應用液質聯用與分子對接技術篩選黑參中的活性寡肽

高曉晨，申嘉明，王躍龍，程端端，吳佩潼，王碩，張輝，孫佳明

（長春中醫藥大學吉林省人參科學研究院，吉林 長春 130117）

糖尿病（Diabetes）是一種以慢性高血糖癥狀為主要特點的終身性代謝疾病[1]，臨床常用胰島素類、促胰島素分泌類、-葡萄糖苷酶抑制劑和胰島素增敏劑等藥物進行治療[2]；阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease,AD）是一種慢性、快速進展的神經退行性疾病[3]，目前臨床常采用M 型膽堿能受體激動劑、膽堿酯酶抑制劑、抗氧化和抑制淀粉樣蛋白沉積藥等藥物來治療阿爾茲海默病[4]。以上治療藥物常存在有引起不良反應和治療效果不理想等問題[5]。中藥治療慢性疾病具有效果好、副作用小的優點，而中藥的小分子肽因其來源廣泛、安全高效而倍受關注，因此從中藥中篩選出天然的生物活性肽，在抗阿爾茨海默病和糖尿病方面將會具有獨特的優勢。

黑參（Black ginseng）為五加科人參屬植物人參（Panax ginseng C.A.Mey.）的干燥根及根莖，經九蒸九曬炮制或結合微生物發酵而成[6]，多含Rh2、Rh3、Rg3和Rk1 等稀有皂苷成分[7]，具有抗腫瘤、抗炎、降壓保肝、抗糖尿病和中樞神經系統保護等藥理作用[8]。Lee等[9]在研究高麗白、紅和黑參提取物對膽堿酯酶（ACE）抑制活性和膽堿能功能的比較中發現，黑參可以調節乙酰膽堿（ACh）的代謝，對膽堿酯酶的抑制作用最強。Seo 等[10]通過給糖尿病小鼠灌服黑參提取物，發現黑參提取物可通過增加葡萄糖的攝取而降低血糖，從而治療糖尿病。目前，對黑參有效成分的研究多集中于稀有皂苷方面，而對黑參肽的藥理活性報道較少。

為了在黑參中篩選活性寡肽類成分，本研究通過超高效液相色譜-線性離子阱-靜電場軌道阱高分辨質譜和分子對接技術分析黑參精制組分中抑制乙酰膽堿酯酶和-葡萄糖苷酶的活性寡肽類成分，并預測它們與乙酰膽堿酯酶和-葡萄糖苷酶的對接結合能和對接模式。與傳統篩選研究方法相比，液質聯用與分子對接技術相結合不僅可以提高篩選的效率，而且可為黑參寡肽類成分的作用機制的推測和闡述提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

黑參藥材由長春中醫藥大學吉林省人參科學研究院自制。UltiMate 3000 series 高效液相色譜儀、超高效液相色譜線性離子阱-靜電場軌道阱高分辨質譜儀，美國Thermo Fisher 公司；BP211D 型十萬分之一電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；KQ3200BE超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；LDZX-30KBS立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；GZX-9070MBE數顯鼓風干燥箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

甲醇（分析純，20220309），國藥集團化學試劑有限公司；乙腈、甲酸（色譜純），賽默飛世爾科技（中國）；Flash SphericalC8填料，天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 樣品制備

將干燥的5 年生的人參置于高壓滅菌鍋中在120℃的溫度條件下蒸制2 h后，放入鼓風干燥箱50 ℃干燥8 h，繼續重復操作循環蒸制干燥8 次，得到黑參，置于陰涼干燥處貯藏。

取10 g 黑參飲片，用50%乙醇（質量比1:10）超聲提取，每次60 min，共2 次，將合并的提取液加壓回收乙醇至無醇味，加適量超純水定容到100 mL。

甲醇1 mL 活化C8 固相萃取（SPE）小柱，用水1 mL 平衡。將上述水溶液樣品1 mL 上柱，收集漏出液，用水1 mL 洗脫雜質，用30%甲醇1 mL 洗脫，收集洗脫液，作為黑參精制組分樣品溶液，經0.45m微孔濾膜過濾，供超高效液相色譜線性離子阱靜電場軌道阱高分辨質譜儀分析。

1.3 黑參精制組分的液質分析

色譜條件：采用UnitaryC18 色譜柱（4.6mm 150mm，2.8m 100）；流動相為乙腈（A）和0.1%的甲酸水溶液（B），通過二元線性梯度洗脫，流動相梯度：0～30 min（10%～100%A），流速0.5 mL/min；進樣量10L；柱溫30 ℃。

質譜條件：采用電噴霧電離源（ESI），樣品采用正離子模式掃描。噴霧電壓2.5 kV，毛細管溫度350 ℃，透鏡電壓50 eV，鞘氣壓力2.76×105Pa，輔助氣壓力6.89×104Pa，輔助氣溫度300 ℃，分辨率70 000，質量掃描范圍m/z 100～1 500。

1.4 分子對接

使用ChemDraw 20.0 繪制黑參中寡肽類成分的sdf 2D 結構的分子式，通過Chem 3D 軟件能量最小化，轉換為柔性結構的pdb格式，使用OpenBabel 2.4.1確認可旋轉的鍵并保存為pdbqt 格式，以備后續對接使用。

通過RSCB PDB 數據庫（http://www.rcsb.org/）下載乙酰膽堿酯酶的晶體結構（4EY6）和-葡萄糖苷酶（2QMJ）的pdb 格式文件，經PyMOL 對其進行去水、加氫等操作，使用Autodock 保存為pdbqt 格式。通過查詢文獻[11,12]確定乙酰膽堿酯酶的結合位點坐標（4EY6，2.827，40.098，30.802）及尺寸（26×26×26）和-葡萄糖苷酶的結合位點坐標（2QMJ，21.56，6.936，1.971）及尺寸（26×26×26），并按照相關格式保存為txt 格式，寡肽所有可旋轉鍵均設為柔性，乙酰膽堿酯酶和-葡萄糖苷酶設置為鋼性，搜尋精度exhaustiveness設為64，格點間距1，其他參數默認，運行Autodock Vina，采用拉馬克遺傳算法對接運算100 次。將結果用LigPlus 和PyMOL 程序對對接構象進行可視化分析。

2 結果與討論

2.1 黑參精制組分的液質分析

用甲醇溶液配制濃度為1 mg/mL 的黑參精制組分樣品溶液，過0.22m 膜，經超高效液相色譜線性離子阱靜電場軌道阱高分辨質譜分析，得到正離子模式下的總離子流圖，見圖1。結合各色譜峰的分子離子峰及主要碎片峰的解析、與文獻[13-15]對比，指認了其中5 個寡肽類成分，結果見表1。

圖1 為黑參精制組分化合物的正譜總離子流圖，指認出5 個寡肽類化學成分，分別為谷氨酸天冬酰胺（Glu-Asn），酪氨酸天冬酰胺（Tyr-Asn），亮氨酸甲硫氨酸（Leu-Met），脯氨酸甲硫氨酸（Pro-Met），蘇氨酸苯丙氨酸（Thr-Phe）。

2.2 分子對接結果

表2 5 個寡肽與乙酰膽堿酯酶和-葡萄糖苷酶的結合情況Table 2 Binding of five oligopeptides to acetylcholinesterase and-glucosidase

表2 5 個寡肽與乙酰膽堿酯酶和-葡萄糖苷酶的結合情況Table 2 Binding of five oligopeptides to acetylcholinesterase and-glucosidase

一般認為配體和受體分子對接的結合能小于0，便可以自發結合，結合能越小發生相互作用的可能性越大[16]。從表2 可以看出，黑參中的5 個寡肽化合物與乙酰膽堿酯酶和葡萄糖苷酶的結合能均小于0，說明5 個寡肽類化合物均可以與兩種酶自發結合。同時5 個寡肽的結合能均小于20.9 kJ/mol，表明黑參寡肽可能具有良好的乙酰膽堿酯酶和糖苷酶抑制活性。通過對比兩者發現，5 個寡肽成分與糖苷酶的結合能普遍低于乙酰膽堿酯酶，表明黑參可能對糖苷酶的抑制作用更好。其中酪氨酸天冬酰胺相較于其他寡肽對兩種酶的分子對接結合能更小，提示酪氨酸天冬酰胺可能具有良好的抗阿爾茨海默病和糖尿病活性。

3 結論