曼地亞紅豆杉NPR1 基因家族鑒定及表達模式分析

杜雨晴，袁菊紅，王 旭，張愷愷，陳段芬，邱德有，楊艷芳*

1.中國林業科學研究院林業研究所，林木遺傳育種國家重點實驗室，國家林業局林木培育重點實驗室，北京 100091

2.江西財經大學藝術學院 風景園林與植物資源研究所，江西 南昌 330032

3.河北農業大學園藝學院，河北 保定 071001

紅豆杉Taxuswallichianavar.chinensis(Pilger)Florin 又稱為紫杉、赤柏松，由于其能夠提取天然抗癌藥物紫杉醇而聞名于世。紫杉醇是高效的抗癌藥物之一，它對多種癌癥，如卵巢癌、乳腺癌、宮頸癌等的治療有著明顯的積極作用[1]，同時也逐漸涉及到對胃癌、食道癌等癌癥的治療[2-3]。紫杉醇雖然廣受歡迎，但是其在紅豆杉中含量極低，且紅豆杉生長極為緩慢，因此造成紅豆杉野生資源遭受嚴重破壞。

水楊酸是植物抗病反應調控中的主要參與者，同時也響應植物參與的其它非生物脅迫。病程相關基因非表達子 1（non-expressor of pathogenesisrelated genes 1，NPR1）作為植物激素水楊酸信號通路調控的重要組成部分，在水楊酸參與的植物系統獲得抗性（systemic acquired resistance，SAR）反應中起著重要的傳遞作用[4]。同時，它也可以通過作用于某些轉錄因子來誘導抗性基因的表達，從而激活植物的免疫系統，提高植物的抗性[5-6]。此外，有研究也證實NPR1 參與介導茉莉酸、乙烯、脫落酸等其他植物激素信號通路的交互作用[7-8]。

目前，NPR1 作為水楊酸信號通路重要調控因子已得到廣泛研究，其作用機制已部分闡明。水楊酸通過改變細胞氧化還原勢使得多聚體NPR1 蛋白解聚為單聚體進入細胞核[9-10]，NPR1 在核內與其它轉錄因子互作，激活或增強防御基因的表達，從而啟動多種防御反應[6,11]。同時，NPR1 蛋白可以通過磷酸化、泛素化等修飾展現出不同的穩定性與功能[12]。Liu 等[13]在擬南芥的基因組中發現了5個NPR1的同源基因，并且將它們分別命名為NPR2、NPR3、NPR4、NPR5和NPR6，之后Fu 等[14]發現AtNPR3/4 能夠直接結合水楊酸發揮負調控作用，而Ding 等[15]則發現AtNPR1、AtNPR3/4 都可以直接與水楊酸相互作用，平行行使激活抗病基因的功能，協同激活免疫反應。隨著NPR1及其同源基因和水楊酸相互調控機制逐步被揭示，NPR1 在調控水楊酸信號轉導過程中的重要性逐漸被人們認識。

研究發現，除了茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）以外，水楊酸也會影響紅豆杉中紫杉醇的生物合成，從而影響紫杉醇的含量[16]。然而，相關分子機制研究較為少見。本研究通過對曼地亞紅豆杉Taxus×mediaRehder 的NPR1基因家族進行生物信息學以及表達模式分析，為進一步研究水楊酸調控紅豆杉紫杉醇合成的分子機制提供理論依據，并為后續利用細胞工程和基因工程提高紫杉醇終產量奠定理論基礎。

1 材料

曼地亞紅豆杉3～5 年生小苗種植于中國林業科學研究院科研溫室內，并經中國林業科學研究院林業研究所楊艷芳研究員鑒定確認為曼地亞紅豆杉Taxus×mediaRehder。曼地亞紅豆杉愈傷組織保存于中國林業科學院研究院林木遺傳育種國家重點實驗室，利用B5 培養基進行培養，28 d 繼代1 次，培養條件為25 ℃，暗培養。轉錄組測序在安諾優達基因科技（北京）有限公司進行。

2 方法

2.1 TmNPR1 家族成員鑒定及篩選

從TAIR（https://www.arabidopsis.org/）數據庫中獲取擬南芥AtNPR1（AT1G64280.1）蛋白序列。將擬南芥AtNPR1 序列作為query，與課題組前期測序獲得的曼地亞紅豆杉全長轉錄組數據進行Tblastn 比對，E值＜1×10?10，獲得TmNPR1候選基因核苷酸序列。將所得到的核苷酸序列通過在線網 站 ORF Finder （ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）來搜尋序列對應的完整開放閱讀框（open reading frame，ORF），再通過CD-HIT 軟件對NPR1候選基因的ORF 序列進行去冗余處理，調整cut-off 參數為0.90，最終獲得TmNPR1s基因核苷酸序列。

2.2 TmNPR1 家族系統進化關系分析

利用DNAMAN 將所獲得的TmNPR1s 氨基酸序列、擬南芥NPR1 氨基酸序列與中國紅豆杉NPR1氨基酸序列[17]進行保守結構域的同源性比對。使用MEGA X 軟件采用臨接法（neighbor-joining，NJ）對所獲得的 TmNPR1s 蛋白序列和其他植物的NPR1 蛋白序列（下載自Genbank 數據庫與TAIR數據庫）進行進化樹的構建，bootstrap 為1 000 次重復，其他參數為默認值。利用iTOL（https://itol.embl.de/）在線網站對進化樹進行美化。

2.3 TmNPR1 家族蛋白理化性質分析

使用 ExPaSy-ProtParam tool （ https://web.expasy.org/protparam/）網站對所獲得的NPR1 蛋白序列的氨基酸數量（number of amino acids）、相對分子質量（molecular weight）、等電點（pI）、不穩定系數（instability index）、脂肪系數（aliphatic index）和總平均親水性（grand average of hydropathicity，GRAVY）等理化性質進行分析。

2.4 TmNPR1 家族保守結構域與保守基序分析

利用NCBI 網站上的在線工具Batch CD-Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ cdd/wrpsb.cgi）對TmNPR1s基因的ORFs 進行保守結構域預測分析，隨后將預測結果通過DNAMAN 和TBtoolsv1.108 軟件進行可視化處理[18]。利用 MEME 在線網站（ https://meme-suite.org/meme/tools/meme ） 對TmNPR1s 家族蛋白進行保守基序（Motif）分析[19]，最大motif 檢索數為10，其余為默認參數，將結果通過TBtoolsv1.108 軟件進行可視化處理[17]。

2.5 TmNPR1s 基因表達模式分析

從NCBI 網站SRA 數據庫中下載云南紅豆杉不同組織（根、莖、葉）的轉錄組數據（SRP127697）、低溫處理（0℃處理2～3 年生中國紅豆杉幼苗12 h）后紅豆杉的轉錄組數據（SRP096539）和MeJA處理（紅豆杉愈傷組織分別經過MeJA 處理0、0.5、3、24 h）后的曼地亞紅豆杉轉錄組數據（SRP133888），以及本課題組前期測得的冠菌素（coronatine，COR）處理（在曼地亞紅豆杉的B5培養基中加入1 μmol/L COR，分別于0 h、4 h、12 h、48 h、4 d 和14 d 時收集愈傷組織）后的轉錄組數據[20]。

利用所獲得的TmNPR1s序列分別與以上轉錄組數據進行Blastn 同源比對，一致性最高同源序列的FPKM 值即為不同處理下TmNPR1s的表達量，并利用GraphPad Prism 8 軟件作圖，進行基因差異表達分析。

3 結果與分析

3.1 TmNPR1 家族成員鑒定及其編碼蛋白理化性質分析

本研究從曼地亞紅豆杉全長轉錄組中鑒定出3個NPR1基因，通過Batch CD-Search 在線工具預測分析發現3 條NPR1 的蛋白序列均含有BTB_POZ結構域與AnK 保守域（圖1），是典型的NPR1 家族蛋白。將鑒定到的3 條基因序列分別命名為TmNPR1～TmNPR3，以便后續分析。

圖1 TmNPR1s 蛋白保守結構域預測Fig.1 Prediction of conserved domains of TmNPR1s proteins

對獲得的3 個TmNPR1基因編碼蛋白進行理化性質分析，如表1 所示，發現3 個NPR1 蛋白分別含有600、519 和658 個氨基酸殘基；相對分子質量在65 020～75 170；3 個蛋白的等電點分別為5.86、5.56 和5.34，全部小于7，說明該家族蛋白全部偏酸性；不穩定系數為42.43～51.79，表明3 個蛋白均不穩定；脂肪系數80.56～93.72，都在80 以上，說明都為脂溶性蛋白；總平均親水性分別為?0.201、?0.235 和?0.498，均為負值，表明3 個蛋白都為親水蛋白。

表1 TmNPR1 家族成員理化性質分析Table 1 Physicochemical property analysis of TmNPR1 family members

3.2 TmNPR1 家族系統進化及多序列比對分析

本研究對包括3 個TmNPR1 蛋白在內的共32個NPR1 蛋白進行系統進化樹構建。結果如圖2 所示，這些NPR1 家族蛋白共分為3 個亞家族，分別為Clade Ⅰ（AtNPR1/2 subfamily）、Clade Ⅱ（AtNPR3/4 subfamily）和Clade Ⅲ（AtNPR5/6 subfamily）。在3個TmNPR1蛋白中，TmNPR1、TmNPR2聚在Clade II 亞家族，TmNPR3 聚在Clade III 亞家族。在擬南芥中，AtNPR5/6 被證明并沒有參與免疫反應，但能夠調控葉片與花的發育[21]，TmNPR3 與AtNPR5/6聚類在一起，說明TmNPR3 可能對紅豆杉植株生長形態起到調控作用。而TmNPR1/2 則與Clade II 類AtNPR3/4 蛋白親緣關系較近，表明TmNPR1/2 可能具有與AtNPR3/4 蛋白相似的功能。

圖2 不同植物NPR1 蛋白進化樹分析Fig.2 Phylogenetic analysis of NPR1 proteins from different plant species

進一步對3 個TmNPR1 蛋白（TmNPR1-3）序列以及 6 個擬南芥 NPR1 蛋白序列（AtNPR1-6）、1 個中國紅豆杉 NPR1 蛋白[17]（TcNPR1）進行多序列對比分析，結果如圖3 所示，所有序列均包含BTB_POZ 結構域和錨蛋白重復結構域AnK，這2 個結構域在紅豆杉和擬南芥中較為保守，但TmNPR3 的BTB_POZ 結構域和AnK 保守域位置與其他序列相比有較大差異（圖1）；除AtNPR5/6 和TmNPR3 外，其余NPR1蛋白序列均包含NPR_like_C 區域。此外，在寡聚物-單體相互轉變過程中發揮重要作用的3 個半胱氨酸殘基（Cys82、Cys155 和 Cys216）在除TmNPR3 外的9 個NPR1 蛋白中完全保守。同時，TmNPR1、TcNPR1 和AtNPR3/4 還具有EAR 基序（VDLNETP），該基序在轉錄抑制方面發揮著重要的作用。

圖3 曼地亞紅豆杉及擬南芥NPR1 蛋白多序列比對Fig.3 Multiple sequence alignment of NPR1 proteins of Taxus × media and Arabipdosis thaliana

3.3 TmNPR1 家族蛋白保守基序分析

利用MEME 在線網站對3 個TmNPR1 蛋白以及擬南芥、中國紅豆杉的NPR1 蛋白進行保守基序分析，結果如圖4 所示。所有NPR1 蛋白均含有motif1、3、5，但TmNPR3 只含有這3 種motif，而且motif1、3 在TmNPR3 蛋白上的位置也與其他NPR1 蛋白存在較大差異。此外，除AtNPR5、6 與TmNPR3 外，剩余7 個NPR1 蛋白均含有motif1～10，AtNPR5、6 缺少motif6、7、9、10。同時，從圖4 中還發現TmNPR1 與TcNPR1、AtNPR1與TmNPR2 具有極高的相似性，除去motif3、7、9在位置上有所偏移，其余motif 類型、數量以及位置幾乎沒有差別，TmNPR2 與TmNPR1、TcNPR1相比，也只是motif 位置有所不同，可見，在不同物種中NPR1 蛋白具有較高的保守性，但也存在motif 類型、數量以及位置等差異。

圖4 紅豆杉及擬南芥NPR1 蛋白保守基序分析Fig.4 Conservative motif analysis of NPR1 proteins of T.wallichiana var.chinensis and A.thaliana

3.4 TmNPR1s 基因不同組織表達模式分析

為進一步探討3 個TmNPR1基因的表達特性，本研究同時利用轉錄組數據對紅豆杉3 個組織（根、莖、葉）中TmNPR1～TmNPR3的表達模式進行分析。結果發現3 個基因具有組織表達特異性（圖5）。在根中，TmNPR1的表達量最高；在莖中，TmNPR1表達量略高于其他2 個基因，但是明顯低于該基因在根和葉中表達量；在針葉中，TmNPR1和TmNPR2表達量最高且兩者非常相近，TmNPR3在針葉中表達量雖不及前2 個基因，但是比其在根和莖中的表達量相對較高。

圖5 TmNPR1s 基因在曼地亞紅豆杉不同組織的表達模式Fig.5 Expression pattern of TmNPR1s genes in different tissues of Taxus × media

3.5 TmNPR1s 基因在低溫脅迫表達分析

本研究對低溫處理下紅豆杉植株中TmNPR1-3的表達水平也進行了檢測。結果如圖6 所示，3 個基因在正常溫度下表達水平較為接近，但是在低溫誘導（LT）后，TmNPR1基因的表達與對照（NT）相比顯著提升，而TmNPR2和TmNPR3基因在低溫處理后的表達發生了降低，且遠低于TmNPR1的表達水平。

圖6 TmNPR1s 基因冷脅迫下的表達模式Fig.6 Expression pattern of TmNPR1s genes under cold stress

3.6 TmNPR1s 基因在COR 和MeJA 處理下表達分析

如圖7 所示，經過COR 處理后，TmNPR1表達量明顯高于TmNPR2和TmNPR3，并且呈現隨著處理時間的增加而升高進而再降低的趨勢，在處理4 h 時達到最大值，在處理4 d 時表達量達到最低值，處理14 d 時表達量基本同對照持平。TmNPR2和TmNPR32 個基因在COR 處理后表達量變化幅度較小，這表明TmNPR1對COR 的處理響應更為積極。

圖7 TmNPR1s 基因在COR 處理下的表達模式Fig.7 Expression pattern of TmNPR1s genes under COR processing

本研究還對MeJA 處理下曼地亞紅豆杉細胞系中TmNPR1s基因的表達水平進行了分析。結果如圖8 所示，整體來看與COR 處理下結果相似，三者中，TmNPR1基因表達水平最高，TmNPR2和TmNPR3表達量較低，且2 個基因在處理后各個時間點表達量并沒有顯著變化。與COR 處理不同的是，在MeJA 處理后，TmNPR1基因在處理0～24 h呈現逐漸升高趨勢，并在24 h 表達量最高。

圖8 TmNPR1s 基因在MeJA 處理下的表達模式Fig.8 Expression pattern of TmNPR1s genes under MeJA processing

4 討論

水楊酸是植物抗病反應中激活植物防御保護機制的信號分子[22]，而NPR1 是水楊酸信號通路的重要調控因子，在植物中常常以家族形式存在，該基因家族在植物的抗病以及逆境脅迫響應等方面起著重要作用。本研究從曼地亞紅豆杉全長轉錄組中篩選出3 個與擬南芥AtNPR1 同源性較高的NPR1基因，并發現其有2 個進化分枝，TmNPR1/2 與AtNPR3/4 聚為一類，TmNPR3 與AtNPR5/6 為一類，該實驗結果和鱷梨Perseaamericana的研究結果類似[23]，可以看出該家族基因在植物的進化種具有高度保守性。

擬南芥中NPR1 家族成員，結構十分相似，但是功能卻相差甚遠。盡管 AtNPR1 和AtNPR3/AtNPR4 都是水楊酸受體，但是它們在水楊酸誘導的防御基因表達的轉錄調控中起相反的作用。SA 通過抑制AtNPR4 的轉錄抑制活性和促進AtNPR1 的轉錄激活活性，從而激活關鍵免疫調節因子的表達[15]。本研究通過結構域分析，發現3 個TmNPR1 蛋白的N 端均含有BTB_POZ 結構域和AnK 保守域，但是 TmNPR3 的 C 端缺少NPR1_Like_C 結構域。Motif 分析結果也看出TmNPR3 與TmNPR1 和TmNPR2 結構上存在顯著差異。此外，motif 分析結果顯示，TmNPR1 和TmNPR2 與擬南芥的AtNPR1-3 不論從motif 數目還是位置上都一致，但進化樹分析結果顯示TmNPR1/2 與AtNPR3 聚在一起。Ding 等[15]發現AtNPR3 和 AtNPR4 蛋白含有 EAR 基序（VDLNETP），該基序在轉錄抑制方面發揮著重要的作用。多序列比對結果可以看出，TmNPR1/2 也具有EAR 基序。由此推測TmNPR1/2 更有可能與AtNPR3 的功能相似。上述結果也表明TmNPR1 家族既存在較高的保守性，同時，不同成員之間也很有可能存在功能特異性。

NPR1 家族成員還參與器官發育進程，研究發現擬南芥中的AtNPR5和AtNPR6基因，具有調控葉片及花器官生長發育的功能[21,24]。在本研究組織表達量分析中，TmNPR1家族基因成員TmNPR1/2在針葉和/或根中高表達，TmNPR3在針葉中相對表達量較高。該結果與棉花、小麥NPR1基因表達結果相似，具有典型的組織表達特異性[25-26]。此外，進化樹分析結果顯示TmNPR3 與AtNPR5/6 聚在一起，因此，TmNPR3極可能在曼地亞紅豆杉中調控針葉的形成，同時TmNPR1/2也可能參與了根和針葉器官的發育。

NPR1 家族除了具有抗病以及影響器官發育的功能，還被證實與植物非生物脅迫相關。如在低溫脅迫下，AtNPR1 與熱休克轉錄因子1（recombinant heat shock transcription factor 1，HSFAI）相互作用，提高擬南芥的抗寒性[27]。在高粱中，SbNPR1基因在PEG6000 和NaCl 處理0.5 h 時表達達到高峰[28]，可見其可能也與干旱和高鹽脅迫有關。因此，本研究利用轉錄組數據對曼地亞紅豆杉NPR1基因家族的表達模式進行分析，冷脅迫、COR 以及MeJA 處理的結果均顯示TmNPR1表達量最高，TmNPR2在COR 處理14 d 表達量較高。可見，三者中，TmNPR1響應激素信號以及低溫誘導，而TmNPR3極有可能不參與低溫脅迫。此外，本研究中來自曼地亞紅豆杉的TmNPR1 與前人報道的中國紅豆杉的TcNPR1序列一致性達到88%，進化樹分析也聚類在一起，推測兩者為不同種紅豆杉中的直系同源基因。研究發現TcNPR1強烈響應干旱和高鹽逆境脅迫[17]，本研究中TmNPR1也能響應低溫脅迫，這表明紅豆杉TmNPR1基因能響應多種非生物脅迫。

本研究從曼地亞紅豆杉轉錄組中鑒定出3 個NPR1基因成員，發現TmNPR1家族基因編碼的3個蛋白在N 端均具有典型的BTB_POZ 結構域和AnK 保守域，TmNPR1 家族有很大可能與其他植物的NPR1 蛋白功能相似。蛋白功能結構域分析結果預示著TmNPR1 家族成員之間可能存在功能的特異性。表達模式分析顯示，3 個TmNPR1基因在紅豆杉不同組織中和不同處理下的表達量各不相同，TmNPR1基因可能在紅豆杉體內響應多種非生物脅迫，TmNPR3基因則極可能參與紅豆杉針葉的形成。該研究為進一步探索紅豆杉NPR1基因功能提供理論支撐，并為后續深入挖掘水楊酸調控紅豆杉紫杉醇合成的分子機制提供理論依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突