基于GEO芯片挖掘聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接探討當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療股骨頭壞死分子機(jī)制

黃為，黃有榮，章曉云，韋宗波，葉來(lái)生，馮海波，李宏宇，孟林※

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院骨科，廣西 南寧 530011；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，湖南 長(zhǎng)沙 410005；3.廣西骨傷醫(yī)院，廣西 南寧 530000）

股骨頭壞死是骨科常見(jiàn)且難治性疾病之一，是由于股骨頭血供受損，進(jìn)而導(dǎo)致骨組織凋亡，出現(xiàn)股骨頭塌陷，造成患者關(guān)節(jié)疼痛，功能障礙的疾病。據(jù)流行病學(xué)結(jié)果表明，目前我國(guó)約有812 萬(wàn)例非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者，并且每年新增約10～20 萬(wàn)例[1,2]。如果早期沒(méi)有進(jìn)行有效的干預(yù)和治療，將會(huì)進(jìn)一步加重髖關(guān)節(jié)活動(dòng)受限，甚至是導(dǎo)致殘疾，嚴(yán)重影響患者身心健康和生活質(zhì)量，給患者帶來(lái)極大的痛苦[3]。目前，股骨頭壞死的發(fā)病原因及機(jī)制還不是十分清楚?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)暫未發(fā)現(xiàn)有效的治療藥物，而近年來(lái)通過(guò)大量臨床實(shí)踐與細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，祖國(guó)醫(yī)學(xué)部分中藥對(duì)治療股骨頭壞死具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[4]，其不僅可以緩解股骨頭壞死的進(jìn)程，還可以促進(jìn)壞死的骨組織修復(fù)，逐漸被人們認(rèn)可。

目前有不少學(xué)者對(duì)股骨頭壞死相關(guān)中藥復(fù)方進(jìn)行研究，但缺乏對(duì)發(fā)病機(jī)制的闡明與系統(tǒng)總結(jié)。當(dāng)歸補(bǔ)血湯史載于李東垣所著《內(nèi)外傷辨惑論》，由黃芪、當(dāng)歸兩味藥以5:1 組成，是益氣補(bǔ)血的經(jīng)典名方?，F(xiàn)代藥理研究表明[5,6]，其具有促進(jìn)造血、調(diào)節(jié)免疫功能和保護(hù)肝臟等作用，不僅可以增強(qiáng)股骨頭內(nèi)骨組織的成骨信號(hào)和成血管信號(hào)，還可以改善骨密度，從而起到減緩股骨頭壞死的作用。因此，本文通過(guò)GEO 數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接的技術(shù)，探討當(dāng)歸補(bǔ)血湯活性成分、靶點(diǎn)與ONFH 之間的關(guān)系，以期為ONFH 的藥物開發(fā)提供一定的參考和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯活性成分預(yù)測(cè)

利用TCMSP 數(shù)據(jù)平臺(tái)檢索并篩選出當(dāng)歸補(bǔ)血湯中當(dāng)歸和黃芪2 味中藥的活性成分。同時(shí)以類藥性（DL）≥0.18 與口服生物利用度（OB）≥30% 為篩選指標(biāo)，篩選出當(dāng)歸補(bǔ)血湯中活性成分所對(duì)應(yīng)的藥物靶點(diǎn)。并把所得到的藥物靶點(diǎn)名稱借助UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因信息匹配、數(shù)據(jù)處理轉(zhuǎn)化為靶基因名稱。

1.2 股骨頭壞死靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)GeneCards、PharmGkb 及OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)，將“Osteonecrosis of the femoral head”作為關(guān)鍵詞，進(jìn)行篩選股骨頭壞死相關(guān)的治療靶點(diǎn)。再?gòu)腉EO（Gene expression omnibus）數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出與股骨頭壞死相關(guān)的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，并查找符合條件的基因芯片數(shù)據(jù)集；再利用GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中的GEO2 R進(jìn)行在線分析，以|logFC|≥1.5 且P ＜0.05 為差異表達(dá)基因的篩選條件，最后通過(guò)微生信在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異基因繪制差異基因熱圖及火山圖。

1.3 當(dāng)歸補(bǔ)血湯與股骨頭壞死共有靶點(diǎn)基因的篩選

將當(dāng)歸補(bǔ)血湯中藥物靶點(diǎn)基因和股骨頭壞死疾病的靶點(diǎn)基因上傳至在線微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）數(shù)據(jù)庫(kù)獲取共同靶點(diǎn)基因，同時(shí)繪制Venn圖，獲得當(dāng)歸補(bǔ)血湯與股骨頭壞死疾病共有的靶點(diǎn)基因。

1.4 “當(dāng)歸補(bǔ)血湯活性成分-作用靶點(diǎn)”以及“當(dāng)歸補(bǔ)血湯-活性成分-股骨頭壞死”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將當(dāng)歸補(bǔ)血湯的活性成分與作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件中，進(jìn)行“當(dāng)歸補(bǔ)血湯活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。同時(shí)使用Cytoscape 軟件中的CytoNCA 插件計(jì)算出網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的自由度（Degree），根據(jù)Degree 的大小與相關(guān)節(jié)點(diǎn)數(shù)量呈正比，篩選出靶點(diǎn)數(shù)目較多的關(guān)鍵活性成分。再將當(dāng)歸補(bǔ)血湯活性成分、當(dāng)歸補(bǔ)血湯-股骨頭壞死共同靶點(diǎn)基因、當(dāng)歸補(bǔ)血湯和股骨頭壞死數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件中，進(jìn)行“當(dāng)歸補(bǔ)血湯-活性成分-股骨頭壞死”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將當(dāng)歸補(bǔ)血湯-股骨頭壞死的共同靶點(diǎn)基因?qū)隨tring 在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，同時(shí)設(shè)置物種為“Homo Sapiens”，取最低置信度為0.4，可得到當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療股骨頭壞死的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，然后使用Cytoscape 軟件中插件Network Analyzer 功能進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)靶點(diǎn)的度值（Degree），按度值的高低設(shè)置每個(gè)節(jié)點(diǎn)大小及顏色，取排名前10 的靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)，獲取當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療股骨頭壞死的核心靶點(diǎn)，并建立核心靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 GO功能分析與KEGG富集分析

將當(dāng)歸補(bǔ)血湯-股骨頭壞死的共同靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入DAVID 在線平臺(tái)進(jìn)行GO 功能富集分析以及KEGG通路富集分析，并將富集得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel，再根據(jù)P ＜0.05 的結(jié)果進(jìn)行篩選，當(dāng)P ＜0.05 時(shí)表示富集結(jié)果顯著。再將篩選后的數(shù)據(jù)傳入在線微生信軟件，最后繪制GO 功能分析柱狀圖和KEGG 富集分析氣泡圖。

1.7 構(gòu)建“信號(hào)通路-基因”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

將步驟1.6 所得與股骨頭壞死聯(lián)系密切的信號(hào)通路與其對(duì)應(yīng)的基因?qū)隒ytoscape 中，分析這些信號(hào)通路及其所調(diào)控的基因，并繪制“信號(hào)通路-基因”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.8 分子對(duì)接驗(yàn)證

將1.4 中所得的當(dāng)歸補(bǔ)血湯中的關(guān)鍵活性成分以及1.5中所得的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，首先從TCMSP在線數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出關(guān)鍵活性成分的小分子配體2D結(jié)構(gòu)，再利用Chem3D 軟件將關(guān)鍵活性成分的小分子配體2D 結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為3D 結(jié)構(gòu)；然后從PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取核心蛋白基因的3D 結(jié)構(gòu)，之后使用PyMOL 軟件進(jìn)行處理，將水分子、磷酸根及小分子配體進(jìn)行去除，然后采用AutoDockTools 軟件將配體與受體格式轉(zhuǎn)換為pdbqt 格式，并通過(guò)Vina 軟件進(jìn)行分子對(duì)接。按照結(jié)合自由能（Gbind，kJ/mol）大小來(lái)評(píng)估二者的結(jié)合活性，選取結(jié)合自由能≤-5.0kJ/mol 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，來(lái)評(píng)價(jià)其預(yù)測(cè)的可靠性，最后使用PyMOL 進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯活性化合物的篩選結(jié)果

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)共獲得當(dāng)歸補(bǔ)血湯的有效成分345 個(gè)，其中黃芪87 個(gè)，當(dāng)歸125 個(gè)，然后將OB≥30% 和DL≥0.18 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行篩選，共得到中藥復(fù)方22 個(gè)活性化學(xué)成分，其中黃芪為20 個(gè)（其中3 個(gè)無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)），當(dāng)歸2 個(gè)，主要活性成分的基本信息，見(jiàn)表1。

表1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯中潛在活性成分的基本信息Table 1 Basic information on potential active ingredients in Danggui Buxue Decoction

2.2 股骨頭壞死作用靶點(diǎn)篩選結(jié)果

從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇股骨頭壞死相關(guān)的芯片，得到編號(hào)為：GSE123568 的芯片數(shù)據(jù)文件和GPL15207基因注釋文件，本芯片總共40 個(gè)獨(dú)立樣本，包括股骨頭壞死患者30 例和健康對(duì)照者10 例；利用GEO2 R進(jìn)行在線分析，共獲得49 293 個(gè)PF 差異基因，并繪制火山圖，見(jiàn)圖1。以P ＜0.05 和|logFC| ≥1.5 為篩選條件，分別選取排名前15 的上調(diào)差異基因與下調(diào)差異的基因，繪制熱圖（其中A 組為健康對(duì)照者，B 組為股骨頭壞死患者），見(jiàn)圖2。其中紅色代表上調(diào)基因，綠色則表示下調(diào)基因，顏色程度越高，則表明這些基因可能在股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮的作用就越大。篩選后共獲得309 個(gè)DEGs，其中有253 個(gè)為上調(diào)基因，56 個(gè)為下調(diào)基因。再通過(guò)GeneCards、PharmGkb及OMIM 等數(shù)據(jù)庫(kù)，將“Osteonecrosis of the femoral head”作為關(guān)鍵詞，進(jìn)行篩選股骨頭壞死相關(guān)的治療靶點(diǎn)，共獲得股骨頭壞死的相關(guān)靶點(diǎn)731 個(gè)。最后將GEO數(shù)據(jù)庫(kù)納入，刪除重復(fù)項(xiàng)后共納入902 個(gè)股骨頭壞死靶點(diǎn)基因。

圖1 GSE123568 的芯片差異基因熱圖Fig.1 Chip differential gene heat of GSE123568

圖2 GSE123568 的芯片差異基因火山圖Fig.2 Chip differential gene volcano map of GSE123568

2.3 當(dāng)歸補(bǔ)血湯-股骨頭壞死共同靶點(diǎn)基因的預(yù)測(cè)結(jié)果

本研究通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)共獲得中藥復(fù)方當(dāng)歸補(bǔ)血湯活性成分靶點(diǎn)203 個(gè)，將2.2 所得的疾病靶點(diǎn)基因與藥物靶點(diǎn)基因取交集共獲得45 個(gè)共同靶點(diǎn)基因并繪制Venn（圖3）。

圖3 當(dāng)歸補(bǔ)血湯-股骨頭壞死共同靶點(diǎn)基因韋恩圖Fig.3 Danggui Buxue Decoction-Venn diagram of common target genes for femoral head necrosis

2.4 “當(dāng)歸補(bǔ)血湯活性成分-作用靶點(diǎn)”以及“當(dāng)歸補(bǔ)血湯-活性成分-股骨頭壞死”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

借助Cytoscape 軟件（版本3.8.0）構(gòu)建當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療股骨頭壞死的“當(dāng)歸補(bǔ)血湯活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，共獲得15 個(gè)活性成分節(jié)點(diǎn)、45 個(gè)作用靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)和99 條邊線，見(jiàn)圖4。同時(shí)通過(guò)Cytoscape 軟件構(gòu)建“當(dāng)歸補(bǔ)血湯-活性成分-股骨頭壞死”網(wǎng)絡(luò)，共獲得15 個(gè)活性成分節(jié)點(diǎn)、45 個(gè)作用靶標(biāo)節(jié)點(diǎn)和159條邊線，見(jiàn)圖5。圖4 結(jié)果表明該網(wǎng)絡(luò)中Degree 值排名前5 位的關(guān)鍵活性成分分別是山柰酚、槲皮素、芒柄花素、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇和異鼠李素等，這些可能為當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療股骨頭壞死的主要潛在作用靶點(diǎn)，其基本信息如表2。

圖4 當(dāng)歸補(bǔ)血湯活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Fig.4 Relationship diagram between active ingredients and action target network of Danggui Buxue Decoction

表2 當(dāng)歸補(bǔ)血湯關(guān)鍵活性成分的基本信息Table 2 Basic information on key compounds of Danggui Buxue Decoction

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Cytoscape 軟件共挖掘出PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)45 個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)、611 條靶點(diǎn)蛋白間的互作關(guān)系（圖6），其中Degree 值越高，圖中的節(jié)點(diǎn)也就越大，對(duì)應(yīng)橢圓形顏色就越深，代表在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的作用也就越大。結(jié)果表明，Degree 排名前10 的共包括炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素6（IL-6）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）、基質(zhì)金屬肽酶9（MMP9）、腫瘤壞死因子及炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1（IL-1）等靶點(diǎn)基因，見(jiàn)圖7。這些靶點(diǎn)基因在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中起著至關(guān)重要的作用，可能是治療股骨頭壞死的核心靶點(diǎn)。

圖6 當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療股骨頭壞死的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Protein interaction network diagram of Danggui Buxue Decoction in treating femoral head necrosis

圖7 核心靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.7 Core target protein interaction network diagram

2.6 GO 功能分析

將45 個(gè)共同靶點(diǎn)基因?qū)隓AVID平臺(tái)進(jìn)行GO功能分析，共獲得373 個(gè)條目（P ＜0.05），其中生物過(guò)程（BP）條目為294 個(gè)、細(xì)胞組分（CC）條目為26 個(gè)，分子功能（MF）條目為53 個(gè)。從生物過(guò)程的相關(guān)條目分析，主要參與轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控，DNA 模板基因表達(dá)的正調(diào)控、RNA 聚合酶II 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)、凋亡過(guò)程的正調(diào)控、對(duì)藥物的反應(yīng)、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控等過(guò)程；從細(xì)胞組分的相關(guān)條目分析，主要包括細(xì)胞外間隙、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)等區(qū)域；從分子功能的相關(guān)條目分析，主要與蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞因子活性、蛋白激酶結(jié)合等方面相關(guān)。按P 值大小排序，選取每個(gè)模塊靠前10位的條目進(jìn)行展示，見(jiàn)圖8。

圖8 GO 功能富集分析Fig.8 GO functional enrichment analysis

2.7 KEGG 富集分析及“信號(hào)通路-基因”關(guān)系構(gòu)建

將45 個(gè)共同靶點(diǎn)基因?qū)隓AVID 平臺(tái)進(jìn)行KEGG 富集分析，共獲得信號(hào)通路101 條，然后根據(jù)P 值的大小進(jìn)行排序，篩選出排名靠前的20 位條目，見(jiàn)圖9。主要涉及PI3K-Akt、MAPK、TNF、AGERAGE、IL-17 等信號(hào)通路，將這5 條信號(hào)通路及其對(duì)應(yīng)的基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件進(jìn)行“信號(hào)通路-基因”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，見(jiàn)圖10。結(jié)果表明，當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療股骨頭壞死通過(guò)多靶點(diǎn)、多成分、多信號(hào)通路共同作用。其中TNF信號(hào)通路包含了11 個(gè)交集基因，6 個(gè)核心基因，這些基因可能從細(xì)胞增殖的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)、凋亡過(guò)程的正調(diào)控、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控等方面來(lái)調(diào)節(jié)股骨頭壞死的發(fā)生與發(fā)展，在當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療股骨頭壞死過(guò)程中具有重要的地位，同時(shí)將當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療股骨頭壞死發(fā)揮重要調(diào)控作用的靶點(diǎn)進(jìn)行紅色標(biāo)記展示，見(jiàn)圖11。

圖9 KEGG 信號(hào)通路氣泡圖Fig.9 KEGG signal pathway bubble diagram

圖10 信號(hào)通路-基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖Fig.10 Signal pathway gene relationship network diagram

圖11 TNF 信號(hào)通路圖Fig.11 TNF signal pathway diagram

2.8 分子對(duì)接驗(yàn)證

將2.4 項(xiàng)所得的5 個(gè)關(guān)鍵活性成分與2.5 項(xiàng)所得的10 個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示當(dāng)歸補(bǔ)血湯關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)蛋白的分子對(duì)接結(jié)合能均＜-5 kJ/mol，當(dāng)結(jié)合能＜0 kJ/mol時(shí)表明配體與受體之間存在結(jié)合活性，當(dāng)結(jié)合能＜-5.0 kJ/mol 時(shí)表明結(jié)合活性強(qiáng)[7]。結(jié)果表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯中關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)蛋白有較好的結(jié)合活性，結(jié)果見(jiàn)表3。選取親和力排名前4 的槲皮素分別與細(xì)胞因子白細(xì)胞介素6（IL-6）、基質(zhì)金屬肽酶9（MMP9）、腫瘤壞死因子進(jìn)行分子對(duì)接展示；山柰酚與腫瘤壞死因子進(jìn)行分子對(duì)接展示，見(jiàn)圖12。

圖12 當(dāng)歸補(bǔ)血湯關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接Fig.12 Molecular docking between key active ingredients and core targets of Danggui Buxue Decoction

表3 當(dāng)歸補(bǔ)血湯的關(guān)鍵活性成分和核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果Table 3 Molecular docking results of key active ingredients and core targets of Danggui Buxue Decoction 單位：kJ/mol

3 討論

中醫(yī)學(xué)將股骨頭壞死歸屬于“骨蝕”等范疇，且在《靈樞·長(zhǎng)刺節(jié)真邪》曾有論述：“虛邪之入身也深……內(nèi)傷骨為骨蝕”，認(rèn)為ONFH 主要是因?yàn)橄忍觳蛔?，邪氣入骨，久留致病等，描述其病機(jī)多與血瘀痰阻、經(jīng)絡(luò)阻滯、肝腎虧虛、氣血不足等密切相關(guān)[8]，并在股骨頭壞死早期，患者多表現(xiàn)為氣滯血瘀與氣血兩虛證候，因此采用活血祛瘀、養(yǎng)血益氣的方法治療股骨頭壞死至關(guān)重要[9]。臨床上多使用當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療股骨頭壞死，其通過(guò)降低股骨頭骨細(xì)胞凋亡，增加其骨細(xì)胞密度，抑制破骨細(xì)胞，從而起到減緩股骨頭壞死發(fā)生的目的[10]，但其藥理機(jī)制尚未清楚，因此文章采用GEO 數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，從微觀層面探討該方治療股骨頭壞死的分子機(jī)制，以期為下一步研究當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療股骨頭壞死的藥理機(jī)制提供方向和參考。

本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵活性成分由槲皮素（Quercetin）、山柰酚（Kaempferol）、7-O-甲基異微凸劍葉莎醇（7-O-methylisomucronulatol）、芒柄花素（Formononetin）和異鼠李素等組成。槲皮素、芒柄花素及山柰酚均屬于黃酮類化合物，存在于諸多傳統(tǒng)中藥材中，有研究表明槲皮素、山柰酚等能夠調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核因子-k（NF-k）、Wnt/ -連環(huán)蛋白和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/SMAD（BMP-2/SMAD）等信號(hào)通路來(lái)影響骨的重建[11]。槲皮素活性成分不僅可提高抗氧化活性和清除自由基，還可抑制破骨細(xì)胞生成，促進(jìn)骨形成作用[12]。此外山柰酚也具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、抗骨質(zhì)疏松以及抗過(guò)敏等功效[13]。已經(jīng)有研究證明山柰酚可促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，并能通過(guò)降解p62/SQSTM1 來(lái)抑制自噬激活的細(xì)胞凋亡，從而降低破骨細(xì)胞的分化程度[14]。而芒柄花素同為異黃酮類植物化合物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫雌激素樣及預(yù)防骨質(zhì)疏松等多種功效[15]。研究表明芒柄花素能夠通過(guò)抑制破骨細(xì)胞中CTSK、TRAP、MMP9、Car2 等相關(guān)功能基因的表達(dá)，從而可防治骨質(zhì)破壞，最終達(dá)到減緩股骨頭壞死和塌陷的作用[16]。目前尚未發(fā)現(xiàn)異鼠李素和7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇與股骨頭壞死治療的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，但研究發(fā)現(xiàn)7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇在心血管疾病、血液系統(tǒng)疾病、慢性炎癥性疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面具有潛在的價(jià)值，因此在今后的研究中值得進(jìn)一步深入挖掘。

通過(guò)PPI 網(wǎng)絡(luò)表明IL-6、VEGFA、MMP9、TNF-及IL-1B 可能是當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療股骨頭壞死的核心靶點(diǎn)。白細(xì)胞介素-6（IL-6）是一種促炎細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的活性[17]。Gao等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，股骨頭壞死III 期滑液促炎細(xì)胞因子IL-6和CTX-II 水平顯著升高，并有肉眼可見(jiàn)的骨質(zhì)塌陷，且在股骨頭壞死II 期關(guān)節(jié)軟骨中，軟骨細(xì)胞周圍有對(duì)稱的軟骨基質(zhì)沉積。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A（VEGF-A）是一種高度保守的分泌信號(hào)蛋白，具有促進(jìn)軟骨內(nèi)骨形成、增加血管通透性、促進(jìn)細(xì)胞遷移等作用[19,20]。有研究表明，VEGF能夠增強(qiáng)血管通透性，并影響體內(nèi)外破骨細(xì)胞的骨吸收，從而影響股骨頭壞死的修復(fù)[21]。白細(xì)胞介素-1B（IL-1B）是炎癥性關(guān)節(jié)炎發(fā)展中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也是軟骨降解中重要介質(zhì)[22]。Yu 等[23]通過(guò)對(duì)激素性股骨頭壞死患者IL-1B 基因的篩選試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，IL-1B 基因影響類固醇誘導(dǎo)的股骨頭壞死的遺傳易感性。MMP-9 與MMP-13 及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是骨骼組織重塑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，能參與內(nèi)皮細(xì)胞、破骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和骨祖細(xì)胞的募集和分化[24]。安非夢(mèng)等[25]研究發(fā)現(xiàn)，MMP9 不僅在骨重塑過(guò)程中起著重要的作用，而且能促進(jìn)炎癥細(xì)胞的表達(dá)。因此，不管是炎癥反應(yīng)還是成骨與破骨細(xì)胞平衡被打破都可能進(jìn)一步導(dǎo)致股骨頭壞死的發(fā)生。

GO 功能富集分析顯示，當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療ONFH主要涉及調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)等方面。KEGG 信號(hào)通路主要富集在PI3K-Akt、MAPK、TNF及IL-17 等信號(hào)通路，預(yù)測(cè)了當(dāng)歸補(bǔ)血湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、破骨細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡等方面治療股骨頭壞死。白細(xì)胞介素17（IL-17）在炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。IL-17 家族通過(guò)發(fā)送相關(guān)信號(hào)給受體蛋白，從而激活NF-B、MAPKs等下游通路，進(jìn)一步促進(jìn)趨化因子和細(xì)胞因子的表達(dá)[26]。而NF-B 是一種具有多效性的轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控破骨細(xì)胞的生成與發(fā)展[27]。Zou 等[28]在髖關(guān)節(jié)滑液和外周血樣本的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，輔助性T 細(xì)胞17（T-helper 17,Th17）被聚集到發(fā)炎的滑膜中，炎性細(xì)胞因子IL-17在股骨頭壞死患者的髖關(guān)節(jié)滑膜中表達(dá)水平升高，研究表明IL-17 將有助于成為治療股骨頭壞死的新策略，進(jìn)而來(lái)減少患者的炎癥和疼痛。磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）是脂質(zhì)激酶，參與細(xì)胞增殖、黏附與運(yùn)動(dòng)等過(guò)程。在PI3K/Akt 信號(hào)通路中，通過(guò)磷脂酰肌苷激酶的刺激，使蛋白激酶B（Akt）與細(xì)胞膜結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)Akt 從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并進(jìn)一步導(dǎo)致各種細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)以及細(xì)胞癌變的生物學(xué)效應(yīng)[29]。Lu 等[30]在建立SONFH 的大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠相比，在SONFH 的股骨頭中FOXO1 轉(zhuǎn)錄因子活性表達(dá)增加，且凋亡細(xì)胞數(shù)量也隨之增加，繼而導(dǎo)致骨細(xì)胞空洞、骨組織含量和股骨頭完整性降低。值得注意的是，在胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）治療后，糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的SONFH 的作用可得到緩解。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是廣泛存在的高度保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶，主要參與細(xì)胞增殖、凋亡及蛋白質(zhì)生物合成等生物過(guò)程[31]。Liao等[32]通過(guò)建立兔股骨頭壞死模型的研究中發(fā)現(xiàn)，過(guò)度表達(dá)miR-122-5p 的外泌體可通過(guò)RTK/Ras/絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，來(lái)下調(diào)SPRY2 蛋白，從而可減緩股骨頭壞死的發(fā)展。腫瘤壞死因子TNF）作為重要的促炎細(xì)胞因子，被認(rèn)為與巨噬細(xì)胞、破骨細(xì)胞增殖和分化有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在激素性股骨頭壞死中，成骨細(xì)胞中TNF、核因子受體活化因子以及骨保護(hù)素的表達(dá)增加，可導(dǎo)致破骨細(xì)胞的分化減緩[33]。研究表明[34]，在糖皮質(zhì)激素所致的骨壞死過(guò)程中，白細(xì)胞介素-4（IL-4）可以影響糖皮質(zhì)激素對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)控，繼而降低STAT1-Caspase-3 信號(hào)通路的表達(dá)，最終減少TNF所致股骨頭壞死的發(fā)生。

4 展望

通過(guò)以上分析，文章通過(guò)GEO 數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接對(duì)當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療ONFH 的機(jī)制進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療ONFH 的主要成分可能是槲皮素、山柰酚和芒柄花素等，涉及到的通路有PI3K-Akt、MAPK、TNF、IL-17 等，并參與轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控，DNA 模板基因表達(dá)的正調(diào)控、RNA 聚合酶II 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)、凋亡過(guò)程的正調(diào)控、對(duì)藥物的反應(yīng)、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程，各有效成分與其作用靶點(diǎn)之間存在良好的結(jié)合活性與協(xié)調(diào)作用，這為當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療股骨頭壞死的相關(guān)機(jī)制研究提供了思路和方法，也為后續(xù)新藥的臨床及試驗(yàn)研究提供了依據(jù)。同時(shí)也表明中醫(yī)藥治療疾病具有多靶點(diǎn)、多成分、多途徑的特點(diǎn)。另外，通過(guò)GEO 數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)雖然能夠篩選出大量靶點(diǎn)和通路，但這些結(jié)果都有待進(jìn)一步通過(guò)藥理試驗(yàn)加以驗(yàn)證。