增加骨密度鹿骨片保健食品的功能學和安全性評價

張悅，李珊珊，孫印石，孫德水，霍曉慧

（中國農業科學院特產研究所，吉林 長春 130112）

鹿骨為梅花鹿（Cervus nipon）或馬鹿（Cervus elaphus）等鹿科動物的骨頭，是中國傳統的動物藥材之一。《本草綱目》記載鹿骨有“主內虛，續絕傷，補骨除風”等功效。《唐本草》中記載鹿骨可“主虛勞，可為酒。主風虛，補骨髓”。現代研究表明，鹿骨中含有骨膠原、蛋白質、軟骨素、磷脂質和磷蛋白等成分，能夠促進骨形成以及體內膠原蛋白和彈性蛋白的更新，抑制骨吸收，促進軟骨內骨化[1]。李倩等[2]對鹿骨中的Ca、Na、Mg、K、Fe、Al 及Ag 等19 種元素進行了含量測定，結果表明鹿骨中的常量元素鈣的含量較高，鹿骨可作為鈣補充劑進行開發利用。

隨著人類老齡化社會的到來，骨質疏松發病率呈逐年上升趨勢，越來越多的人意識到補鈣的重要性[3]。骨質疏松癥是一種以骨量減少和骨結構鈣破壞為特征，導致脆性骨折風險增加的一種疾病，在兒童、老年人和絕經后的婦女中最為常見[4]。Calvo 認為，美國絕經婦女患有骨質疏松疾病的原因是由于磷酸鈣分解，血清中磷元素增加[5]。目前研究認為，成骨量少為主要因素，同時與體重、遺傳和運動等因素也息息相關[6,7]。近幾年FDA 批準了阿侖膦酸鈉、激素替代療法作為治療骨質疏松癥的主要策略，但其臨床試驗中心肌梗塞、中風和心血管死亡等風險增加，嚴重限制了其廣泛應用。Mullard[8]和彭斯偉等[9]對單味中藥的抗骨質疏松作用和機制進行了綜合闡述，并在研究中逐漸發現中藥是治療骨質疏松癥安全有效的藥物。鹿骨作為傳統的動物藥材，含有較高的鈣含量及營養成分，但在治療骨質疏松癥方面并未廣泛應用。因此，本研究參考了《保健食品檢驗與評價技術規范》（2003 版）中的“增加骨密度功能檢驗方法”，建立了低鈣動物模型，以碳酸鈣干預作為陽性對照組[10]，對本課題組自主研發的保健食品“鹿骨片”的功能學檢測及安全性進行了評價，以期為該產品的進一步開發提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

鹿骨片為中國農業科學院特產研究所特種動植物加工團隊研制。產品主要由鹿骨粉、維生素D3和輔料組成，規格為0.8 g/片，每次2 片，每日2 次。產品中鹿骨粉含量為62.5 g/100 g，鈣含量為12.53 g/100 g，維生素D3含量為306.67g/100 g。普通飼料、低鈣飼料由北京科奧協力飼料有限公司生產，其中普通飼料的鈣離子含量為1.22%，低鈣飼料配方，見表1。碳酸鈣為食品級，其余試劑均為國產分析純。

表1 低鈣飼料配方Table 1 Low calcium feed formulation

1.2 試驗動物

選用遼寧長生生物技術股份有限公司繁殖的清潔級Wistar 健康雄性大鼠48 只，體重為132～159 g，生產許可證SCXK（遼）2018-0001，試驗動物在溫度20～25 ℃、相對濕度為40%～70%的環境中飼養。

1.3 儀器

電子天平、722S 分光光度計、全自動生化分析儀（美國貝克曼BECKMAN COULTER AU680）、血乳酸分析儀（英國Analox EKF Lactate scout）、高速臺式離心機（上海安亭TGL-16G）。

1.4 增加骨密度試驗方法

1.4.1 試驗動物分組及處理 將48 只Wistar 雄性大鼠隨機分為6 組，每組8 只，分別為對照組、模型組、碳酸鈣（250 mg/kg）組和給藥劑量組。除對照組以普通飼料飼養外，其他5 組大鼠以低鈣飼料飼養進行造模。按照人體推薦量的5 倍、10 倍及15 倍設置的鹿骨片低、中和高給藥劑量（265 mg/kg、530 mg/kg和795 mg/kg）組。陽性組給予碳酸鈣250 mg/kg，對照組和模型組給予等量生理鹽水，各組均每天給藥1次，連續給藥90 d。

1.4.2 骨密度測定 試驗大鼠每天測定體重，90 d 后將各組大鼠處死并迅速取出右側股骨，去除附著的軟組織，然后將骨組織置于4%多聚甲醛溶液中固定。取出另一側股骨在105 ℃烘箱中烘干至恒重，置于樣品瓶中消化后利用原子吸收分光光度計測定骨鈣含量。另外將多聚甲醛固定的樣本放入樣品杯中并固定，利用micro CT，在相同條件（掃描電壓70 kV，掃描電流200A，層距20.13m，平面分辨率300 ms，連續掃描約808 層）下掃描，測定骨密度。

1.5 小鼠急性毒性試驗

選用清潔級ICR 健康成年小鼠20 只，雌、雄各10 只，在動物房內檢疫室檢疫飼養5d，體重為17.5～20.7g。試驗前動物禁食16 h、不禁水，用最大耐受量進行小鼠急性毒性試驗。受試樣品直接灌胃，比重為1.1 g/kg，按最大灌胃量20 mL/（kg·bw）一次性給樣，受試物給予劑量為22.0 g/（kg·bw）。連續觀察14 d，記錄中毒表現及死亡情況。

1.6 大鼠30 d喂養試驗

選用清潔級SD 健康離乳大鼠80 只，在動物房內檢疫室檢疫3 d，按體重隨機分為4 組，每組20 只，雌、雄各半。受試樣品為干燥粉末，折合人體推薦劑量為3.2 g/人（以60 kg 體重計），按人體推薦量的50 倍、75倍和100 倍設鹿骨片低劑量組[每天2.66 g/（kg·bw），BL]、鹿骨片中劑量組[每天3.98 g/（kg·bw），BM]、鹿骨片高劑量組[每天5.31 g/（kg·bw），BH]，另設一個溶劑對照組[每天0 g/（kg·bw），C]。樣品均用無菌水配制，對照組以無菌水代替受試物，每天1 次灌胃，給藥量為10 mL/（kg·bw）。大鼠連續30 d按劑量灌胃含受試樣品飼料，自由進食飲水，每周稱1 次體重，每天觀察動物的一般情況，有無中毒表現和死亡。試驗結束后，觀察體重、血液學指標、血液生化指標、臟器指數和病理學檢查。

2 結果與討論

2.1 鹿骨片對大鼠體重的影響

以265 mg/kg、530 mg/kg、795 mg/kg 劑量經口給予大鼠鹿骨片90 d 后，由圖1 可知，給予低鈣飼料的模型組大鼠體重明顯低于對照組（P ＜0.05），證明造模成功。各劑量組大鼠的體重持續增長且一般狀態良好，試驗期間無不適反應。模型組、給藥組及碳酸鈣組大鼠體重差異不顯著（P ＞0.05）。

圖1 大鼠體重變化Fig.1 Body weight changes of rats

2.2 鹿骨片對大鼠骨鈣含量的影響

由圖2 可知，給予低鈣飼料的模型組大鼠骨鈣含量明顯低于正常對照組（P ＜0.05），給予鹿骨片90 d后，碳酸鈣組及鹿骨片低、中劑量組的大鼠骨鈣含量明顯高于未給藥的模型組（P ＜0.05），而鹿骨片高劑量組與模型組相比沒有顯著差異。因此，鹿骨片能夠提高低鈣大鼠骨鈣的含量。

圖2 大鼠左側股骨骨鈣含量變化Fig.2 Changes of calcium content in left femur of rats with increased bone mineral density

2.3 鹿骨片對大鼠骨密度的影響

由圖3 和圖4 可知，給予低鈣飼料的模型組大鼠遠心端骨密度及中心點骨密度均明顯低于正常對照組（P＜0.01）。給藥后，碳酸鈣組及鹿骨片低劑量組的大鼠遠心端骨密度及中心點骨密度均高于模型組M（P＜0.05），且鹿骨片補鈣效果呈劑量依賴性，中、高劑量組遠心端骨密度及中心點骨密度均顯著高于模型組（P＜0.01）。其中高劑量組基本可使大鼠骨密度恢復至正常程度。因此，鹿骨片具有增加缺鈣大鼠骨密度的作用。

圖3 給藥期間大鼠右側股骨遠心端密度變化Fig.3 Changes in the density of the right distal femur in rats during the drug administration

圖4 給藥期間大鼠右側股骨中心點骨密度變化Fig.4 Changes in bone mineral density at the right femoral centroid in rats during drug administration

2.4 急性毒性試驗

由表2 可見，急性毒性試驗觀察期間，鹿骨片對小鼠體重無影響。各組動物飲食和活動正常，生長良好，未見任何中毒表現，無死亡。鹿骨片的雌、雄性小鼠急性經口的最大耐受量（MTD）大于22.0 g/（kg·bw），按《保健食品檢驗與評價技術規范》（2003 版）規定，屬于無毒級。

表2 鹿骨片小鼠急性毒性（±）Table 2 Acute oral toxicity of deer bone tablet in mice (±)

表2 鹿骨片小鼠急性毒性（±）Table 2 Acute oral toxicity of deer bone tablet in mice (±)

2.5 30 d 喂養試驗

2.5.1 一般觀察 試驗期間，對照組和各劑量組大鼠經過一般觀察，飲食和活動正常，生長良好，均未見異常癥狀和體征，未見任何中毒及死亡現象。

2.5.2 鹿骨片對大鼠體重的影響 各劑量組雌、雄大鼠的體重持續增長且狀態良好，各組動物飲食和活動正常，試驗期間無不適反應且未見異常癥狀和體征，鹿骨片低、中、高劑量組與對照組相比均無顯著性差異（P＞0.05），表明鹿骨片對大鼠體重無明顯影響，結果見表3。

表3 鹿骨片對大鼠體重的影響（±，N=10）Table 3 Influence of deer bone tablet on body weight of rats (±,N=10)

表3 鹿骨片對大鼠體重的影響（±，N=10）Table 3 Influence of deer bone tablet on body weight of rats (±,N=10)

2.5.3 鹿骨片對大鼠血液學指標的影響 由表4 結果可知，雌、雄大鼠對照組和各劑量組的紅細胞計數、白細胞計數及其分類均在正常范圍內，結果表明鹿骨片對大鼠血液學指標的差異無統計學意義（P＞0.05）。

表4 鹿骨片對大鼠血液學指標的影響（±，N=10）Table 4 Influence of deer bone tablet on hematological indices of rats (±,N=10)

表4 鹿骨片對大鼠血液學指標的影響（±，N=10）Table 4 Influence of deer bone tablet on hematological indices of rats (±,N=10)

2.5.4 鹿骨片對大鼠血液部分生化指標的影響 由表5 可見，雌、雄大鼠對照組和鹿骨片各劑量組的血清谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、總蛋白、白蛋白、總膽固醇、甘油三酯、尿素氮、肌酐和血糖均在正常參考值范圍內。表明鹿骨片對大鼠血液部分生化指標的差異無統計學意義（P ＞0.05）。

表5 鹿骨片對大鼠血液部分生化指標的影響（±，N=10）Table 5 Effects of deer bone tablet on some blood biochemical indexes of rats (±,N=10)

表5 鹿骨片對大鼠血液部分生化指標的影響（±，N=10）Table 5 Effects of deer bone tablet on some blood biochemical indexes of rats (±,N=10)

2.5.5 病理學及組織檢查 由表6 可見，各劑量組肝臟、腎臟、脾臟、睪丸和卵巢絕對重量與對照組比較，差異不顯著（P＞0.05）。通過對大鼠解剖，未見由該受試物引起的肝、腎、脾、胃、十二指腸、睪丸和卵巢臟器毒性病理改變。

表6 鹿骨片對大鼠臟器絕對重量（±，N=10）Table 6 Effect of deer bone tablet on the absolute weight of rats'organs (±,N=10)

表6 鹿骨片對大鼠臟器絕對重量（±，N=10）Table 6 Effect of deer bone tablet on the absolute weight of rats'organs (±,N=10)

骨骼中的蛋白質90%為膠原蛋白、骨膠原及軟骨素，具有促進皮層細胞代謝、防止人體老化的功能[11]。其中骨膠原和鈣組成了獨特的補鈣途徑，能夠增加骨密度，強化骨骼韌性，達到預防和改善骨質疏松的作用[12]。鹿骨中含有較多的骨膠原[13]，通過促進軟骨內骨化及體內膠原蛋白及彈性蛋白的更新功能，起到增加成骨量的作用，又因含有較高的鈣含量，鈣、磷含量比為18.44: 9.92≈1.86: 1，接近人體吸收鈣磷的最佳比例（鈣:磷≈2:1）[13]，在增加骨密度、骨鈣含量方面具有一定優勢，可作為鈣補充劑開發利用[14]。鹿骨中含有的氨基酸總量為24.69%，必需氨基酸占氨基酸總量的16.65%，具有豐富的營養成分以及較高的經濟價值[15]。

骨重建是存在于人類生命中的一個長期持續性的過程，骨重建是依靠甲狀旁腺素和降鈣素的水平調控，通過骨吸收和骨生成過程得以實現的平衡活動[16]。骨質疏松的根本原因就是新骨量的產生少于被吸收骨量，導致的骨重建平衡活動的失衡，骨量的丟失[17]。故骨密度測定被認定為是評價骨質疏松程度的客觀量化指標及主要依據[18]。鹿骨作為傳統動物藥之一，雖具有著較高鈣含量，但在預防骨質疏松癥方面的研究較少。本研究以鹿骨片高、中和低3 個劑量組對缺鈣模型大鼠進行灌胃90 d 后，大鼠的骨密度顯著增加，骨鈣含量顯著高于低鈣模型組大鼠，且與碳酸鈣組大鼠無顯著差異，且鹿骨片的雌、雄性小鼠急性經口MTD大于22.0 g/（kg·bw），屬于無毒級，可以安全食用。本研究結果表明鹿骨片具有一定的預防骨質疏松癥的作用，可為該產品的進一步開發提供數據支持。

3 結論

以鹿骨片高、中和低3 個劑量組（265 mg/kg、530 mg/kg、795 mg/kg）灌胃缺鈣模型大鼠90 d 后，大鼠的骨密度顯著增加，骨鈣含量顯著高于低鈣模型組大鼠，且與碳酸鈣組大鼠無顯著差異。根據衛生部《保健食品檢驗與評價技術規范》（2003 版），可判定鹿骨片具有增加骨密度及骨鈣含量的功能。小鼠急性毒性試驗中，鹿骨片對小鼠體重無影響且各組動物飲食和活動正常，生長良好，未見任何中毒表現及死亡情況。鹿骨片的雌、雄性小鼠急性經口最大耐受量（MTD）大于22.0 g/（kg·bw），屬于無毒級。每天給予大鼠低、中、高[2.66 g/（kg·bw）、3.98 g/（kg·bw）和5.31 g/（kg·bw）]3 個劑量30 d 后，大鼠一般情況良好，體重及臟器指標無顯著異常，血液學指標及部分生化指標結果均在標準范圍內，各臟器病理組織學檢查未見異常病理改變。根據衛生部《保健食品檢驗與評價技術規范》（2003版）之30 d 喂養試驗結果判定，鹿骨片最大劑量未觀察到有害作用，屬于無毒級。本研究結果表明，鹿骨片具有預防骨質疏松的作用且無害，且為拓展鹿骨在預防骨質疏松方面的應用提供理論依據。