sPE 患者血清miR-199a-5p、miR-142-3p 表達變化及與產(chǎn)婦血管內(nèi)皮損傷、圍產(chǎn)兒結(jié)局的關(guān)系

張麗萍，李霞，謝艷

淮安市婦幼保健院產(chǎn)科，江蘇淮安223002

重度子癇前期（sPE）是子癇前期的嚴重表現(xiàn)，累及多器官損害病變，可引起胎盤—胎兒并發(fā)癥［1］。研究［2］表明，母體外周血管內(nèi)皮損傷和功能障礙可引起高血壓和多器官損傷，與sPE 病情進展有關(guān)。微小核糖核酸（miRNA）被證實可通過靶向信號通路相關(guān)基因調(diào)控免疫系統(tǒng)、血管生成和滋養(yǎng)層增殖和侵襲，參與PE 的發(fā)病進展［3］。微小核糖核酸-199a-5p（miR-199a-5p）是一種可靶向缺氧誘導(dǎo)因子-1，在妊娠期高血壓和子癇前期患者血清中表達下調(diào)［4-5］。miR-142-3p 在sPE 中表達異常，被鑒定為子癇前期相關(guān)基因，并被證實可抑制蛋白激酶B（Akt）/內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）信號通路，促使血管內(nèi)皮細胞凋亡和損傷［6-7］。上述研究標(biāo)明，miR-199a-5p、miR-142-3p 表達異常可能與sPE 發(fā)病有關(guān)，但其與產(chǎn)婦血管內(nèi)皮損傷和圍產(chǎn)兒結(jié)局的關(guān)系尚不清楚。2020 年1 月—2022 年12 月，我們觀察了sPE 患者血清miR-199a-5p、miR-142-3p 表達變化，并分析其與產(chǎn)婦血管內(nèi)皮損傷、圍產(chǎn)兒結(jié)局的關(guān)系，旨在為圍產(chǎn)兒結(jié)局的改善提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2020年1月—2022年12月淮安市婦幼保健院收治的sPE 患者200 例（觀察組），年齡25～40（34.41 ± 5.21）歲，孕次1～4（2.96 ±0.65）次，產(chǎn)次0～2（1.04 ± 0.21）次，孕周22～36（31.21 ± 3.41）周。納入標(biāo)準：①患者符合《妊娠期高血壓疾病診治指南（2015）》中sPE 的診斷標(biāo)準［8］，初次確診；②年齡≥18 周歲；③患者或家屬書面知情同意本研究；④單胎妊娠。排除標(biāo)準：①輕度、中度子癇前期；②胎兒染色體異常；③合并惡性腫瘤、嚴重肝腎疾病、心血管疾病、免疫疾病；④既往接受過妊娠期高血壓相關(guān)治療或口服可能影響本研究檢測指標(biāo)的藥物；⑤患有妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥、妊娠期糖尿病等并發(fā)癥。另選擇同期健康產(chǎn)檢的孕婦200例（對照組），年齡22～38（34.12 ± 5.62）歲，孕次1～3（2.91 ± 0.58）次，產(chǎn)次0～2（1.02 ± 0.23）次，孕周21～36（31.21 ± 3.41）周。排除妊娠期高血壓、妊娠期糖尿病、胎盤早剝、子癇前期等妊娠期疾病。兩組一般資料無統(tǒng)計學(xué)差異，具有可比性（P>0.05）。本研究已經(jīng)獲得淮安市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

1.2 血清miR-199a-5p、miR-142-3p 檢測 所有入選對象（觀察組患者入組24 h 內(nèi)，對照組孕婦產(chǎn)檢當(dāng)日）采集靜脈血3 mL，注入干燥試管，室溫下放置60 min，待血液凝固后取上層液離心（離心參數(shù)：3 000 r/min，離心半徑10 cm，離心時間5 min），取上清液，分為三份，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)錂z。采用血清RNA 提取試劑盒（美國賽默飛公司）分離總RNA，Nano Drop One 超微量分光光度計（美國賽默飛公司）測定總RNA 純度，選取A260/280 吸光度值1.8～2.0 的RNA，采用Prime Script?II1st Strand cDNA Synthesis Kit（日本TaKaRa公司）將總RNA 轉(zhuǎn)錄為cDNA。Step One Plus實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）系統(tǒng)（美國賽默飛公司）和TB Green?Advantage?qPCR Premix試劑盒（日本TaKaRa公司）進行實時定量熒光聚合酶連反應(yīng)（RT-PCR）。引物序列：miR-199a-5p：5'-CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC-3'，5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGT-3'；miR-142-3p：5'-GGGTGTAGTGTTTCCTACTT-3'，5'-TTTGGCACTAGCACATT-3'；U6：5′-CGCTTCGGCA GCACATATACTA-3′，5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTC3'。反應(yīng)體系：TB Green?Advantage?qPCR Premix 2.5 μL，2 μL cDNA 特異引物，RNase-Free ddH2O 21 μL。反應(yīng)條件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，循環(huán)40次。以U6作為內(nèi)源對照，2-ΔΔCt法計算miR-199a-5p、miR-142-3p。

1.3 血清血管內(nèi)皮功能相關(guān)指標(biāo)檢測 所有入選對象（觀察組患者入組24 h 內(nèi)，對照組孕婦產(chǎn)檢當(dāng)日）采集靜脈血3 mL，注入干燥試管，室溫下放置60 min，待血液凝固后取上層液離心（離心參數(shù)：3 000 r/min，離心半徑10 cm，離心時間5 min），取上清液。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測觀察組和對照組可溶性細胞內(nèi)皮因子（sEng）、可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體-1（sFlt-1）、內(nèi)皮素-1（ET-1）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），所有操作按試劑盒說明書進行。

1.4 圍產(chǎn)兒不良結(jié)局危險因素及保護因素分析 根據(jù)圍產(chǎn)兒結(jié)局將觀察組分為結(jié)局不良組（29例，其中宮內(nèi)生長受限10 例、胎兒宮內(nèi)窘迫5 例、早產(chǎn)8例、新生兒窒息4例、新生兒死亡2例）和結(jié)局良好組（171 例）。利用本院的病歷系統(tǒng)收集兩組患者的臨床資料，包括年齡、孕次、產(chǎn)次、孕周、sPE 類型（早發(fā)型、晚發(fā)型［8］）、并發(fā)癥（視物模糊、水腫、子癇、心衰、肺水腫、腹水、胸腔積液、胎盤早剝、產(chǎn)后出血）、收縮壓、舒張壓等。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，采用獨立樣本t檢驗或校正t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗或校正χ2檢驗；Pearson 相關(guān)分析法分析觀察組血清miR-199a-5p、miR-142-3p 表達與血管內(nèi)皮功能相關(guān)指標(biāo)水平的相關(guān)性；多因素Logistic 回歸分析法分析sPE 患者圍產(chǎn)兒結(jié)局不良的危險因素及保護因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察組及對照組血清miR-199a-5p、miR-142-3p 表達和血管內(nèi)皮功能相關(guān)指標(biāo)水平比較 血清miR-199a-5p、miR-142-3p 表達和血管內(nèi)皮功能相關(guān)指標(biāo)水平比較見表1。

表1 觀察組及對照組血清miR-199a-5p、miR-142-3p表達及血管內(nèi)皮功能相關(guān)指標(biāo)水平比較（± s）

表1 觀察組及對照組血清miR-199a-5p、miR-142-3p表達及血管內(nèi)皮功能相關(guān)指標(biāo)水平比較（± s）

注：與對照組比較，*P<0.05。

?

2.2 觀察組血清miR-199a-5p、miR-142-3p 表達與血管內(nèi)皮功能相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系 觀察組血清miR-199a-5p表達與sEng、sFlt-1、ET-1水平呈負相關(guān)（r分別為-0.356、-0.427、-0.396，P均<0.05），與VEGF水平呈正相關(guān)（r為0.512，P<0.05）；血清miR-142-3p表達與sEng、sFlt-1、ET-1 水平呈正相關(guān)（r分別為0.327、0.411、0.377，P均<0.05），與VEGF 水平呈負相關(guān)（r為-0.498，P<0.05）。

2.3 觀察組患者血清miR-199a-5p、miR-142-3p 表達與圍產(chǎn)兒結(jié)局的關(guān)系 根據(jù)圍產(chǎn)兒結(jié)局將觀察組分為結(jié)局不良組（29例，其中宮內(nèi)生長受限10例、胎兒宮內(nèi)窘迫5例、早產(chǎn)8例、新生兒窒息4例、新生兒死亡2例）和結(jié)局良好組（171例）。結(jié)局不良組年齡（36.12 ± 2.02）歲，孕次（3.02 ± 0.67）次，產(chǎn)次（1.12 ± 0.32）次，孕周（31.92 ± 3.21）周，早發(fā)型sPE 19 例（65.52%）、晚發(fā)型sPE 10 例（34.48%），并發(fā)癥為視物模糊6 例（20.69%）、水腫12 例（41.38%）、子癇7例（24.14%）、心衰4例（13.79%）、肺水腫3 例（1.034%）、腹水5 例（17.24%）、胸腔積液2 例（6.90%）、胎盤早剝9 例（31.03%）、產(chǎn)后出血5 例（17.24%），收縮壓（169.35 ± 5.12）mmHg，舒張壓（116.35 ± 3.24）mmHg，血清miR-199a-5p 相對表達量1.69 ± 0.11，血清miR-142-3p 相對表達量5.02 ± 0.21；結(jié)局不良組年齡（34.12 ± 4.92）歲，孕次（2.95 ± 0.68）次，產(chǎn)次（1.03 ± 0.26）次，孕周（31.32 ± 2.94）周，早發(fā)型sPE 46例（26.90%）、晚發(fā)型sPE 125 例（73.10%），并發(fā)癥為視物模糊30（17.54）、水腫31（18.13）、子癇12（7.02）、心衰25（14.62）、肺水腫20（11.70）、腹水32（18.71）、胸腔積液16（9.36）、胎盤早剝17（9.94）、產(chǎn)后出血10（5.85），收縮壓（168.72 ± 4.09）mmHg，舒張壓（115.56 ± 2.95）mmHg，血清miR-199a-5p 相對表達量2.06 ± 0.12，血清miR-142-3p 相對表達量4.24 ±0.53；兩組年齡、早發(fā)型sPE 比例、并發(fā)水腫比例、并發(fā)子癇比例、并發(fā)胎盤早剝比例、并發(fā)產(chǎn)后出血比例、血清miR-142-3p 相對表達量、血清miR-199a-5p相對表達量比較，P均<0.05。以sPE 圍產(chǎn)兒結(jié)局為因變量（賦值：0=結(jié)局良好，1=結(jié)局不良），以年齡、sPE 類型（賦值：0=晚發(fā)型，1=早發(fā)型）、并發(fā)水腫（賦值：0=否，1=是）、并發(fā)子癇（賦值：0=否，1=是）、并發(fā)胎盤早剝（賦值：0=否，1=是）、并發(fā)產(chǎn)后出血（賦值：0=否，1=是）、miR-199a-5p（連續(xù)性變量原值輸入）、miR-142-3p（連續(xù)性變量原值輸入）為自變量，納入多因素Logistic 回歸模型進行分析。結(jié)果顯示，早發(fā)型sPE、胎盤早剝、miR-142-3p 高表達是sPE 圍產(chǎn)兒結(jié)局不良的危險因素（P均<0.05），miR-199a-5p 高表達是sPE 圍產(chǎn)兒結(jié)局不良的保護因素（P<0.05），詳見表2。

表2 sPE患者圍產(chǎn)兒結(jié)局不良的Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

sPE 是孕產(chǎn)婦圍產(chǎn)期發(fā)病和死亡的主要原因之一，以不同程度的胎盤灌注不良為主要特征［1］。妊娠早期滋養(yǎng)細胞侵襲受損和螺旋動脈重構(gòu)失敗導(dǎo)致子宮胎盤血流量減少和胎盤應(yīng)激，觸發(fā)母體外周內(nèi)皮細胞功能障礙，引起全身性炎癥反應(yīng)和以母體高血壓為特征的sPE［2］。胎盤早期植入不良或發(fā)育不良促使滋養(yǎng)細胞釋放抗血管生成分子，如sFlt-1、sEng，抗血管生成分子作用于母體血管內(nèi)皮，刺激局部內(nèi)皮釋放血栓素、促炎細胞因子和氧化應(yīng)激代謝物，加重全身內(nèi)皮損傷。隨著病情進展，導(dǎo)致胎盤早剝、胎兒宮內(nèi)生長受限等圍產(chǎn)兒不良結(jié)局。miRNA是長度約20 nt的非編碼RNA，能特異性靶向并結(jié)合mRNA 的3′-UTR 區(qū)抑制mRNA 的翻譯和表達，參與細胞代謝、免疫應(yīng)答、細胞分化、疾病發(fā)展等多種病理生物學(xué)過程。研究［9］顯示，多種miRNA 參與子癇前期的發(fā)病過程。

miR-199a-5p 是血管損傷相關(guān)miRNA，在妊娠期高血壓患者中表達異常［10］。本研究顯示，miR-199a-5p 在sPE 患者中表達降低，miR-199a-5p高表達是sPE 患者圍產(chǎn)兒結(jié)局不良的保護因素。分析原因：首先，胎盤基底細胞粘附分子（BCAM）在滋養(yǎng)細胞膜上高度表達，激活磷脂酰肌醇-3 激酶調(diào)節(jié)亞基6（PIK3R6）/磷酸化轉(zhuǎn)錄信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子及激活子3（p-STAT3）信號通路，促使滋養(yǎng)細胞增殖、遷移和侵襲，引起胎盤不良和子癇前期樣表型，包括收縮壓升高、蛋白尿、多器官（胎盤、肝臟和腎臟）結(jié)構(gòu)和功能受損以及胎兒生長受限［11-12］。miR-199a-5p可介導(dǎo)BCAM 降解，抑制PIK3R6/p-STAT3 信號通路，抑制滋養(yǎng)細胞增殖、遷移和侵襲，在sPE 中發(fā)揮保護作用機制［13］。其次，miR-199a-5p過表達可下調(diào)小窩蛋白1 的表達，降低人腎小球內(nèi)皮細胞的通透性，緩解蛋白尿含量升高等子癇前期樣表型［14］，進而降低不良圍產(chǎn)兒結(jié)局的風(fēng)險。本研究還顯示，血清miR-199a-5p表達與血清sEng、sFlt-1、ET-1水平呈負相關(guān)，與VEGF 水平呈正相關(guān)，表明miR-199a-5p 可能參與sPE 血管損傷調(diào)控過程，miR-199a-5p 表達升高可能抑制抗血管生成分子合成，促使促血管生長因子表達，保護血管內(nèi)皮功能，抑制sPE 的發(fā)展，從而降低圍產(chǎn)兒結(jié)局不良的發(fā)生率。

miR-142-3p 可調(diào)控滋養(yǎng)層細胞增殖、遷移和侵襲，在妊娠期高血壓患者中高表達，并且與子癇前期進展有關(guān)［15］。研究［16］發(fā)現(xiàn)，miR-142-3p 在子癇前期組織中表達上調(diào)，通過靶向抑制調(diào)控叉頭框蛋白M1表達，抑制滋養(yǎng)細胞增殖，參與子癇前期發(fā)病過程。本研究顯示，miR-142-3p 在sPE 患者中表達升高，miR-142-3p 高表達是sPE 患者圍產(chǎn)兒結(jié)局不良的危險因素，提示miR-142-3p 過表達可能促使子癇前期病情進展和不良圍產(chǎn)結(jié)局發(fā)生。分析可能的機制為：滋養(yǎng)細胞侵襲不足與子癇前期的發(fā)展有關(guān)，miR-142-3p 過表達抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1/Smad3 信號通路，降低基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2 和MMP-9 的活性，繼而抑制滋養(yǎng)細胞的侵襲和遷移，促使子癇前期病情進展［15］。本研究還顯示，血清miR-142-3p 表達與血清sEng、sFlt-1、ET-1 水平呈正相關(guān)，與VEGF 水平呈負相關(guān)，表明miR-142-3p 可能通過調(diào)控血管損傷參與sPE 發(fā)病和進展過程。文獻［17-18］報道，miR-142-3p 可通過微體進入內(nèi)皮細胞，靶向上調(diào)BCLAF1，抑制內(nèi)皮細胞增殖，促使內(nèi)皮細胞凋亡，miR-142-3p 作為bcl-2 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1 的下游基因，在其刺激下表達上調(diào)并誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞異常增殖，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞功能障礙。推測miR-142-3p 過表達可能抑制內(nèi)皮細胞增殖，促使內(nèi)皮細胞凋亡，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙和損傷，進而促使sPE 的發(fā)展，導(dǎo)致圍產(chǎn)兒結(jié)局不良的發(fā)生。

本研究多因素Logistic 回歸分析還顯示，早發(fā)型sPE、胎盤早剝與sPE圍產(chǎn)兒結(jié)局不良有關(guān)。分析原因為sPE 早期發(fā)病可能癥狀并不顯著，導(dǎo)致就醫(yī)延遲，由于病情進展迅速，易引起不良結(jié)局，胎盤早剝屬于妊娠晚期嚴重并發(fā)癥，可引起子宮持續(xù)收縮和胎兒心率改變，缺血缺氧，導(dǎo)致不良圍產(chǎn)兒結(jié)局。劉穎等［19］也指出，早發(fā)型sPE 新生兒Apgar 評分≤7 分的發(fā)生率高于晚發(fā)型sPE，圍產(chǎn)兒存活率低于晚發(fā)型sPE。廖琪等［20］認為，sPE 胎盤早剝易引起嚴重的孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒結(jié)局不良。

總之，sPE 患者血清miR-199a-5p 表達降低、miR-142-3p 表達升高，與血管內(nèi)皮損傷有關(guān)，miR-142-3p 高表達是sPE 圍產(chǎn)兒結(jié)局不良的危險因素，miR-199a-5p 高表達是sPE 圍產(chǎn)兒結(jié)局不良的保護因素。