品的制備

MCSP 的樣品煎煮方式參照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》2009 年版的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行，以臨床常用處方：柴胡、醋香附、赤芍、麩炒枳殼、川芎、陳皮、木香、砂仁、麩炒白術(shù)、法半夏、厚樸花以及甘草，加水至藥面上方2～5 cm，浸泡30 min，武火（電陶爐2 200 W）煮沸后再煎煮30 min，200目濾網(wǎng)濾過(guò)，濾液放涼，二煎文火（電陶爐600 W）煎煮20 min，200 目濾網(wǎng)濾過(guò)，合并2 次濾液，加水調(diào)整體積為200 mL，即得MCSP 基準(zhǔn)樣品。

2.2 MCSP 基準(zhǔn)樣品指紋圖譜研究

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Waters X Select HSS T3柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～5 min，0～5%乙腈；5～8 min，5%～8%乙腈；8～55 min，8%～20%乙腈；55～75 min，20%～30%乙腈；75～90 min，30%～35%乙腈；90～110 min，35%～65%乙腈；110～120 min，65%～5%乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；體積流量1 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL；柱溫30 ℃。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密吸取“2.1”項(xiàng)下制備的樣品1 mL，70%甲醇超聲15 min，定容至5 mL量瓶中，搖勻，靜置，取上清液過(guò)0.22 μm 濾膜，即得。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 分別取芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、橙皮苷、柚皮苷、橙皮素、新橙皮苷、阿魏酸、去氫木香內(nèi)酯、甘草苷、甘草酸、咖啡酸、川陳皮素、蕓香柚皮苷適量，精密稱(chēng)定，加甲醇配制成質(zhì)量濃度為60.9、59.5、61.4、64.7、60.8、59.0、61.0、59.4、92.3、51.8、60.4、59.5、58.8 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

（1）參照峰的選擇：指紋圖譜中，柚皮苷的含量較高，且色譜峰穩(wěn)定，故選擇柚皮苷（峰18）作為指紋圖譜的參照峰，計(jì)算指紋圖譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

（2）精密度考察：取同一批MCSP 基準(zhǔn)樣品（S1），參照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液1 份，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均＜0.70%，相對(duì)峰面積的RSD 均＜2.44%，表明儀器精密度良好。

（3）重復(fù)性考察：取同一批MCSP 基準(zhǔn)樣品（S1），參照“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果顯示各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均＜0.07%，相對(duì)峰面積的RSD均＜2.57%，表明該方法重復(fù)性好。

（4）穩(wěn)定性考察：取同一批MCSP 基準(zhǔn)樣品（S1），參照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液1 份，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于制樣后0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均＜0.13%，相對(duì)峰面積的RSD 均＜2.13%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 指紋圖譜的建立及相似度的分析 取40 批MCSP 基準(zhǔn)樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012 版）軟件對(duì)樣品指紋圖譜進(jìn)行分析。以樣品S1 的指紋圖譜作為參照譜進(jìn)行指紋匹配（平均數(shù)法，時(shí)間窗0.1 min），確定了29 個(gè)共有峰，并生成對(duì)照指紋圖譜（R），40 批MCSP 基準(zhǔn)樣品的HPLC 指紋圖譜疊加圖見(jiàn)圖1。40 批MCSP 基準(zhǔn)樣品（S1～S40）相似度結(jié)果分別為0.981 0、0.979 0、0.967 0、0.985 0、0.982 0、0.980 0、0.923 0、0.977 0、0.960 0、0.949 0、0.961 0、0.983 0、0.961 0、0.977 0、0.990 0、0.966 0、0.989 0、0.988 0、0.979 0、0.993 0、0.982 0、0.995 0、0.991 0、0.977 0、0.988 0、0.946 0、0.989 0、0.945 0、0.984 0、0.985 0、0.996 0、0.974 0、0.992 0、0.980 0、0.959 0、0.990 0、0.994 0、0.973 0、0.988 0、0.992 0。相似度均大于0.90，結(jié)果表明40 批MCSP 基準(zhǔn)樣品整體相似性較好。

圖1 40 批MCSP 基準(zhǔn)樣品HPLC 的疊加指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜 (R)Fig.1 HPLC superimposed fingerprints of 40 batches of MCSP material benchmarks and its control fingerprint (R)

2.2.6 色譜峰指認(rèn)及歸屬 將40 批MCSP 基準(zhǔn)樣品的對(duì)照?qǐng)D譜和各單味藥的供試品溶液以及混合對(duì)照品溶液進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖2。指認(rèn)出其中13 個(gè)共有峰，分別為咖啡酸（7 號(hào)峰）、芍藥內(nèi)酯苷（9號(hào)峰）、芍藥苷（11 號(hào)峰）、阿魏酸（13 號(hào)峰）、甘草苷（15 號(hào)峰）、蕓香柚皮苷（17 號(hào)峰）、柚皮苷（18號(hào)峰）、橙皮苷（19 號(hào)峰）、新橙皮苷（20 號(hào)峰）、橙皮素（22 號(hào)峰）、甘草酸（25 號(hào)峰）、川陳皮素（26號(hào)峰）、去氫木香內(nèi)酯（29 號(hào)峰）。

圖2 混合對(duì)照品和MCSP 樣品的HPLC 圖Fig.2 HPLC of mixed reference substances and MCSP sample

通過(guò)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)大部分單味藥的特征峰可傳遞到全方基準(zhǔn)樣品的對(duì)照譜圖中，見(jiàn)圖3。其中，峰21 歸屬于柴胡；峰7、29 歸屬于木香；峰9、11、14、16 歸屬于赤芍；峰13 歸屬于川芎；峰25、27歸屬于法半夏；峰15、23～25、27、28 歸屬于甘草；峰1、3～5 歸屬于醋香附；峰1～3、5、6、10、16、17、26 為麩炒枳殼與陳皮的共有峰；峰8、12、19、22 歸屬于陳皮；峰18、20 歸屬于麩炒枳殼。砂仁、厚樸花、麩炒白術(shù)在此條件下沒(méi)有色譜信息。可見(jiàn)采用“2.2.2”項(xiàng)下工藝制備MCSP 樣品時(shí)其主要成分從飲片-標(biāo)準(zhǔn)煎液形成較為完整的傳遞，且歸屬關(guān)系較為清晰。

圖3 MCSP 基準(zhǔn)樣品與各單味藥歸屬峰傳遞Fig.3 MCSP material benchmarks and attribution peak transmission of each single herb

2.3 指標(biāo)性成分含量測(cè)定方法的建立

2.3.1 色譜條件

（1）柴胡皂苷A：色譜柱為Waters X Select HSS T3 柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸水溶液，洗脫梯度：0～3 min，0～5%乙腈；3～5 min，5%～22%乙腈；5～25 min，22%～36%乙腈；25～60 min，36%～50%乙腈；60～75 min，50%～25%乙腈；75～90 min，25%～5%乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；體積流量1 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL；柱溫30 ℃。

（2）芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、阿魏酸、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、橙皮素、新橙皮苷、去氫木香內(nèi)酯方法：同“2.2.1”項(xiàng)。

2.3.2 供試品溶液的制備

（1）柴胡皂苷A：精密量取MCSP 基準(zhǔn)樣品10 mL，置分液漏斗中，用水飽和正丁醇提取4 次，每次20 mL，合并濾液，用氨試劑洗至澄清，棄去洗液，蒸干，殘?jiān)舆m量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，靜置，過(guò)0.22 μm 濾膜，檢測(cè)柴胡皂苷A 的含量。

（2）芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、阿魏酸、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、橙皮素、新橙皮苷、去氫木香內(nèi)酯：同“2.2.2”項(xiàng)下制法制備供試品溶液，檢測(cè)芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、阿魏酸、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、橙皮素、新橙皮苷、去氫木香內(nèi)酯的含量。

2.3.3 陰性樣品溶液的制備 按處方量分別稱(chēng)取缺川芎、缺麩炒枳殼陳皮、缺木香、缺赤芍以及缺柴胡陰性處方，按“2.1”項(xiàng)下MCSP 基準(zhǔn)樣品制法制得相應(yīng)的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下制法制備陰性樣品溶液。

2.3.4 對(duì)照品溶液的制備 分別取芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、阿魏酸、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、橙皮素、新橙皮苷、去氫木香內(nèi)酯適量，精密稱(chēng)定，加甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為386.2、399.6、77.2、72.1、213.0、396.8、154.8、157.2、80.8 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液；再稱(chēng)取柴胡皂苷A 適量，精密稱(chēng)定，加甲醇配制成質(zhì)量濃度為613.7 μg/mL 的柴胡皂苷A 對(duì)照品溶液。

2.3.5 單味飲片含量測(cè)定溶液的制備 麩炒枳殼、陳皮、川芎、柴胡、木香以及赤芍含量測(cè)定供試品溶液的制備參照《中國(guó)藥典》2020 年版各項(xiàng)下。

2.3.6 專(zhuān)屬性考察 取“2.3.2”～“2.3.4”項(xiàng)下的供試品溶液、混合對(duì)照品溶液和陰性樣品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下液相色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果如圖4 所示，10 種指標(biāo)成分色譜峰于其相鄰色譜峰之間的分離度良好，各陰性樣品溶液色譜圖在待測(cè)成分出峰位置無(wú)干擾，表明該方法下10 種成分專(zhuān)屬性良好。

圖4 MCSP 基準(zhǔn)樣品、陰性樣品及對(duì)照品的HPLC 圖Fig.4 HPLC of MCSP material benchmark, negative sample, and reference substance

2.3.7 線性關(guān)系考察 取不同質(zhì)量濃度的指標(biāo)性成分對(duì)照品溶液，采用“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算線性回歸方程，結(jié)果分別為柴胡皂苷AY＝1.0×106X－12 375，R2＝0.999 7，線性范圍29.90～477.80 μg/mL；芍藥苷Y＝792 786X－17 584，R2＝0.999 6，線性范圍31.20～499.50 μg/mL；芍藥內(nèi)酯苷Y＝326 798X－7 448.4，R2＝0.999 3，線性范圍30.20～482.80 μg/mL；橙皮苷Y＝906 338X＋604.76，R2＝0.999 5，線性范圍31.00～496.00 μg/mL；柚皮苷Y＝674 948X－5 622.8，R2＝0.999 9，線性范圍41.60～665.50 μg/mL；新橙皮苷Y＝622 048X－1 982.4，R2＝0.999 6，線性范圍30.70～491.30 μg/mL；橙皮素Y＝154 174X＋99.582，R2＝0.999 6，線性范圍30.20～483.80 μg/mL；阿魏酸Y＝2.0×106X－1 148.7，R2＝0.999 6，線性范圍30.10～482.30 μg/mL；蕓香柚皮苷Y＝337 993X－1793，R2＝0.999 5，線性范圍28.20～450.50 μg/mL；去氫木香內(nèi)酯Y＝865 769X－615.74，R2＝0.999 2，線性范圍15.80～252.50 μg/mL；結(jié)果表明指標(biāo)成分在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.8 精密度考察 取MCSP 基準(zhǔn)樣品（S1），按“2.3.2”項(xiàng)下（1）制備供試品溶液1 份，按“2.3.1”項(xiàng)下方法1 色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次；按“2.3.2”項(xiàng)下（2）制備供試品溶液1 份，按“2.3.1”項(xiàng)下方法2 色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，各指標(biāo)成分柴胡皂苷A、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、橙皮素、阿魏酸、蕓香柚皮苷、去氫木香內(nèi)酯峰面積的RSD 值分別為2.06%、0.57%、0.70%、1.22%、0.12%、2.12%、0.78%、1.50%、2.44%、1.56%，均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.3.9 穩(wěn)定性考察 取MCSP 基準(zhǔn)樣品（S1），參照“2.3.2”項(xiàng)下（1）方法制備供試品溶液1 份，按“2.3.1”項(xiàng)下方法1 色譜條件，分別在制樣后0、2、4、8、12、18、24 h 進(jìn)行測(cè)定；參照“2.3.2”項(xiàng)下（2）方法制備供試品溶液1 份，按“2.3.1”項(xiàng)下方法2 色譜條件，分別在制樣后0、2、4、8、12、18、24 h 進(jìn)行測(cè)定，各指標(biāo)成分柴胡皂苷A、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、橙皮素、阿魏酸、蕓香柚皮苷、去氫木香內(nèi)酯峰面積的RSD值分別為1.73%、0.59%、0.65%、0.78%、0.68%、1.44%、0.26%、0.92%、2.13%、1.89%，均小于3%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.10 重復(fù)性考察 取MCSP 基準(zhǔn)樣品（S1），按“2.3.2”項(xiàng)下（1）方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法1 色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)；按“2.3.2”項(xiàng)下（2）方法平行制備供試品溶液6 份，按“2.3.1”項(xiàng)下方法2 色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，各指標(biāo)成分柴胡皂苷A、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、橙皮素、阿魏酸、蕓香柚皮苷、去氫木香內(nèi)酯峰面積的RSD 值分別為1.86%、1.52%、1.25%、1.38%、1.75%、2.47%、1.73%、1.69%、2.57%、1.76%，均小于3%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.11 加樣回收率考察 精密稱(chēng)定已測(cè)知指標(biāo)性成分含量的MCSP 基準(zhǔn)樣品（S1）6 份，分別按已知質(zhì)量濃度的100%加入柴胡皂苷A 對(duì)照品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下（1）制備供試品溶液，并按“2.3.1”項(xiàng)下方法1 進(jìn)樣，檢測(cè)得到柴胡皂苷A 的峰面積，計(jì)算其平均加樣回收率為98.77%，RSD 為1.66%。

精密稱(chēng)定已測(cè)知指標(biāo)性成分含量的MCSP 基準(zhǔn)樣品（S1）6 份，分別按已知質(zhì)量濃度的100%加入對(duì)照品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下（2）制備為供試品溶液，并按“2.3.1”項(xiàng)下方法2 的條件進(jìn)樣檢測(cè)，得到各成分的峰面積，計(jì)算得到芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、阿魏酸、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、去氫木香內(nèi)酯的平均加樣回收率分別為101.46%、102.07%、101.22%、102.57%、101.22%、102.75%、102.33%、102.05%、100.93%，其對(duì)應(yīng)的RSD 值分別為1.40%、0.36%、0.61%、1.43%、1.74%、0.30%、0.98%、1.12%、1.02%。

2.4 MCSP 基準(zhǔn)樣品指標(biāo)成分在飲片-水煎液間的量值傳遞分析

按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行40 批MCSP 基準(zhǔn)樣品中10 個(gè)指標(biāo)性成分的含量測(cè)定，各飲片按照《中國(guó)藥典》2020年版進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。按公式計(jì)算飲片-樣品中各指標(biāo)成分含量的轉(zhuǎn)移率[12]，考察各指標(biāo)性成分傳遞規(guī)律，分析異常值，結(jié)果見(jiàn)表4，不同產(chǎn)地的飲片指標(biāo)性成分含量存在的差異，結(jié)果見(jiàn)表5。

表3 飲片-基準(zhǔn)樣品中的含量及轉(zhuǎn)移率Table 3 Content and transfer rate in herbal piece-benchmark sample

表4 樣品含量及轉(zhuǎn)移率分析Table 4 Sample content and transfer rate analysis

表5 HPLC 測(cè)定MCSP 中6 味飲片在不同產(chǎn)地下的指標(biāo)性成分含量差異Table 5 Differences in content of indicator components of six herbs in MCSP under different origins determined by HPLC

轉(zhuǎn)移率＝wm/WM

w表示基準(zhǔn)樣品中有效成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，m表示基準(zhǔn)樣品質(zhì)量，W表示飲片中有效成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，M表示飲片量

2.5 基于PCA 及因子分析對(duì)多批次飲片含量比較

PCA 是一種非監(jiān)督的多元統(tǒng)計(jì)分析方法，可將多個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)換為少數(shù)幾個(gè)主成分，在不丟失太多信息的基礎(chǔ)上，通過(guò)線性變換，將原始眾多相關(guān)性的指標(biāo)重新組合成新的相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)（主成分）來(lái)代替原始指標(biāo)充分反映原始數(shù)據(jù)的信息[13-14]，進(jìn)一步構(gòu)建因子模型，通過(guò)降維將少數(shù)具有代表性的綜合因子詮釋全部變量，將關(guān)系變量進(jìn)行整理、歸納，從而揭示影響指標(biāo)的最大因素。

為了進(jìn)一步闡明MCSP 樣品中各化學(xué)成分的差異，在多成分定量分析的基礎(chǔ)上，采用PCA 及因子分析進(jìn)一步深化研究，以所測(cè)定的10 個(gè)指標(biāo)性成分的含量作為變量，導(dǎo)入至SIMCA 軟件進(jìn)行分析與比較，結(jié)果見(jiàn)圖5。繼而將含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，導(dǎo)入SPSS 26.0 軟件進(jìn)行因子分析，其中KMO 與Bartlett 球形檢驗(yàn)是檢驗(yàn)因子分析適用性的相關(guān)測(cè)試，一般情況下，KMO＞0.6 即可接受因子分析，本研究中，KMO 值為0.632 0，Bartlett 球形檢驗(yàn)是用來(lái)判斷相關(guān)矩陣是否為單位矩陣，如果為單位矩陣，表示各變量互相獨(dú)立，不適合做因子分析，其顯著水平值需要在0.05 以下，值越小表明原始變量之間的相關(guān)矩陣越不可能是單位矩陣，越適合做因子分析，本研究中Bartlett 球形檢驗(yàn)的顯著水平值為0.001（遠(yuǎn)小于0.05），表明數(shù)據(jù)可以進(jìn)行因子分析，具體見(jiàn)表6。以累積貢獻(xiàn)率＞80%作為判定依據(jù)，提取到6 個(gè)成分，其累積方差貢獻(xiàn)率為83.444%，表明這6個(gè)主成分可以代表83.444%的共有峰信息，因此可作為基準(zhǔn)樣品質(zhì)量的評(píng)價(jià)指標(biāo)。初始特征值和方差貢獻(xiàn)率見(jiàn)表7。

圖5 MCSP 樣品PCA 得分圖Fig.5 PCA scores plot of MCSP samples

表6 KMO 和Bartlett 球形度檢驗(yàn)結(jié)果Table 6 KMO and Bartlett sphericity test results

表7 特征值和方差貢獻(xiàn)率Table 7 Characteristic value and variance contribution rate

表8 主成分因子載荷矩陣Table 8 Principal component factor loading matrix

用Kaiser 標(biāo)準(zhǔn)化最大方差法處理得到旋轉(zhuǎn)成分矩陣，結(jié)果見(jiàn)表8。根據(jù)各色譜峰在6 個(gè)主成分上的載荷值，可提取出每個(gè)主成分所反映的信息。在主成分1 中蕓香柚皮苷、橙皮苷、橙皮素是對(duì)第1主成分影響較大的特征向量，主要與陳皮有關(guān)；阿魏酸和柚皮苷是對(duì)第2 主成分影響較大的特征向量，主要與川芎、麩炒枳殼有關(guān)；芍藥內(nèi)酯苷是對(duì)第3 主成分影響較大的特征向量，主要與赤芍有關(guān)；而第4 主成分與柴胡皂苷A 呈高度正相關(guān)，是對(duì)其影響較大的特征向量，主要與柴胡有關(guān)；對(duì)第5 主成分影響較大的特征向量是去氫木香內(nèi)酯；對(duì)第6主成分影響較大的特征向量是芍藥苷，主要與赤芍有關(guān)。

選用6 個(gè)主成分因子對(duì)40 批MCSP 基準(zhǔn)樣品進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以累積方差貢獻(xiàn)率為分配系數(shù)，計(jì)算各批次樣品主成分因子得分及綜合得分，并對(duì)綜合得分進(jìn)行排序，建立一種客觀的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)手段，結(jié)果見(jiàn)表9。綜合得分（F）公式[15]：F＝方差貢獻(xiàn)率×相應(yīng)的因子得分＝0.291 4F1＋0.153 6F2＋0.121 3F3＋0.099 9F4＋0.085 6F5＋0.082 4F6（F1～F6分別為主成分1～6 得分）。對(duì)綜合得分排名前10的批次進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，麩炒枳殼以產(chǎn)地江西的批次占地居多，赤芍以?xún)?nèi)蒙古產(chǎn)地的居多，木香以云南產(chǎn)地的居多，川芎以四川彭山的居多，而陳皮與柴胡4 個(gè)產(chǎn)地平均分布，考慮這2 味飲片在市面上產(chǎn)地復(fù)雜，后期會(huì)增加批次，進(jìn)一步細(xì)化分析，這也為選拔優(yōu)質(zhì)藥材提供理論依據(jù)，為制劑開(kāi)發(fā)提供更全面的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

表9 40 批MCSP 的主成分因子得分及綜合排序Table 9 Principal component factor scores and comprehensive ranking of 40 batches of MCSP

3 討論

3.1 色譜條件分析

本研究前期考察了不同提取溶劑的色譜信息，當(dāng)70%甲醇作為溶劑時(shí)，圖譜中色譜峰信息最豐富；各溶劑譜圖的色譜信息豐富度依次為70%甲醇＞50%甲醇＞90%甲醇＞純甲醇＞50%乙醇＞70%乙醇＞95%乙醇＞無(wú)水乙醇。考察不同超聲時(shí)長(zhǎng)：5、10、15、20、30 min，發(fā)現(xiàn)15 min 以后指標(biāo)性成分峰面積趨于穩(wěn)定。依據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)[16]，考慮到全方中極性較大的皂苷類(lèi)、黃酮類(lèi)成分較多，先后考察了甲醇、乙腈、不同比例的磷酸水相等因素，最后選用乙腈-0.2%磷酸水溶液為洗脫劑，以保證峰形的對(duì)稱(chēng)和平滑。綜合考察結(jié)果確定前處理方法為取MCSP 樣品1 mL，加入70%甲醇，超聲15 min 后定容至5 mL，濾過(guò)。該方法保證了本研究過(guò)程的科學(xué)性與可靠性，也為類(lèi)似方劑的研究提供了參考。

3.2 指標(biāo)成分的選擇

本研究前期對(duì)MCSP 基準(zhǔn)樣品進(jìn)行200～400 nm 全波長(zhǎng)掃描，比較分析不同波長(zhǎng)條件下的峰數(shù)目、峰形、分離度等參數(shù)。發(fā)現(xiàn)在254 nm 處飲片中指標(biāo)性成分的特征峰信息豐富且分離度較好，為了更好的體現(xiàn)飲片中指標(biāo)性成分的特征峰信息，選取254 nm 對(duì)MCSP 樣品指紋圖譜進(jìn)行考察，但柴胡皂苷類(lèi)成分經(jīng)過(guò)富集后在210 nm 處才有較大吸收，考慮其在本方中處于君藥的地位，且柴胡皂苷類(lèi)成分也具有明確的藥理作用[17-18]，故參考相關(guān)文獻(xiàn)增加其含量測(cè)定方法[19-20]，考察其傳遞規(guī)律，依據(jù)不同萃取次數(shù)后柴胡皂苷含量的變化，最后確定以水飽合正丁醇萃取4 次的方法進(jìn)行研究，因此本實(shí)驗(yàn)選擇210、254 nm 作為研究全方中多成分含量的檢測(cè)波長(zhǎng)。

通過(guò)對(duì)各單味藥飲片的單煎液與全方的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)大部分單味藥的特征峰可傳遞到全方中，其中以麩炒枳殼與陳皮居多，其次是甘草、赤芍、醋香附、法半夏，木香、川芎、柴胡。因本研究采用了水煎煮的制備方法，臣藥之一香附因其揮發(fā)性成分較多，而本方并未進(jìn)行揮發(fā)油或蒸餾液的收集，故在基準(zhǔn)樣品中未檢測(cè)到α-香附酮，這也說(shuō)明從水煎液-基準(zhǔn)樣品的制備過(guò)程中，揮發(fā)油類(lèi)成分有損失，且高效液相色譜儀有一定的檢測(cè)限，故未能檢測(cè)出相應(yīng)成分[21]，后續(xù)研究中將引入氣相技術(shù)，構(gòu)建更加完整的指紋圖譜，揭示以臣藥醋香附為代表的多個(gè)含有揮發(fā)性成分飲片的量值傳遞特征[22]。其次由于法半夏的炮制工藝需要用到甘草，液相中峰形較好且可指認(rèn)的峰與甘草重復(fù)，半夏本身的成分在此方法下并未發(fā)現(xiàn)故未對(duì)法半夏深入研究，而甘草的臨床使用目的是用于調(diào)和諸藥，故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中也未將其納入計(jì)劃。

綜合全方HPLC 指紋圖譜以及藥典相關(guān)規(guī)定，選擇柴胡、赤芍、川芎、麩炒枳殼、陳皮、木香6 味以其所含芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、阿魏酸、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、橙皮素、新橙皮苷、去氫木香內(nèi)酯、柴胡皂苷A 等具有明確藥理活性的成分作為指標(biāo)性成分進(jìn)行定量考察[23-27]。

3.3 量值傳遞研究

通過(guò)指紋圖譜量值傳遞研究發(fā)現(xiàn)，除主要藥效成分為揮發(fā)油的厚樸花、麩炒白術(shù)、砂仁、醋香附這幾味藥外[28-30]，大部分飲片的特征峰在飲片與基準(zhǔn)樣品間可以較為完整地傳遞。其中赤芍中指標(biāo)性成分為芍藥內(nèi)酯苷以及芍藥苷，其樣品含量以及轉(zhuǎn)移率均在平均值的70%～130%，未出現(xiàn)離散數(shù)據(jù)，說(shuō)明該藥物在全方中量值傳遞穩(wěn)定，且2 個(gè)產(chǎn)地成分含量相似；川芎中指標(biāo)性成分為阿魏酸，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.24～34.49 mg/g，木香中的指標(biāo)性成分為去氫木香內(nèi)酯，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為42.55～81.05 mg/g，大部分批次符合±30%的波動(dòng)幅度，結(jié)合圖5 可知這2 味飲片在不同產(chǎn)地不同批次的情況下含量也很穩(wěn)定，分析其偏差數(shù)據(jù)出現(xiàn)的原因可能是因?yàn)榧鍎┮自谶^(guò)濾時(shí)少許沉淀附著在篩網(wǎng)上產(chǎn)生些許損耗，導(dǎo)致一些成分含量降低，后續(xù)會(huì)進(jìn)一步增加批次，細(xì)化研究，減少誤差與偶然性[31]；麩炒枳殼、陳皮作為同科飲片[32-33]，其成分相似，麩炒枳殼中特征性成分主要是蕓香柚皮苷、柚皮苷以及新橙皮苷，陳皮中主要為蕓香柚皮苷、橙皮苷與橙皮素，因蕓香柚皮苷是共有成分，故其偏差較大，成分含量離散值較多，其余4 個(gè)成分含量大多符合±30%范圍，分析原因可能是從藥材到飲片的炮制、儲(chǔ)藏過(guò)程中存在雜質(zhì)，水分過(guò)多或過(guò)少導(dǎo)致，繼而導(dǎo)致部分轉(zhuǎn)移率的偏差，考慮是否根據(jù)實(shí)際情況將不同產(chǎn)地不同批次的飲片勾兌后投料，確保后續(xù)飲片和制劑質(zhì)量的均一和穩(wěn)定；柴胡作為君藥[34-35]，其主要化學(xué)成分為皂苷、黃酮、揮發(fā)油等，不同產(chǎn)地的柴胡中柴胡皂苷A 含量差距較大，陜西＞山西＞河北＞湖北，因此建議對(duì)不同產(chǎn)地成分進(jìn)行具體分析，以減少誤差。

針對(duì)制劑的開(kāi)發(fā)研究，決定其性能穩(wěn)定療效突出的關(guān)鍵在于突破基準(zhǔn)樣品的質(zhì)量控制技術(shù)以及通過(guò)研究飲片-基準(zhǔn)樣品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性在不同環(huán)節(jié)間的量值傳遞規(guī)律，才能不斷提高中藥的質(zhì)量控制水平[36]，本實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的轉(zhuǎn)移率大部分都在其均值的±30%范圍內(nèi)，總結(jié)原因可能是不同產(chǎn)地不同批次的藥材在制備過(guò)程中受煎煮環(huán)境、儲(chǔ)藏環(huán)境等因素影響導(dǎo)致指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率相差較大，后期制劑生產(chǎn)可考慮適當(dāng)剔除部分批次轉(zhuǎn)移率過(guò)低的飲片或采用混批投料方式來(lái)保證量值傳遞的均一性。后續(xù)研究將進(jìn)一步增加基準(zhǔn)樣品研究產(chǎn)地與批次，以期建立更加具有代表性的基準(zhǔn)樣品相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[37]。

4 結(jié)論

經(jīng)典名方是中醫(yī)藥傳承與發(fā)展的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，研發(fā)改進(jìn)經(jīng)典名方不僅滿(mǎn)足現(xiàn)代的用藥需求，還能推動(dòng)中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展。但是經(jīng)典名方的研究面臨諸多問(wèn)題，如藥材溯源、劑量折算、臨床效果等[38]。因而建立中藥全產(chǎn)業(yè)鏈的品質(zhì)傳遞過(guò)程關(guān)鍵評(píng)價(jià)技術(shù)體系是目前保障中藥質(zhì)量和療效的關(guān)鍵[39]。MCSP 是在經(jīng)典名方柴胡疏肝散的基礎(chǔ)上進(jìn)行的改進(jìn)，本研究建立了MCSP 基準(zhǔn)樣品的指紋圖譜，首先對(duì)其進(jìn)行相似度分析，再根據(jù)色譜峰歸屬，將29個(gè)共有峰歸屬于9 味飲片，并指認(rèn)出13 個(gè)化學(xué)成分。利用指紋圖譜，建立多指標(biāo)含量測(cè)定方法，結(jié)合轉(zhuǎn)移率、化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)MCSP 的量值傳遞過(guò)程進(jìn)行研究分析，初步建立了科學(xué)穩(wěn)定的基準(zhǔn)樣品質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，以期為MCSP 的后續(xù)開(kāi)發(fā)及相關(guān)制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。同時(shí)，本研究所測(cè)定的10 個(gè)指標(biāo)成分，來(lái)源于6 味飲片，其中9 個(gè)指標(biāo)成分所歸屬的5 味飲片屬于經(jīng)典名方柴胡疏肝散，因此本研究也在一定程度上揭示了柴胡疏肝散中部分成分的量值傳遞關(guān)系，也為柴胡疏肝散的進(jìn)一步研究打下了基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突