何首烏對高血脂小鼠的降脂作用及轉錄組學研究

羅玲，唐文婷，易睿，張楠，周小娟，唐亮

（長沙醫學院基礎醫學院，湖南 長沙 410219）

高血脂癥（Hyperlipemia）是由于脂肪代謝運轉異常造成血漿中的總膽固醇（Total cholesterol,TC）、甘油三酯（Triglycerides,TG）與低密度脂蛋白（Low density lipoprotein,LDL-C）高于正常值，或高密度脂蛋白（High density lipoprotein,HDL-C）低于正常值的一種疾病[1]。高血脂癥發病因素較多，包括遺傳因素、年齡、性別因素、飲食因素、情緒因素和生活習慣等[2]。目前，國內外對高血脂癥的治療以化學藥物如他汀類、樹脂類和降甘油三酯類為主[3]。與西藥相比，中藥對高血脂癥的治療效果已顯示出諸多優點，但其作用機制比較復雜。

何首烏[Fallopia multiflora (Thunb.) Harald.]是廖科何首烏屬多年生纏繞藤本植物[4]。研究發現，何首烏具有抗衰老、降血脂和保護神經細胞等功能[5]。已有研究報道了何首烏降血脂效果，其降血脂成分主要集中在水提多糖、堿提多糖、醋酸乙酯提取物和二苯乙烯苷類[6,7]。然而，有關何首烏降血脂的分子機制研究比較少見，僅有俞捷等[8]和韓曉等[9]報道了何首烏二苯乙烯苷可通過調控甘油三酯、膽固醇的合成、分解及轉運的多個關鍵酶或關鍵蛋白及低密度脂蛋白受體的表達，達到降脂目的。因此，采用動物模型探究何首烏提取液的降脂機制具有重要意義。本研究參考鄒佳益等[10]的方法，采用高脂飼料建立高脂動物模型，并利用何首烏提取液干預小鼠高血脂癥模型，研究何首烏的降血脂效果。利用RNA-seq 測序檢測肝臟組織差異表達基因，深入闡明何首烏降血脂的分子機制，為何首烏的降血脂研究提供試驗依據和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

何首烏經儀器打磨成粉，過3 次四號篩（65 目），稱取100g，然后加入6 倍體積的75%乙醇煎煮回流2次，每次1 h，通過離心10 min 后獲取上清液。將2 次的上清液于旋轉蒸發儀真空濃縮至無乙醇味，使最終的藥物濃度相當于生藥計1 g/mL，4 ℃冰箱保存待用。高濃度取1 g/mL、中濃度取1 g/mL 稀釋為60%溶液（0.6g/mL），低濃度取1g/mL稀釋為30%溶液（0.3g/mL）[8]。

1.2 試驗動物

60 只昆明種雄性小鼠，購于長沙天勤生物技術有限公司，體重18～22 g，鼠齡3 個月，飼養于普通環境中，飼養溫度23～26 ℃，相對濕度50%～60%。自由攝食和飲水，適應性喂養1 周。隨機數字表法分為5 組（n=12）：正常對照組，高脂模型組，何首烏提取液高、中、低濃度組。除正常對照組外，其他4 組采用高脂飼料喂養，誘導建立高血脂模型。8 周后何首烏提取液高、中和低濃度組分別采用1.0 g/mL、0.6 g/mL和0.3 g/mL進行腹腔注射（0.1 mL/10 g）[9]。正常對照組和高血脂模型組腹腔注射等體積生理鹽水，每天給藥1 次，持續60d。干預結束，小鼠腹腔注射4%水合氯醛（1 mL/100 g）。待小鼠麻醉后，摘除眼球取血，在4 ℃下3 500 r/min離心10 min，取上清于 20 ℃待用。斷頭處死小鼠，取出肝組織，于 80 ℃冰箱保存。

1.3 試劑

TC、TG、HDL-C 和LDL-C 試劑盒購自中國南京建成生物工程研究所。RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT試劑盒（Code No.:RR037A）及TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒（Code No.:RR82WR）均購自日本TAKARA 公司。

1.4 儀器

RE-52AA旋轉蒸發儀（長沙市卓成醫療器械有限公司）；752N紫外可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）。

1.5 試驗方法

1.5.1 血脂指標測定 取每組離心所得血清樣本，根據試劑盒說明，配置檢測TC、TG、HDL-C 和LDL-C含量所需的試劑溶液，通過化學比色分析并計算TC、TG、HDL-C 和LDL-C 含量[11]。

1.5.2 肝臟RNA 提取及RNA-seq 測序 根據干預結果，選取高濃度何首烏提取液組和模型對照組小鼠肝邊緣區組織（n=3）。AMBION 試劑盒提取總RNA。NanoDrop 和Agilent 法檢測總RNA 質量。通過高通量測序平臺Illumina 進行測序得到轉錄組測序數據（由上海歐易生物科技有限公司完成）。

1.5.3 差異表達基因分析 利用DESeq 軟件篩選差異蛋白編碼基因。對差異表達基因進行GO 功能分析和KEGG pathway 分析。采用STRING 軟件進行蛋白互作網絡分析（PPI）。

表1 PCR 引物Table 1 PCR primers

1.6 統計學分析方法

采用SPSS25.0 進行統計分析處理。對于連續型變量進行正態性分布檢驗。對于符合正態性分布的計量數據采用均數±標準差（）表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。方差齊性，組間比較采用Least-significant difference（LSD）檢測，若方差不齊，組間比較采用Welch 近似F 檢驗，P ＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 何首烏提取物對高血脂模型小鼠血脂的影響

與正常對照組相比，高血脂模型對照組小鼠血清中的TC、TG 和LDL-C 水平顯著升高（P ＜0.05），而HDL-C 水平顯著降低（P ＜0.05）。結果提示，高血脂小鼠建模成功。

與高血脂模型組相比，高濃度何首烏組中的TC、TG 和LDL-C 水平顯著降低（P ＜0.05），HDL-C 水平顯著升高（P ＜0.05）。中、低濃度何首烏提取液降脂效果不明顯（P ＞0.05）。這些結果表明，高濃度何首烏提取液能有效降低高血脂模型小鼠血清TC、TG 和LDL-C 水平，提高HDL-C 水平，見表2。

表2 各組小鼠血清TC、TG、HDL-C 和LDL-C 水平（，n=12）Table 2 Levels of TC,TG,HDL-C and LDL-C in mice blood(,n=12) 單位：mmol/L

表2 各組小鼠血清TC、TG、HDL-C 和LDL-C 水平（，n=12）Table 2 Levels of TC,TG,HDL-C and LDL-C in mice blood(,n=12) 單位：mmol/L

注：**高脂模型組小鼠血清TC、TG、HDL-C 和LDL-C 水平相比于正常對照組有顯著差異（P ＜0.05）。##何首烏高劑量組小鼠血清TC、TG、HDL-C 和LDL-C 水平相比于高脂模型組有顯著差異（P ＜0.05）。縮寫：TC.總膽固醇；TG.甘油三酯；LDL-C.低密度脂蛋白；HDL-C.高密度脂蛋白。Note:**Compared with normal control group,serum TC,TG,HDL-C and LDL-C levels in hyperlipidemic model group were significantly different(P ＜0.05).##Compared with the high fat model group,the serum TC,TG,HDL-C and LDL-C levels in the high concentration F.multiflora were significantly different(P ＜0.05).Abbreviations:TC.Total cholesterol;TG.Triglyceride;LDL-C.Low-density lipoprotein;HDL-C.high-density lipoprotein.

2.2 基因差異表達及聚類分析

轉錄組分析共獲得40.73 G 數據。各樣本的有效數據量分布在6.67～6.94 G。Q30 堿基分布在94.24%～94.35%，平均GC 含量為50.55%。根據蛋白編碼基因在不同樣本中的表達量進行差異篩選，共檢測到的787個差異基因，其中上調基因260 個，下調基因527 個，見圖1 A。其聚類分析結果見圖1 B，差異基因的詳細情況見火山圖，見圖1 C。隨機選擇CES1D、PEMT、MGST3、ANGPTL4、ANKRD26 和MFSD2A 等6 個差異基因進行qRT-PCR 驗證，結果顯示，差異基因表達的相對趨勢與RNA-seq 結果趨勢一致，見圖1 D。

圖1 何首烏干預高血脂小鼠模型肝臟差異表達基因譜Fig.1 Differentially expressed gene profiles in the liver of hyperlipidemia mice induced by

2.3 差異表達基因功能分析

用GO 分析對差異表達基因進行功能分類。差異表達基因富含了532 種細胞組分類別，如絲氨酸-丙酮酸轉氨酶復合體、UBC13-MMS2 復合體、ISWI 復合體、RSF 復合體和CHOP-ATF4 復合體。注釋基因參與了933 個分子功能，如葡萄糖-1,6-二磷酸合酶活性、質子反向轉運體活性和胍基乙酸甲基轉移酶活性等；參與了2 869 個生物過程，如短鏈脂肪酸分解代謝過程、細胞對甘油三酯的反應過程和脂蛋白正向調節代謝過程等，見圖2 A。KEGG 富集通路分析表明，何首烏降脂過程參與多條生物通路，如脂質代謝、信號轉導和異生化物的生物降解與代謝等通路，見圖2 B。

圖2 何首烏干預高血脂小鼠模型肝臟差異表達基因GO 和KEGG 分析Fig.2 Analysis of the differentially expressed genes GO and KEGG in the liver of hyperlipidemia mouse model interfered by

2.4 轉錄因子及其靶基因預測分析

通過比較全部基因和差異基因（上調和下調）的轉錄因子的分布情況，共找到67 個具有明顯差異的轉錄因子，見圖3。轉錄因子調控的總基因數量從0 到563。轉錄因子調控的差異基因數量從0 到40。呈上調趨勢的差異轉錄因子有5 個，呈下調趨勢的差異轉錄因子有16 個。

2.5 差異表達基因相關蛋白互作網絡分析

為探究差異表達基因編碼的相關蛋白質之間的互作關系，本文采用PPI 法進行蛋白互作網絡分析。按照互作結合分數從高到低排序，篩選Top300 差異基因的互作關系結果。如圖4 A、4 B 所示，Top 300 的蛋白互作網絡分析中共有126 個差異表達基因（70 個表達下調，56 個表達上調），其中34 個差異基因為轉錄因子且表達上調，58 個差異基因為轉錄因子且表達下調，22 個差異基因為靶基因且表達上調，12 個差異基因為靶基因且表達下調。

圖4 Top300 差異基因的互作關系圖Fig.4 Interaction between top 300 differentially expressed genes in the liver of hyperlipidemic mice interfered by

3 討論

本研究采用何首烏干預高血脂小鼠模型，并發現高濃度何首烏提取液能有效降低TC、TG 和LDL-C水平，提高HDL-C 水平，起降血脂作用。采用轉錄組測序，結合生物信息學分析方法，發現787 個有顯著差異表達的基因，其可能與血脂調控相關。

降血脂機制是一個復雜的過程，它包括機體的各個方面機體功能下降的過程以及機體對環境的適應，如機體的免疫能力下降、神經退行性病變和抗氧化能力減弱等[12]。研究表明，何首烏降脂主要通過直接抑制機體對外源性脂質的吸收及減少肝腸循環中重吸收入血的脂質含量[10]。何首烏能與膽固醇結合，減少膽固醇經腸道的吸收。其所含蒽醌類化合物還能促進腸蠕動，抑制膽固醇在腸道的再吸收，并能促進膽固醇代謝[13]。此外，何首烏的卵磷脂成分進入血液可吸附血管壁上的膽固醇，從而降低血脂[14]。何首烏主要活性物質2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O--D-葡萄糖苷能夠抑制膽固醇合成酶并且升高低密度脂蛋白受體的表達[15]。本試驗結果證明，高濃度何首烏提取液可以降低高血脂模型小鼠血清中的TC 和TG 水平，提高血清HDL-C 水平，其可能通過抑制外源性TG 和TC的消化吸收發揮作用。然而，具體機制還有待證實。

轉錄組分析共檢測到787 個差異基因，其中上調基因260 個，下調基因527 個。通過KEGG 富集分析表明，差異表達基因多富集于短鏈脂肪酸分解代謝過程、細胞對甘油三酯的反應過程和脂蛋白正向調節代謝過程等。PEMT基因主要在肝臟組織中表達，激活后可調控與葡萄糖的產生、轉運、利用及脂肪代謝的調節相關的基因的表達。研究發現，阻斷小鼠體內PEMT途徑，小鼠血液中的膽固醇水平明顯降低，此外，也能使血液中同型半胱氨酸水平降低一半[16]。本研究發現，經何首烏干預后，小鼠PEMT 基因顯著上調，其可能通過調控脂質代謝相關基因表達，影響血脂水平。ANGPTL4 基因主要在脂肪組織和胚胎中表達，參與脂質代謝、糖代謝及血管新生等過程。ANGPTL4 基因的表達受禁食、肥胖、高脂肪飲食和過氧化物體增殖體激活受體（PPARs）調控[17]。此外，ANGPTL4 也可能通過上調脂肪甘油三酯酶而激活脂解[18]。本研究發現，何首烏干預后，ANGPTL4 基因表達顯著降低，表明ANGPTL4 基因可能與脂質代謝有關。然而，其參與血脂調控代謝的詳細機制尚不清楚，后期重點探究上述基因參與血脂代謝的分子機制。

目前已發現較多與脂質代謝相關的轉錄因子，包括過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）、肝X 受體（LXR）、視黃醛受體（RXR）、固醇調節元件結合蛋白（SREBPs）、法尼酯衍生物X 受體（FXR）、糖應答元件結合蛋白（ChREBP）、孕烷X 受體（PXR）及肝細胞核因子4（HNF4）等[19]。PPARs 是配體調節的轉錄因子，與另外一種RXR 形成異二聚體，結合到靶基因啟動子區的特異反應元件（PPRE）上，從而發揮重要的調節基因表達的作用[20]。ChREBP 的靶基因主要是參與糖酵解和脂質合成的一些酶類，ChREBP 的激活可促進葡萄糖向脂質轉化[21]。因此，這些類型的轉錄因子可能參與肝臟脂質代謝過程。

4 結論

本研究證實，高濃度（0.6 g/mL）何首烏能有效降低高血脂小鼠模型血清血脂，其作用機制可能涉及CES1D、PEMT、MGST3、ANGPTL4、ANKRD26、MFSD2A 等基因以及PPARs、RXR、ChREBP 等轉錄因子的差異表達。本研究可為后續何首烏干預高血脂的機制研究提供新的思路。