紫蘇葉HPLC 指紋圖譜建立及其抗流感病毒活性譜效關系研究

劉振杰，丘海芯，甘金月，奉建芳，唐紅珍，譚小青，楊海玲,

1.廣西優勢中成藥與民族藥開發工程技術研究中心，廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530299

2.廣西中藥質量標準研究重點實驗室，廣西壯族自治區中醫藥研究院，廣西 南寧 530022

3.安徽醫學高等專科學校，安徽 合肥 230601

紫蘇Perillafrutescens(L.) Britt.為唇形科一年生草本植物，收載于《中國藥典》[1]、《名醫別錄》[2]等，別名桂荏、白蘇、赤蘇、紅蘇、黑蘇、白紫蘇、青蘇、蘇麻、水升麻等，分布于中國、不丹、印度、印度尼西亞、日本、朝鮮，在中國各地廣泛栽培[3]。紫蘇可供藥用和香料用。其不同入藥部位紫蘇葉、紫蘇梗、紫蘇子均被《中國藥典》收載，其中紫蘇葉有解表散寒、行氣和胃的作用，紫蘇梗有理氣寬中、止痛、安胎等作用，紫蘇子有降氣化痰、止咳平喘、潤腸通便等作用[1]。現代研究表明，紫蘇葉中含有揮發油、黃酮、酚酸類等化學成分[4-8]。藥理研究表明，紫蘇葉具有抗炎[9-10]、抗氧化[11-13]、抗抑郁[14-15]、抗病毒[16-17]等效果。

流感病毒神經氨酸酶（neuraminidase，NA）是流感病毒復制、感染和致病的關鍵酶，通過抑制NA的活性，可以有效地緩解流感癥狀，降低病毒復制和傳播風險，因此，NA 活性熒光檢測法成為抗流感病毒藥物篩選的重要方法[18]。查閱文獻未見紫蘇葉化學模式識別和抗流感病毒活性生物效價的報道。基于此，本實驗將建立不同產地紫蘇葉指紋圖譜，并采用超高效液相色譜-三重四級桿飛行時間質譜聯用（UPLC-Q-TOF-MS/MS）對紫蘇葉化學成分進行表征，鑒定化學成分，應用聚類分析與主成分分析（principal component analysis，PCA）對不同產地紫蘇葉藥材進行比較分析；通過測定紫蘇葉抗病毒活性生物效價，并利用灰色關聯度分析其特征峰與抗病毒活性的關系，為開發利用紫蘇藥材資源提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Sciex X500R Q-TOF 型液質聯用儀，配有ESI源和Sciex OS 數據處理軟件，美國Sciex 公司；1525-2707-2489-2424 型超高效液相色譜儀，美國沃特世公司；KQ5200E 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Synergy H1 型多功能檢測儀，美國Biotek 公司；XS205 型十萬之一電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 材料

1.2.1 試劑 甲醇（批號0212211202）、乙腈（批號0114220902），色譜級，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；磷酸（色譜級，批號20210715），天津市科密歐化學試劑有限公司；對照品咖啡酸（批號CFS202201）、阿魏酸（批號CFS202202）、迷迭香酸（批號CFS202202）、木犀草素（批號CFS202201），經HPLC 測定質量分數均≥98%，均購于武漢中標科技有限公司；對照品芹菜素-7-O-二葡萄糖醛酸苷（批號PS013316）、野黃芩苷（批號PS020995），經HPLC 測定質量分數均≥98%，均購于成都普思生物科技有限公司；水為屈臣氏飲用水。抗NA 效價試劑盒，批號200713，含3.0 mg/mL 的帕拉米韋陽性對照品溶液（100 mL），上海碧云天生物技術有限公司。

1.2.2 藥材 紫蘇是唇形科紫蘇屬1 年生草本植物，樣品經廣西中醫藥大學唐紅珍教授鑒定為唇形科草本植物紫蘇P.frutescens(L.) Britt.的干燥葉。15 批紫蘇葉樣品，編號分別為S1～S15，結果見表1。

表1 紫蘇葉藥材產地信息Table 1 Origin information of Perillae Folium

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 取紫蘇葉粉末0.5 g，精密稱定。置具塞三角瓶中，加入70%甲醇25 mL，超聲20 min（40 kHz、200 W），用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 取各對照品，精密稱定，加甲醇定容至10 mL 量瓶中，制成質量濃度分別為咖啡酸1.10 mg/mL、阿魏酸1.00 mg/mL、芹菜素-7-O-二葡萄糖醛酸苷0.68 mg/mL、野黃芩苷0.58 mg/mL、迷迭香酸0.15 mg/mL、木犀草素0.10 mg/mL的單一對照品溶液，分別精密量取配好的單一對照品溶液，其中咖啡酸、阿魏酸各1 mL、芹菜素-7-O-二葡萄糖醛酸苷、野黃芩苷、迷迭香酸、木犀草素各2 mL，混合，定容至10 mL 量瓶中，得到含咖啡酸0.11 mg/mL、阿魏酸0.10 mg/mL、芹菜素-7-O-二葡萄糖醛酸苷0.14 mg/mL、野黃芩苷0.12 mg/mL、迷迭香酸0.03 mg/mL、木犀草素0.02 mg/mL 的混合對照品溶液。

2.2 UPLC-Q-TOF-MS/MS 定性分析

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Kinetex C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；體積流量0.4 mL/min；流動相為乙腈-水，梯度洗脫：0～30 min，5%～95%乙腈；進樣量3 μL；柱溫40.0 ℃。

2.2.2 質譜條件 電噴霧電離源（ESI），掃描范圍m/z100～2 000；碰撞能量35 eV；離子源溫度為600 ℃；噴霧電壓5 500 V。通過一級質譜信息確定精確相對分子質量，二級質譜獲得裂解信息，搜索天然產物高分辨質譜數據庫（natural procducts HR MSMS 2.0）、查閱文獻以及對照品比對確定化合物的結構式信息。

2.2.3 化合物質譜分析 采用UPLC-Q-TOF-MS/MS儀對紫蘇葉進行分析，選擇正、負離子模式，分別對紫蘇葉的供試品溶液進行掃描，得到總離子流圖，結果見圖1。通過SCIX OS 數據處理系統查找質譜響應較高的成分的精確相對分子質量，通過天然產物高分辨質譜數據庫（natural procducts HR MSMS 2.0）和TCM MS/MS Library 數據庫檢索、結合一級分子離子峰和二級質譜碎片信息推測和相關查閱文獻，對部分成分的結果作進一步驗證，總共鑒定出47 個化學成分[19-23]，質譜信息見表2。通過UPLCQ-TOF-MS/MS 技術對紫蘇葉的化學成分進行了初步鑒定，為反映紫蘇葉內在整體化學成分情況，實驗將結合指紋圖譜和化學識別模式對紫蘇葉進一步研究，以期了解其藥效物質基礎。

圖1 紫蘇葉的負離子 (A)、正離子 (B) 模式總離子流圖Fig.1 Negative (A) and positive (B) total ion flow chart of Perillae Folium

表2 紫蘇葉中化學成分的UPLC-Q-TOF-MS/MS 鑒定結果Table 2 Identification of chemical components in Perillae Folium by UPLC-Q-TOF-MS/MS

2.3 紫蘇葉指紋圖譜的建立及相似度評價

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Supersil ODS2 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；體積流量1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長330 nm；進樣量10 μL；流動相為0.1%磷酸水溶液-甲醇，梯度洗脫：0～20 min，25%～40%甲醇；20～80 min，40%～80%甲醇；80～81 min，80%～25%甲醇；81～85 min，25%甲醇。

2.3.2 參照峰的選擇 在特征圖譜中，迷迭香酸含量較高，并且較穩定，故選擇迷迭香酸的色譜峰（18號峰）作為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。

2.3.3 精密度試驗 取S4 的紫蘇葉供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件，連續測定6 次，記錄譜圖，結果各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 取S4 的紫蘇葉樣品，共6 份，按“2.1.1”項下條件制備，按“2.3.1”項下色譜條件進行測定，結果各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于3%，表明方法重復性良好。

2.3.5 穩定性試驗 取S4 的紫蘇葉供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件，置于室溫下，于0、2、4、8、12、24 h 進樣，結果各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于3%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.3.6 指紋圖譜建立及相似度評價 取15 批的紫蘇葉藥材粉末，按“2.1.1”項下方法，分別制備紫蘇葉的試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件，進樣測定，得到15 批紫蘇葉的色譜圖。將數據導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004 年版）軟件，樣品（S4）圖譜作為參照圖譜，利用多點校正法生成指紋圖譜和對照指紋圖譜。15 批紫蘇葉樣品的指紋圖譜見圖2，并進行相似度評價，S1～S15 的相似度結果在0.9～1.0。15 批紫蘇葉樣品共標定19 個共有峰，通過比較各峰保留時間和吸收光譜，對各峰進行指認（圖3），紫蘇葉樣品HPLC 指紋圖譜的咖啡酸（峰6）、阿魏酸（峰12）、芹菜素-7-O-二葡萄糖醛酸苷（峰15）、野黃芩苷（峰16）、迷迭香酸（峰18）、木犀草素（峰19）得到了指認。結合UPLCQ-TOF-MS/MS 法鑒定出紫蘇葉的47 個化合物（表2），其中6 種成分能在指紋圖譜上明確指認，實驗將進一步采用化學識別模式對指紋圖譜中共有峰在樣品中的差異進行分析。

圖2 15 批紫蘇葉樣品HPLC 指紋圖譜及其對照指紋圖譜 (R)Fig.2 HPLC fingerprints of 15 batches of Perillae Folium samples and its reference fingerprint (R)

圖3 混合對照品 (A) 和紫蘇葉樣品 (B) 的HPLC 圖Fig.3 HPLC of mixed reference substances (A) and Perillae Folium sample (B)

2.4 化學模式識別分析

中藥指紋圖譜可全面系統地反映物質基準的化學信息，同時采用化學識別模式對指紋圖譜中共有峰在樣品中的差異進行分析，可將共有峰對各批次樣品間指紋圖譜差異的貢獻度量化。

2.4.1 聚類分析 將15 批紫蘇葉樣品的共有峰的峰面積進行數據標準化，然后導入SPSS 22.0 軟件進行系統聚類，采用Ward 法，平方Euclidean 距離聚類，結果見圖4。當分類距離為5 時，15 批紫蘇葉樣品可分為2 類，第I 類S1～S9、S15，第II 類S10～S14。

圖4 15 批紫蘇葉聚類分析樹狀圖Fig.4 Dendrogram of cluster analysis of 15 baches of Perillae Folium

2.4.2 PCA 為評價所有樣品的差異，運用SIMCA 14.1 分析軟件對其進行PCA，結果見圖5，由PCA圖可以看出，S1～S9 聚為一類；S10～S15 為一類；結果與聚類分析的結果基本一致，樣品之間的離散程度較大，表明樣品差異性較大。

圖5 紫蘇葉PCA 圖Fig.5 PCA of Perillae Folium

2.4.3 偏最小二乘法-判別分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA） 將19 個共有峰峰面積的標準化處理數據導入SIMCA 14.1 軟件，得到PLS-DA 載荷散點圖和變量重要性投影值圖[24]，如圖6 所示。結果發現其關鍵參數R2X、R2Y、Q2的值分別為0.255、0.816、0.670，基本大于0.5，說明該模型具有良好的擬合能力及預測能力。PLS-DA載荷散點圖（圖6-A）上每1 個點代表1 個變量，距離原點越遠，表明對樣本的區分能力越強。為進一步篩選出對上述樣本分類貢獻較大的成分，結合VIP 圖可更直觀地看出，各色譜峰的影響程度，VIP值＞1.0 為有意義變量。結果共找到5 個有意義變量，依次為峰15（芹菜素-7-O-二葡萄糖醛酸苷）、18（迷迭香酸）、17、14、2，結果見圖6-B。說明這5 種成分可能是將15 批紫蘇葉分為2 類的差異性質量標志物（quality markers，Q-Marker）。

圖6 紫蘇葉PLS-DA 載荷散點圖 (A) 和VIP 值 (B)Fig.6 PLS-DA loading scatter plot (A) and VIP value (B)of Perillae Folium

2.5 紫蘇葉抗病毒活性研究

2.5.1 抗病毒樣品制備 取紫蘇葉（粉碎，過篩）5 g，精密稱定，于250 mL 具塞錐形瓶中，加入70%甲醇250 mL，超聲20 min（40 kHz、200 W），放冷，濾過，濃縮得浸膏，待用。

分別稱取紫蘇葉浸膏樣品0.5 g，精密稱定，用純水溶解，定容至10 mL 量瓶中，用0.22 μm 微孔濾膜濾過。將供試品及參比液（試劑盒自帶，帕拉米韋3.0 mg/mL，共100 mL）用水依次對倍稀釋包括原液共5 個質量濃度的樣品溶液。

2.5.2 對照品溶液的制備 取4 個對照品溶液，精密稱定，加甲醇定容至10 mL 量瓶中，分別得到咖啡酸為2.008 mg/mL、阿魏酸2.001 mg/mL、迷迭香酸2.008 mg/mL、木犀草素2.001 mg/mL 的對照品溶液。

2.5.3 抗流感病毒NA 活性反應條件與加樣 參考已廣泛應用的NA 活性測定方法[25-26]，為了方便觀察對比，反應在96 孔板中進行。在測定紫蘇葉提取物抗流感病毒NA 活性實驗中，實驗設置為5 組，分別為對照組、NA 組、陽性藥帕拉米韋組（3 mg/mL）、樣品組以及本底組。其中，對照組加入90 μL 緩沖液＋10 μL 底物4-甲基傘形花酰-α-D-N-乙酰 神 經 氨 酸 （ 4-methylumbelliferyl-α-D-Nacetylneuraminic acid，MUNANA）；NA 組加入10 μL NA＋80 μL 緩沖液＋10 μL 底物；帕拉米韋組加入10 μL 帕拉米韋溶液＋70 μL 緩沖液＋10 μL NA＋10 μL 底物；樣品組加入10 μL 樣品溶液＋70 μL 緩沖液＋10 μL NA＋10 μL 底物；本底組加入10 μL 純水＋70 μL 緩沖液＋10 μL NA＋10 μL 底物；按以上方法加入96 孔板后，37 ℃下反應1 h，加入終止液200 μL 終止反應。設定參數：激發波長355 nm，檢測波長460 nm，使用酶標儀測定熒光強度，每組3孔重復實驗。

2.5.4 數據處理與效價計算 生物效價為根據質反應平行線法計算得到的樣品的效價。由效價測定原理編制的計算機軟件完成生物效價計算，該軟件《中藥效價計算器》2.0 版為中國人民解放軍總醫院第五醫學中心肖小河團隊開發和應用。

反應抑制率＝1－(樣品組或陽性藥組熒光值－本底組熒光值)/(NA 組熒光值－對照組熒光值)

樣品組為紫蘇葉樣品、緩沖液、NA 和底物的混合溶液，陽性藥組為帕拉米韋、緩沖液、NA 和底物的混合溶液，本底組為純水、緩沖液、NA 和底物的混合溶液，NA 組為NA、緩沖液和底物的混合溶液，對照組為緩沖液和底物的混合溶液

2.5.5 抗流感病毒NA 活性的測定 按照上述測定方法分別對不同質量濃度（5.000、2.500、1.250、0.625、0.312 5 mg/mL）的紫蘇葉樣品溶液進行測定，計算抑制率，結果見表3。不同批次的紫蘇葉對NA的抑制活性存在差異。

表3 15 批紫蘇葉抗流感病毒NA 活性的抑制率測定Table 3 Reaction inhibition rate against 15 batches of Perillae Folium

2.5.6 生物效價測定 將15 批紫蘇葉樣品的抗流感病毒NA 活性結果輸入生物效價軟件計算其抗NA 效價。結果見圖7。S1～S15 的生物效價分別為6.21、5.58、4.19、8.19、6.09、5.82、6.10、5.36、5.54、10.86、4.74、5.78、3.78、7.98、5.65 U/mg。變異系數（coefficient of variance，CV）為標準差與均值的比率，公式表示為CV＝σ/|μ|，不同產地的紫蘇葉樣品的生物效價的CV 為28.70%，說明樣品之間存在較大差異，其效價為江西贛州的S10 號樣品效價最高，為10.86 U/mg，湖北神農架S13 號樣品效價最低，為3.78 U/mg。廣西玉林、廣西桂平和廣西南寧樣品同產于廣西，其效價為分別是5.58、5.54、5.64 U/mg，說明同一產地的紫蘇葉效價差異較小。

圖7 15 批紫蘇葉樣品的抗流感病毒NA 效價Fig.7 Biological value of 15 baches of Perillae Folium against NA

2.6 紫蘇葉HPLC 圖譜與抗病毒活性的灰色關聯分析（gray correlation analysis，GCA）

2.6.1 原始數據的無量綱化處理 原始數據的變換采用初值化變換法，將15 批紫蘇葉樣品的抗病毒活性的生物效價指標作為母序列，記為｛X0(t)｝，紫蘇葉樣品不同批次的共有峰面積作為子序列，記為｛Xi(t)｝[27-28]。

2.6.2 絕對差序列及關聯系數的計算 在t＝k時（k為峰號），母序列記為｛X0(t)｝，子序列記為｛Xi(t)｝，母序列與子序列的絕對差序列Δ0i(k)＝|X0(k)－Xi(k)|(1≤i≤m)。計算在t＝k時母序列與子序列的關聯系數η(k)。

Y0(k)為紫蘇葉不同批次抗病毒活性的生物效價；Yi(k)為不同批次紫蘇葉特征峰面積歸一化數值；k為峰號；ρ為分辨系數，ρ∈(0,1)，本實驗中ρ取0.5；|Y0(k)－Yi(k)|為母序列與子序列的絕對差值；minmin|Y0(k)－Yi(k)|絕對差值的最小值；maxmax|Y0(k)－Yi(k)|為絕對值的最大值

2.6.3 關聯度（r）的計算 根據“2.6.1”項和“2.6.2”項計算，峰1～19 的η值依次為0.90、0.96、0.92、0.95、0.95、0.97、0.94、0.96、0.96、0.92、0.93、0.96、0.94、0.86、0.95、0.90、0.92、0.82、0.97。由以上數據可知，紫蘇葉對抗病毒作用藥效貢獻由大到小為6、19＞2、8、9、12＞4、5、15＞7、13＞11＞3、10、17＞1、16＞14＞18（特征峰編號），并采用對照品對6、12、15、16、18、19 號峰進行指認，依次為咖啡酸、阿魏酸、芹菜素-7-O-二葡萄糖醛酸苷、野黃芩苷、迷迭香酸、木犀草素。

3 討論

本實驗考察了波長、流動相組成、洗脫梯度等條件。本實驗考察了230、320、330、350 nm 波長，綜合考慮其出峰數量、響應值、峰形等因素，為了使指紋圖譜信息豐富，避免影響峰值響應和檢測結果穩定性，保證多成分在最大吸收波長下的最佳吸收而互不干擾，最終確定掃描波長為330 nm。流動相分別考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液，發現使用甲醇-0.1%磷酸水溶液洗脫有較好的色譜峰峰形，分離度良好，響應值高，綜合考慮選用甲醇-0.1%磷酸水溶液作為流動相。實驗還考察了不同洗脫梯度條件下樣品的分離能力，發現0～20 min，25%～40%甲醇；20～80 min，40%～80%甲醇；80～81 min，80%～25%甲醇；81～85 min，25%甲醇梯度條件下，各成分分離度良好，峰型良好，故選擇此梯度洗脫。

15 批紫蘇葉樣品的指紋圖譜具有較高的相似度（0.9～1.0），說明不同產地的紫蘇葉在宏觀上具有相似的化學表征，指紋圖譜相似度評價不能區分不同產地的紫蘇葉藥材的差異。實驗將進一步采用化學識別模式對指紋圖譜中共有峰在樣品中的差異進行分析，通過聚類分析可將15 批紫蘇葉分為2 類（第I 類S1～S9、S15，第II 類S10～S14）；PCA 與聚類分析結果基本一致（S1～S9 聚為一類；S10～S15 為一類），這是由峰15（芹菜素-7-O-二葡萄糖醛酸苷）、峰18（迷迭香酸）等5 個主要的有意義變量導致，而峰15 和峰18 是紫蘇葉指紋圖譜的所有色譜峰中峰面積最大的，其在不同產地紫蘇葉中的差異性也較大，使紫蘇葉被PCA 和聚類分析分成2 大類或聚為2 大類。

因此，從結果分析來看，峰15（芹菜素-7-O-二葡萄糖醛酸苷）、18（迷迭香酸）具有一定的特征性，可以作為不同產地紫蘇葉的標志性差異性成分。另外，《中國藥典》2020 年版規定紫蘇子和紫蘇梗的都是以迷迭香酸作為含量測定的指標性成分，但是，由于不同產地的紫蘇的迷迭香酸含量差異較大，導致部分藥材有可能會達不到其質量標準。此外，咖啡酸、阿魏酸、木犀草素等是否可以作為紫蘇葉指標性成分有待考察，因此，還需要通過譜效關系來進一步確認。

由于中藥化學表征不能關聯其臨床功效，往往需要通過藥效學方法來對其質量進行評價，而藥效學實驗也存在實驗步驟復雜、耗費大、難以定量等缺點，而通過選擇直接關聯功效的生物效價分析方法能很好彌補化學評價方法的不足，為中藥的整體質量評價提供新的研究思路，生物效價檢測也稱為中藥質量生物評價，生物效價可以較好地反映中藥產品的整體活性，并關聯中藥功效，適用于化學物質基礎不明確、常規理化方法難以評價其質量或不能反映其臨床生物活性的中藥及其制劑[29]。目前、由肖小河等團隊開發了板藍根、金銀花、黃連、丹參、大黃、水蛭、附子、牛黃、地黃、荊芥、五味子等數十個中藥品種的生物效價檢測方法，但是紫蘇葉的生物效價檢測方法仍然有待完善[30]。

近年來研究表明，唇形科植物揮發油具有抗病毒活性，紫蘇葉都具有一定的體外抗流感活性，因此，課題組基于流感病毒NA，應用中藥質量生物評價的方法，首次構建了紫蘇葉藥材的抗病毒活性的生物效價測定方法，并測定不同產地批次的紫蘇葉的抗流感病毒NA 活性的生物效價。15 批不同產地的紫蘇葉樣品均具有抗流感病毒活性，其生物效價為3.78～10.86 U/mg，不同批次間的效價的最大差值有將近3 倍，說明生物效價測定能很好地反應出不同產地紫蘇葉的抗流感病毒NA 活性差異。此外，本實驗采用底物熒光檢測法來檢測NA 體外活性，并按照生物效價檢測的要求設計試驗條件，建立的基于流感病毒NA 活性檢測的紫蘇葉質量生物效價檢測方法具有穩定，可靠，快速、關聯臨床功效的特點，為紫蘇葉的質量評價提供了參考依據，也可為其他中藥的質量生物效價檢測方法構建提供參考。

最后，本研究通過UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術對紫蘇葉的化學成分進行鑒定，得到47 個化學成分；液質聯用分析對指紋圖譜的定性分析提供了對照品的篩選范圍，從而可以做到有的放矢，避免進行大海撈針式地匹配。

此外，這些成分中的咖啡酸、檸檬酸、木犀草苷、木犀草素等成分據文獻報道可能具有抗病毒活性，這也為紫蘇葉的抗病毒活性的藥效物質篩選提供了方向。另外，本研究建立了紫蘇葉HPLC 指紋圖譜，標定了19 個色譜峰且通過對照品指認出6 個化學成分，分別是咖啡酸（峰6）、阿魏酸（峰12）、芹菜素-7-O-二葡萄糖醛酸苷（峰15）、野黃芩苷（峰16）、迷迭香酸（峰18）、木犀草素（峰19）；通過研究紫蘇葉對抗流感病毒NA 的方法，研究其抗病毒活性，采用GCA 方法研究了共有色譜峰與抗病毒活性之間的關系，發現各共有色譜峰與紫蘇葉抗病毒活性均有不同程度的關聯度（0.82～0.97），其中咖啡酸、阿魏酸、木犀草素的抗病毒藥效關聯度較強。

總之，本研究基于化學模式識別模式的指紋圖譜技術，結合構建的紫蘇葉的生物效價檢測方法，綜合評價了不同產地來源的紫蘇藥材的質量，將為紫蘇葉的進一步開發利用提供依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突