基于熵權-TOPSIS 模型結合特征圖譜的蜜麩枳殼原料產地優選及質量標準提升研究

萬 理，祝 婧*，楊 明，諶瑞林, ，陳 泣，易炳學，羅 薏

1.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004

2.江西江中中藥飲片有限公司，江西 九江 332300

枳殼AurantiiFructus為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實，有行氣健脾、寬中除脹的功效。生品辛燥峻烈，易傷津液[1]，南方古藥幫以蜜麩炒法炮制枳殼，可綜合輔料煉蜜潤燥補中，麥麩減燥賦色作用，以達減燥增效之功[2]。前期研究表明，較之目前臨床主流炮制品種枳殼、麩炒枳殼，蜜麩枳殼作用更強，燥性更緩和，蜜麩枳殼為枳殼優勢炮制飲片品種[3]。

蜜麩枳殼為地方特色飲片品種，歷代藥典均未收載，僅被《上海市中藥飲片炮制規范》及《湖北省中藥飲片炮制規范》收載。目前，存在現行標準較低、缺乏特征性質量控制指標等問題，不能全面、綜合地控制飲片質量，同時也限制了在全國范圍的推廣使用。基于此，明確蜜麩枳殼特征性質量控制指標，對蜜麩枳殼飲片產業化生產過程中質量控制具有重要意義。為更加全面地控制蜜麩枳殼飲片質量，保障臨床藥效，本研究參考《中國藥典》2020年版一部枳殼項下方法對18 批蜜麩枳殼各質控指標進行測定，新增醇溶性浸出物指標并建立了蜜麩枳殼特征圖譜，為蜜麩枳殼專屬性質量標準的制定提供科學依據。

熵權-逼近理想解排序法（technique for order preference by similarity to ideal solution，TOPSIS）法模型是一種多指標決策法，相較層次分析法（analytic hierarchy process，AHP）、Z 分法、聚類分析等方法，具有較強的客觀性，可提高多目標決策分析的科學性和準確性[4]，常用于中藥飲片綜合質量評價研究。枳殼作為一種常用的中藥材，其產地眾多且來源廣泛。然而不同地區的枳殼質量存在一定差異[5]，這直接影響蜜麩枳殼飲片的質量。因此，本研究結合熵權-TOPSIS 法對不同產地批次蜜麩枳殼質量進行綜合評價，反向溯源篩選出優勢原料產地，為蜜麩枳殼道地藥材的推廣提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Yf-111B 型中藥粉碎機，瑞安市永歷制藥機械有限公司；GZX-9076MBE 型電熱鼓風干燥箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；HH-6 型數顯恒溫水浴鍋，國華電氣有限公司；Waters e2695 型高效液相色譜儀，美國Waters 公司；BX53+DP73 型正置顯微鏡，日本Olympus 公司；CP214 型萬分之一天平，美國Ohaus 公司。

1.2 試劑

對照品柚皮苷（批號CHB201202）、新橙皮苷（批號CHB201120），質量分數均≥98%，均購自成都克洛瑪生物科技有限公司。甲醇（美國Tedia 試劑有限公司）及磷酸（阿拉丁試劑）為色譜純，甲醇、乙醇、三氯甲烷試劑（均為西隴科學股份有限公司）、三氯化鋁（阿拉丁試劑）為分析純，水為娃哈哈純凈水。18 批枳殼購自江西江中中藥飲片有限公司，經江西中醫藥大學中藥炮制教研室龔千鋒教授鑒定為蕓香科植物酸橙C.aurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實，產地信息見表1。

表1 枳殼產地信息Table 1 Origin information of Aurantii Fructus

2 方法與結果

2.1 蜜麩枳殼的制備

稱取一定量煉蜜，加入水（水-煉蜜42∶100），拌勻，倒入麥麩中（蜜水-麥麩30∶100），攪拌均勻，烘干，得蜜麩[6]。將蜜麩均勻撒布于熱鍋中，待煙起后投入枳殼，炒至枳殼顏色加深至切面色澤微黃時，迅速出鍋，冷卻后篩去蜜麩，即得。

2.2 蜜麩枳殼的鑒別

2.2.1 顯微鑒別 參照《中國藥典》2020 年版一部枳殼中顯微鑒別方法進行鑒別，結果見圖1。可見本品粉末呈黃色，中果皮細胞呈類圓形或不規則形狀，汁囊組織呈淡黃色，可見草酸鈣方晶及分泌物，導管多為螺紋導管，較少見網紋導管，草酸鈣方晶較多。

圖1 蜜麩枳殼顯微特征Fig.1 Microscopic characteristics of honey bran Aurantii Fructus

2.2.2 薄層鑒別 參照《中國藥典》2020 年版一部枳殼中薄層鑒別及四部通則0502 薄層色譜法對18批蜜麩枳殼進行薄層鑒別，結果見圖2。18 批蜜麩枳殼供試品與對照品熒光斑點顏色相同。

圖2 18 批蜜麩枳殼薄層鑒別Fig.2 Thin layer identification of 18 batches of honey bran Aurantii Fructus

2.3 蜜麩枳殼的水分、總灰分和醇溶性浸出物檢查

2.3.1 水分 參照《中國藥典》2020 年版四部通則0832 水分測定法項下甲苯法進行測定，計算蜜麩枳殼中含水量，結果見表2。18 批蜜麩枳殼水分含量為4.80%～7.13%，平均含量為6.16%。

表2 18 批蜜麩枳殼的水分、總灰分、醇溶性浸出物、色度、柚皮苷、新橙皮苷及與特征圖譜相似度的測定Table 2 Determination of moisture, total ash, alcoholic leachate, chromaticity, and naringin, neohesperidin contents, and similarity to characteristic profiles of 18 batches of honey bran Aurantii Fructus

2.3.2 總灰分 參照《中國藥典》2020 年版四部通則2302 灰分測定法進行測定，計算蜜麩枳殼中總灰分含量，結果見表2。18 批蜜麩枳殼總灰分含量為3.61%～4.35%，平均含量為3.97%。

2.3.3 醇溶性浸出物 參照《中國藥典》2020 年版四部通則2201 浸出物測定法項下熱浸法進行測定，計算蜜麩枳殼醇溶性浸出物含量，結果見表2。18批蜜麩枳殼醇溶性浸出物含量為26.65%～35.62%，平均含量為31.74%。

2.4 蜜麩枳殼的色度測定

在色差儀中L*、a*、b*是該物體的色空間坐標，代表物體顏色的色度值，其中L*代表明暗度，其值越大，表明越亮；a*表示從紅到綠色的范圍，其值越大，表明顏色越紅；b*表示從藍色到黃色的范圍，其值越大，說明顏色越黃。Eab*為總色度值，由L*、a*、b*值計算可得[7]。取一定量蜜麩枳殼粉末（過3號篩），置于測量槽中，將色差儀設定到標樣測量界面，測量獲得標樣樣品的L*、a*、b*值，計算總色值［Eab*，Eab*＝(L*2＋a*2＋b*2)1/2］；按上述方式每組樣品平行測量3 次，取其平均值為每組蜜麩枳殼試樣的顏色數據，結果見表2。18 批蜜麩枳殼色度值Eab*為70.31～77.07，平均值為72.72。

2.5 含量測定

2.5.1 含量測定及方法學考察 參照《中國藥典》2020 年版枳殼項下含量測定方法[1]對18 批蜜麩枳殼柚皮苷和新橙皮苷含量進行測定，結果見圖3 和表2。18 批蜜麩枳殼柚皮苷、新橙皮苷平均質量分數分別為6.52%和5.09%。并進行了方法學考察，其中精密度RSD 分別為1.57%、1.55%，穩定性RSD分別為2.85%、2.61%，重復性RSD 分別為1.83%、1.66%，加樣回收實驗中平均回收率分別為98.33%、100.83%，RSD 分別為0.83%、2.83%。

圖3 柚皮苷和新橙皮苷對照品溶液 (A, B) 和蜜麩枳殼樣品溶液 (C) 的HPLC 圖Fig.3 HPLC of naringin and neohesperidin reference substances (A, B) and honey bran Aurantii Fructus sample solutions (C)

2.5.2 線性關系考察 精密稱取柚皮苷和新橙皮苷對照品適量，加入甲醇，配制并稀釋為6 個不同質量濃度的溶液，各質量濃度對照品溶液進樣1 次，每次10 μL，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，進行線性回歸，得回歸方程：柚皮苷Y＝15 699 877.62X－29 581.05，R2＝0.999 4；新橙皮苷Y＝17 807 823.92X－30 125.50，R2＝0.999 7；結果表明柚皮苷線性范圍為45.63～456.30 μg/mL，新橙皮苷線性范圍為20.43～204 30.00 μg/mL。

2.6 特征圖譜研究

2.6.1 供試品溶液的制備 取蜜麩枳殼粗粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，加熱回流1.5 h，濾過，濾液置于50 mL 量瓶中，定容，即得供試品溶液。

2.6.2 對照品溶液的制備 取適量柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、川陳皮素、橙皮素、橘紅素、柚皮黃素、去甲基川陳皮素對照品，精密稱定，置10 mL量瓶中，加入甲醇溶解，配制成混合對照品溶液。

2.6.3 色譜條件 色譜柱為Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動相，進行梯度洗脫：0～10 min，20%～30%甲醇；10～25 min，30%～40%甲醇；25～45 min，40%～65%甲醇；45～55 min，65%～85%甲醇；55～60 min，85%～100%甲醇；檢測波長320 nm；柱溫35 ℃；進樣量10 μL。

2.6.4 精密度試驗 精密吸取供試品溶液（S2），按“2.6.3”項下色譜條件重復進樣6 次，以峰6 為參照峰，保留時間及峰面積RSD 均小于3%。

2.6.5 穩定性試驗 取供試品溶液（S2），分別于制備后0、2、4、8、12、24 h 進樣分析，以峰6 為參照峰，保留時間及峰面積RSD 均小于3%。

2.6.6 重復性試驗 取蜜麩枳殼粉末（S2），按“2.6.1”項下方法平行制備6 次，并進樣分析，以峰6 為參照峰，保留時間及峰面積RSD 均小于3%。

2.6.7 特征圖譜的建立及相似度評價 取蜜麩枳殼粉末（S1～S18），制備供試品溶液，并按“2.6.3”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。將所得18 批樣品的色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件（2012 130723）版本進行分析。設S1 為參照圖譜，采用中位數法，建立特征圖譜；運用多點校正Mark 峰匹配，建立蜜麩枳殼飲片的特征圖譜并計算相似度。18 批蜜麩枳殼（S1～S18）得15 個共有峰，相似度在0.971～0.999，平均值為0.986，結果見圖4 和表2。

圖4 18 批蜜麩枳殼樣品 (S1～S18) 的特征圖譜疊加圖和對照特征圖譜 (R)Fig.4 Overlaypping HPLC characteristic chromatogram of 18 batches of samples (S1—S18) and comparison feature map (R)

2.6.8 蜜麩枳殼共有峰成分指認 對18 批蜜麩枳殼飲片共有峰進行指認，通過與對照品對比，共指認出7 個共有峰，其中6 號峰為柚皮苷，7 號峰為橙皮苷，8 號峰為新橙皮苷，11 號峰為橙皮素，12號峰為川陳皮素，13 號峰為甜橙黃酮，15 號峰為橘紅素。混合對照品HPLC 圖譜見圖5。

圖5 混合對照品色譜圖Fig.5 HPLC of mixed reference substances

2.6.9 聚類分析 對18 批蜜麩枳殼共有峰進行分析，將結果導入SPSS 21.0 中，以系統聚類法進行分析。結果（圖6）發現，當聚類距離為6 時，可聚為4 類，S14～S17（湖南）為一類，S1～S5、S7（江西）為一類，S8～S13（四川）為一類，S6（江西宜春）、S18（浙江衢州）為一類。以上結果表明聚類分析可在一定程度上區分不同產地蜜麩枳殼，聚類效果良好。其中S6 產地數據偏離度較高，推測可能與采收時間、氣候、儲存等因素有關。

圖6 18 批蜜麩枳殼聚類分析圖Fig.6 Cluster analysis of 18 batches of honey bran Aurantii Fructus

2.6.10 正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLSDA） 將蜜麩枳殼15 個共有峰峰面積數據導入至SIMCA 14.0 軟件中，進行監督模式下的OPLS-DA，建立模型，結果見圖7。結果發現，4 個道地產區的樣品均可各自聚為一類，該結果與聚類分析結果基本一致；以投影變量重要性（variable importance for the projection，VIP）＞1 為條件篩選差異性化合物，結果見圖8，即在15 個成分中，篩選出新橙皮苷、峰10、橙皮素、川陳皮素、峰9、峰5 共6 個差異性成分。

圖7 OPLS-DA 得分散點圖Fig.7 Scatterplot of OPLS-DA scores

圖8 各成分VIP 值Fig.8 VIP value of each component

2.7 質量標準提升建議

基于上述研究結果，對蜜麩枳殼質量標準提出以下提升建議：以《中國藥典》2020 年版枳殼項下各檢測指標為基礎，增加醇溶性浸出物和特征圖譜。根據規定[8]，以各項指標結果平均值為基準，上下浮動20%：暫定本品水分含量不超過8.0%，總灰分含量不超過5.0%，醇溶性浸出物含量不低于25%，色度值范圍以Eab*計為58.176～87.364，柚皮苷、新橙皮苷質量分數不低于5.2%、4.1%，特征圖譜相似度不低于0.80。

2.8 熵權分析[9]

2.8.1 無量綱處理 對18 批蜜麩枳殼的質量控制指標進行數據標準化，其中醇溶性浸出物、柚皮苷及新橙皮苷含量、特征圖譜相似度越大越優，為正向指標，按公式（1）計算；水分、灰分越小越優，為負向指標，按公式（2）計算；色度為范圍值，是適度指標，按公式（3）計算。Xij為第i批次樣品中j指標試驗值，mj為該組試驗值中的最小值，Mj為該組試驗值中的最大值。結果見表3。

bbest為確定的標準值

2.8.2 消零處理 由于無量綱化處理后數據最小值為0，為使數據運算處理有意義，需將數據正向平移，進行消零處理，按公式（4）計算。α為最接近試驗值Xij的最小值，為保證數據準確性，取α＝0.000 1。

2.8.3 熵權計算 計算各批次蜜麩枳殼的指標值占全部品種指標值之和的特征比重（Pij）。Pij為第i批次樣品在j評價指標下的概率，m為樣品數。

計算各項指標的信息熵（ej），按公式（6）計算，結果見表4。

計算各項指標差異系數（gj），按公式（7）計算，結果見表4。

計算各項指標的熵權（Wj），按公式（8）計算。n為指標數，結果見表4。

2.8.4 確定矩陣（Z）的最優向量（Z+）和最劣向量（Z?） 在熵權法的基礎上，利用計算出的評價指標熵權，構造規范化加權矩陣，并計算每個評價對象的Z+和Z?。結果見表5。

2.8.5 計算相對接近度 通過計算加權決策矩陣的Z+和Z?，使用歐氏距離計算公式（11）計算每個方法的正理想解（Di+）和負理想解（Di?）。運用Ai＝Di?/(Di+＋Di?)計算最優解的相對接近度（Ai），相對接近度越大表明評價質量越優，最終確定18 批蜜麩枳殼飲片的質量優劣綜合排序，結果見表5。在熵權-TOPSIS 中，各批次的Ai得分為0.272 7～0.702 0，批次S17（湖南沅江）樣品的Ai得分最高，評為最佳對象，表明該產地蜜麩枳殼綜合質量最佳；樣品S3（江西豐城）的Ai得分最低。

3 討論

3.1 指標成分的選擇

現代研究表明，柚皮苷有抗炎、抗氧化活性，對高血壓、糖尿病、骨質疏松、胃潰瘍、潰瘍性結腸炎等多種疾病均有療效[10]；新橙皮苷具多種生物活性，如抗炎[11]、抗過敏[12]、抗腫瘤[13]、促細胞分化[14]、促胃腸動力[15]等；以上生物活性與蜜麩枳殼促胃腸動力等作用相符。柚皮苷、新橙皮苷為《中國藥典》2020 年版規定的指標性成分，故本課題組最終選擇二者作為蜜麩枳殼含量的指標成分。

3.2 特征圖譜分析

課題組前期研究表明，較目前臨床主流炮制品種枳殼、麩炒枳殼，蜜麩枳殼寬中除脹作用更強，燥性更緩和[16]。目前對蜜麩枳殼的研究多聚焦于藥理藥效等方面，對蜜麩枳殼質量標準規范較為缺失，且未建立專屬性鑒別方法。

特征圖譜技術在中藥質量控制方面具有十分重要的作用，一定程度上反映中藥從原藥材到中藥飲片到中成藥生產全過程的質量傳遞情況[17]，主要用于評價中藥材以及中藥飲片質量的真實性、優良性和穩定性[18]。本實驗收集了4 大道地產區多批次枳殼，通過炮制得蜜麩枳殼，并建立了蜜麩枳殼特征圖譜。得到了15 個共有峰，并指認了柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陳皮素、甜橙黃酮、橘紅素共7 個峰。這些成分均具有廣泛的生物活性及藥效作用，其中柚皮苷與新橙皮苷為枳殼主要藥效成分，橙皮苷、川陳皮素有抗炎、抗癌、抗氧化、抗病毒等多種活性[19]，甜橙黃酮有抗菌、抗肥胖、抗癡呆和血管松弛活性等作用[20]，橘紅素具有抗炎、抗腫瘤、保肝和神經保護等活性[21]。通過聚類及OPLS-DA 結果可知，18 批蜜麩枳殼可聚為4 類，結果與原料來源產區相符合。其中S6（江西宜春）與其他產地距離較大，這種差異可能與采收時間、當地氣候等因素有關。

3.3 綜合質量評價結果分析

熵權法可根據指標信息熵的大小對指標客觀賦值[22]，TOPSIS 法能充分利用原始數據的信息，精確地反映各樣本之間的差距。二者相結合可實現基于多種指標的中藥飲片的綜合性評價[23]，可極大地排除人工主觀干擾因素，具有較強的客觀性和科學性。因此，課題組選擇熵權-TOPSIS 模型結合各項指標，對18 批不同產地蜜麩枳殼質量進行綜合分析。結果表明，18 批蜜麩枳殼中湖南沅江排名最高，表明其綜合質量最好。4 大產區排名分別為江西為2、3、5、13、14、16、18，四川為6、10、11、12、15、17，湖南為1、4、9、10 浙江排名7。綜合上述結果，湖南產區枳殼綜合質量較好，其中以湖南沅江綜合質量最優，推薦以湖南沅江產枳殼為蜜麩枳殼生產原料。

4 結論

傳統蜜麩枳殼質量評價，常直接套用《中國藥典》中枳殼的指標限度，難以全面真實的反應蜜麩枳殼飲片質量。因此，本研究以中藥飲片工業化生產需求為導向，基于工業化生產實際環境炮制加工得到不同批次蜜麩枳殼，以藥典法對不同批次蜜麩枳殼的相關指標進行測定，同時新增醇溶性浸出物及色度指標，并建立特征圖譜，填補了蜜麩枳殼缺乏特征性質控指標的空白。此外，本研究還采用熵權-TOPSIS 法為各指標賦值，建立了蜜麩枳殼質量綜合評價方法，此方法專屬性強，操作準確簡便，為蜜麩枳殼專屬性質量標準的建立奠定了基礎。

中藥具有“一藥多效”的特點，因而僅憑測定某一特征成分的含量來控制其質量缺乏科學性，蜜麩枳殼有效成分多為黃酮和黃酮苷類等醇溶性成分，測定蜜麩枳殼醇溶性浸出物含量可較好的反應蜜麩枳殼有效成分的多寡；枳殼經蜜麩炒制后顏色加深，已有研究證實飲片炮制過程中飲片表征顏色變化與內在成分的變化具有關聯性[24]；中藥飲片經炮制后內在成分類別及含量均發生一定變化，一般技術難以實現生制飲片精準鑒別，借助中藥特征圖譜整體性的特點，可較全面的反應蜜麩枳殼成分特征。因此，本研究在《中國藥典》2020 年版指標項的基礎上增加了蜜麩枳殼醇溶性浸出物及粉末色度指標，建立特征圖譜。

本研究基于熵權-TOPSIS 模型，在結合《中國藥典》2020 年版各質控指標的基礎上，創新性加入了醇溶性浸出物、色度、特征圖譜及相似度指標，并首次建立了蜜麩枳殼多指標質量綜合性評價方法，篩選出了優勢道地原料產地，為蜜麩枳殼質量評價體系的建立提供科學依據及參考，對枳殼道地藥材推廣具有積極意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突