基于網絡藥理學和分子對接技術探討生脈散治療糖尿病的作用機制

郝秀華，張莉，趙麗穎，杜小蓉，楊錦竹

（吉林大學藥學院，吉林 長春 130021）

糖尿病（Diabetes mellitas,DM）是一種由多種影響因素共同作用的慢性代謝性疾病，具有慢性高血糖、多器質性及系統靶向性損害的特征[1]，臨床上通過胰島素（Insulin,INS）的絕對或相對缺乏將其分為兩類[2]：胰島素依賴性的一型糖尿病（T1DM）和非胰島素依賴性的二型糖尿病（T2DM）。糖尿病患者所具有的慢性高血糖和代謝功能異常，一定程度上會引起多器質性功能障礙甚至衰竭及系統靶向性損害，并伴有多種并發癥[3]。目前，糖尿病的具體分子作用機制尚不明確[4]。

中藥具有多成分、多靶點及多途徑的作用特點，可從多個方面干預疾病的進程。生脈散是《醫學啟源》中的一劑藥方，由人參、麥冬和五味子組成[5]。方劑中人參甘溫補氣生津為君；麥冬甘而微寒，養陰生津為臣；五味子味酸而咸，擅長固津攝氣為佐。三藥合用，一補一潤一斂，益氣養陰生津，是治療氣陰兩虛的經典名方。研究表明，生脈散對胰島素抵抗有改善作用[6]，對炎癥介質也有一定影響[7]，這為生脈散防治糖尿病提供了一定的科學依據。同時，生脈散加減方在治療糖尿病[8]、糖尿病合并心絞痛[9,10]中應用廣泛，生脈散治療糖尿病，大多是從單一角度解釋其作用機制，缺乏系統性研究。網絡藥理學是一種將藥物作用網絡和生物網絡整合到一起的研究方法，系統性地反映藥物對疾病的作用機制[11,12]。本文通過網絡藥理學和分子對接，探究生脈散治療糖尿病的作用機制，為臨床治療糖尿病提供理論基礎。

1 方法

1.1 數據庫與統計學處理軟件

中藥系統藥理學數據庫與分析平臺TCMSP數據庫[13（]https://tcmsp-e.com/），BATMAN-TCM 數據庫[14]（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/），SwissTargetPrediction 數據庫[15（]http://swisstargetprediction.ch/），Uniprot數據庫[16（]https://www.uniprot.org/），OMIM 數據庫[17（]https://www.omim.org/），GeneCards數據庫[18]（https://www.genecards.org/），Drugbank 數據庫[19（]https://go.drugbank.com/），STRING 數據庫[20]（https://stringdb.org/），Venny2.1 在線作圖平臺[21]（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/），Cytoscape3.7.2 軟件[22]，Graphpad Prism軟件，DAVID數據庫[23（]https://david.ncifcrf.gov/），AutoDock Tools1.5.6，AutoDock vina1.1.2，PyMOL。

1.2 生脈散活性成分與潛在靶點篩選

在TCMSP數據庫中輸入生脈散中的3 味中藥名：麥冬、人參、五味子，搜索3 味中藥有效成分，通過藥物代謝動力學標準篩選條件：口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 進行活性成分的篩選[24,25]，并獲取相對應的靶點，使用Uniprot 數據庫對靶點名稱進行規范統一。由于在TCMSP 數據庫中沒有“麥冬”的相關成分，故通過中醫分子機理生物學信息分析工具BATMAN-TCM進行檢索，篩選條件是Score cutoff ≥20、P-value cutoff ＜0.05[26-28]。通過上述2 個數據庫檢索及結合《中國藥典》記載，得到生脈散3 味中藥的化合物和靶點，建立生脈散成分-靶點網絡。

1.3 糖尿病疾病靶點的確定

以“Diabetes”為關鍵詞在OMIM、GeneCardsDrugbank 數據庫進行檢索，將結果合并后刪除其中的重復疾病靶點，最終得到糖尿病疾病相關靶點。

1.4 繪制韋恩圖

運用Venny2.1 在線軟件作圖工具平臺對獲得的生脈散藥物靶點和糖尿病疾病靶點進行分析處理，最終得到藥物與疾病之間的共同靶點，并繪制韋恩圖。

1.5 成分-靶點網絡構建

利用Cytoscape 3.7.2 軟件對所獲得的生脈散有效成分、交集靶點進行計算分析，構建生脈散有效成分-糖尿病靶點調控網絡。“節點”代表藥物活性成分和作用靶點，“邊”代表節點之間的相互作用關系。

1.6 PPI網絡構建

將生脈散與糖尿病的核心靶點導入STRING 數據庫，限定研究物種為“Homo sapiens”，以置信度分數Score>0.4 為條件進行篩選，將網絡中無關或游離蛋白去掉，其余參數按照默認設定值，將得到的結果導入Cytoscape 3.7.2 軟件，最終得到生脈散治療糖尿病的PPI 網絡圖。

1.7 基因本體（GO）功能和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

將獲得的PPI 網絡中的核心靶點導入功能注釋（Functional annotation）工具DAVID 數據庫，限定研究物種為人類（Homo sapiens），選擇基因本體（GO）分析下的分子功能（MF）、生物過程（BP）和細胞組分（CC）部分進行GO 功能富集分析，選擇Pathway 分析中京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析，設定P ＜0.05，進一步尋找有效成分靶點顯著富集的主要功能與體內通路，利用Graphpad Prism 軟件將Count 值排名前十名的BP、CC、MF 進行可視化。在微生信平臺對KEGG 通路（P ＜0.05）的結果進行可視化[29]。

1.8 分子對接

在蛋白質PDB結構數據庫RCSB（https://www.rcsb.org/）找到7 個核心靶點蛋白，保存為PDB 格式文件，在AutoDock v4.2 軟件中對晶體蛋白進行去除結晶水、加氫和去除側鏈殘基處理。有配體的蛋白晶體根據配體活性位點生成活性口袋，無配體結構的蛋白質晶體結構采用自動模式生成活性口袋。將4 個核心潛在化合物和7 個核心靶點蛋白進行分子對接，對接結果通過PyMOL 進行分子間作用力可視化展示。

2 結果

2.1 生脈散活性成分篩選結果

通過中藥數據庫篩選和結合《中國藥典》記載，共得到生脈散48 個成分，591 個潛在靶點，去除重復靶點后共獲得352 個藥物相關靶點。

2.2 核心靶點的篩選結果

檢索GeneCards、OMIM、Drugbank 疾病數據庫，得到糖尿病靶點個數分別為1 111 個、225 個、30 個，篩選并去除重復值后得到靶點1 269 個。得到藥物-疾病共同靶點91 個，繪制venn 圖，見圖1。

圖1 藥疾病靶點venn 圖Fig.1 Distribution of drug targets and disease targets

表1 生脈散中藥—成分—靶標基本信息統計表Table 1 Basic information statistics of Shengmai powder traditional Chinese medicine-ingredients-targets

2.3 成分-靶點網絡構建結果

將生脈散活性成分和作用靶點信息導入Cytoscape 3.7.2 軟件，構建生脈散治療糖尿病的“成分—靶點”網絡圖，見圖2。

圖2 生脈散治療糖尿病的成分-靶點網絡圖Fig.2 Ingredient-target network of Shengmai powder in the treatment of diabetes

2.4 PPI網絡

借助STRING 在線數據庫，按照網站默認設置參數值，對生脈散與糖尿病的97 個交集靶點進行分析，得到PPI 網絡。將結果導入Cytoscape 3.7.2 軟件中，繪制蛋白相互作用網絡圖（圖3）。其中，節點的大小、顏色及其深淺變化代表Degree值的大小。利用Network analyzer 插件進行網絡拓撲屬性分析，得到潛在靶點基因拓撲參數自由度（Degree）、介度中心度（Betweenness）和接近中心度（Closeness），以這3 個參數為參考標準，通過Degree 值排序，選取分值大于中位數的基因作為核心靶點，篩選過程見圖4；將結果繪制條形圖，可見核心靶點有AKT1、TNF、CASP3 和PTGS2等，見圖5。

圖3 生脈散-糖尿病PPI 網絡Fig.3 Shengmai powder-diabetes PPI network

圖4 關鍵節點的篩選策略圖Fig.4 Screening strategy diagram of key nodes

2.5 GO功能富集分析

在DAVID 數據庫中對生脈散和糖尿病的交集靶點進行GO 功能富集分析，共得到293 個BP 條目，29 個CC條目，55 個MF條目（P＜0.05）。利用Graphpad Prism 軟件將Count 值排名前十名的BP、CC 和MF進行可視化（圖6）。涉及細胞質膜、細胞質、細胞外、質膜外區及細胞凋亡過程等多方面主要有：RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調節、轉錄的正調節、對雌二醇的負調節、對缺氧的反應、藥物信號轉導和脂多糖的反應；同二聚化活性酶、血紅素、氧化還原酶活性受體及活性鐵離子的結合等方面，推測生脈散可能通過調節這些生物過程來起到治療糖尿病的作用。

圖6 GO 功能富集分析條形圖（BP、CC、MF 各取前10）Fig.6 Bar graph of GO function enrichment analysis (BP,CC,MF each take the top 10)

2.6 KEGG富集分析

通過DAVID 數據庫對97 個靶點進行KEGG 通路分析得到105 條通路，主要包括TNF 信號通路、HIF-1 信號通路、胰島素抵抗通路、細胞凋亡通路、調節脂肪細胞脂解通路、5-羥色胺能突觸、Toll 樣受體信號通路和脂肪細胞因子信號通路等。根據P-value 值大小，對排列前20 位的通路結果進行可視化，見圖7和表3。

圖7 KEGG 富集分析氣泡圖（前20）Fig.7 KEGG enrichment analysis bubble chart (Top 20)

表3 KEGG 富集分析數據表（前20）Table 3 KEGG enrichment analysis data table (Top 20)

2.7 分子對接

將4 個潛在核心化合物與7 個核心靶點AKT1（PDB ID:6CCY）、CASP3（PDB ID:5IAB）、JUN（PDB ID:5T01）、LEP（PDB ID: 1AX8）、MAPK8（PDB ID:3ELJ）、TNF（PDB ID:5UUI）和PTGS2（PDB ID:）進行分子對接，最終得到28 組受體-配體對接結果。28 組對接結果Affinity 均小于 20.92 kJ/mol，Affinity<-29.288 kJ/mol的有17 組，占60%。其中，對接得分最高的是Stigmasterol-CASP3，分值為-44.768 8 kJ/mol，對接得分最低的是Uridine-TNF，分值為-23.8488kJ/mol，這表明篩選的核心化合物和核心靶點之間有較好的結合活性。網外對接排名前3 的是：Stigmasterol-CASP3（-44.7688kJ/mol），Stigmasterol-PTGS2（-41.0032kJ/mol），Kaempferol-PTGS2（-38.911 2 kJ/mol）。

將對接結果在PyMOL 軟件中可視化，發現化合物Orchinol與靶點AKT1 的1 個氨基酸殘基ALA-230形成1 個氫鍵，化合物Kaempferol 與AKT1 的3 個氨基酸殘基（ARG-241，ARG-249，TYR-437）形成4 個氫鍵，化合物Uridine 與AKT1 的3 個氨基酸殘基（TYR-175，TYR-229，ASP-285）形成7 個氫鍵，化合物Orchinol 與CASP3 的4 個氨基酸殘基（ASN-35，GLN-225，TYR-226，ARG-241）形成4 個氫鍵，化合物Uridine與CASP3的3個氨基酸殘基（TYR-37，MET-39，TYR-276）形成3 個氫鍵，化合物Uridine 與JUN 的3 個氨基酸殘基（DC-12，DG-30，DG-32）形成5 個氫鍵，化合物Kaempferol 與TNF 的3 個氨基酸殘基（TYR-119，GLY-148，TYR-151）形成3 個氫鍵，見圖8和圖9。

圖8 分子對接結果Fig.8 Molecule docking results

3 討論

目前西醫臨床上治療糖尿病的藥物主要分為以下幾類：注射用胰島素以及胰島素類似物（Insulin analogue）[30]-糖苷酶抑制劑[31]（Alpha-glucosidase inhibitor）、磺酰脲類（Sulfonylureas）、雙胍類（Biguanides）、PPAR激動劑[32]、GLP-1 類似物（GLP-1 analogue）和DPP-4 抑制[33]（DPP-4 inhibitors）和SGLT-2（Sodiumdependent glucose transporters 2）抑制劑等，但治療過程中常伴隨不良反應的發生，效果不甚理想。中藥基于整體性治療方法在糖尿病及其多種并發癥的治療中具有一定的優勢。

生脈散作為中藥復方中的經典方劑，用于糖尿病的治療有顯著成效，方劑中人參，麥冬等單味藥經研究均有治療糖尿病的作用[34,35]。本研究通過網絡藥理學的方法，建立生脈散有效成分-疾病-靶點網絡，并通過生物富集分析得到生脈散治療糖尿病相關生物過程、分子功能、細胞組成和信號通路等信息，探討生脈散治療糖尿病及其并發癥可能的作用機制。研究結果表明，生脈散中豆甾醇、-谷甾醇、尿苷和山柰酚等與糖尿病及其并發癥的治療相關性最強，并且生脈散中的活性成分能通過調節AKT1、TNF、CASP3 和PTGS2等多個靶點，及介入TNF 信號通路、HIF-1 信號通路和細胞凋亡信號通路等多種途徑來干預糖尿病的發展進程，從而發揮對糖尿病及其并發癥的治療作用。

Ramur 等[36]研究發現，與對照組相比，豆甾醇和-谷甾醇具有再生細胞的功能，并刺激細胞分泌胰島素，從而發揮在糖尿病大鼠模型中的抗高血糖作用。同時Wang 等[37]研究進一步發現，豆甾醇對2 型糖尿病小鼠有治療作用，其機制可能是增加葡萄糖轉移酶4（GLUT4）的轉位和表達。隨著生物信息學的發展，嘌呤能系統及其對血流調節的影響越來越受到關注，嘌呤能受體功能減弱與糖尿病等多種疾病有關。Thaning等[38]研究確定了2 型糖尿病患者的內皮功能障礙與血管對細胞外核苷酸和核苷的敏感性受損有關。Spasov等[30]研究證明尿嘧啶及其衍生物是抑制糖尿病及其并發癥的物質基礎。Cortes 等[31]通過小鼠動物試驗驗證，尿嘧啶可以通過抑制二肽基肽酶-IV（DPP-4）從而發揮治療糖尿病的作用。以上物質均對糖尿病有一定的改善作用。Akt 亞型受胰島素刺激的差異調節，Akt1 將胰島素信號傳遞到線粒體并調節線粒體復合體V 活性。在胰島素抵抗的2 型糖尿病模型中，Akt1 易位被鈍化[33]，只有Akt1 轉移到線粒體中，該信號通路的失調可能會加速糖尿病腎病的發展。Schreyer 等[39]基于對肥胖型嚙齒動物、糖尿病患者及細胞培養模型的研究表明，TNF-在介導與肥胖相關的胰島素抵抗中發揮作用。TNF-與妊娠期糖尿病病情嚴重程度呈正相關，可能通過損傷血管內皮細胞[40]，誘發妊娠型糖尿病，促進病情發展。CASP3 激活后，通過破壞紅細胞形狀和功能，縮短2 型糖尿病患者紅細胞的壽命，引起血液流變學障礙[41]。You 等[42]研究結果表明miR-378 過表達通過靶向激活CASP3 和PI3K/Akt 信號通路減弱高葡萄糖抑制成骨分化，從而對糖尿病誘導的骨質疏松癥有治療作用。PTGS2，也稱為環加氧酶2，在T2DM的發展中起到促進作用[43]。PTGS2產生前列腺素，它對葡萄糖刺激的胰島素分泌產生負面調節，并作為炎癥反應的介質，這與胰島素敏感性降低有關。總之，生脈散調節糖尿病涉及細胞質膜、細胞質、細胞外、質膜外區和細胞凋亡過程等多方面，RNA聚合酶II 啟動子轉錄的正調節、對雌二醇的負調節、對缺氧的反應、藥物信號轉導和脂多糖的反應；同二聚化活性酶、血紅素、氧化還原酶活性受體和活性鐵離子的結合等方面，推測生脈散可能通過調節這些生物過程來起到治療糖尿病的作用。本研究發現，生脈散調節糖尿病的主要通路包括TNF 信號通路、HIF-1 信號通路、胰島素抵抗、細胞凋亡通路、調節脂肪細胞脂解通路、5-羥色胺能突觸、Toll 樣受體信號通路和脂肪細胞因子信號通路等。腫瘤壞死因子（TNF）是脂肪細胞產生的一種蛋白質，脂肪細胞產生的TNF 增加可能導致肥胖和非胰島素依賴型糖尿病（NIDDM）的胰島素抵抗[44]。TNF已被證明可抑制胰島素受體（IR）和胰島素受體底物（IRS-I）的胰島素模擬酪氨酸磷酸化，并刺激脂肪細胞中胰島素敏感性葡萄糖轉運蛋白GLUT4 的下調。缺氧誘導因子-1（HIF-1）可激活下游多種靶基因在糖尿病并發癥中促進疾病進展[45]。HIF-1是HIF1的活性亞基，當糖尿病腎病病情發展時，血糖高抑制HIF-1的生成，HIF-1保護腎臟的作用削弱，而ET-1等基因的表達增強，促進腎臟纖維化，HIF-1誘導細胞凋亡作用顯現，腎臟嚴重受損，疾病加劇進展。在Toll樣受體激動劑存在條件下，新發糖尿病患者的血清IFN-2、IL-1、IFN-和CXCL-10水平升高[46]，證明先天免疫系統在引發胰島破壞的早期機制中起著關鍵作用。

綜上所述，本研究采用網絡藥理學和分子對接方法，探討生脈散治療糖尿病的作用機制，從整體上分析生脈散和糖尿病之間的關系，一定程度上揭示了生脈散及其主要成分的物質基礎和作用機制，糖尿病的發生、發展涉及多種生物過程和信號通路，中醫藥“多成分、多靶點、多通路”的藥物作用機制恰好與這一特點相契合，這為生脈散治療糖尿病相關的分子生物學研究及更深入的藥理學研究提供了理論參考。