人參根際溶磷菌的篩選鑒定及其促生作用

穆朋，梁池嘉，周淑榮，趙艷，王巖，關一鳴,2，劉政波,2，張悅,2，劉寧,2※

[1.中國農業科學院特產研究所，吉林 長春 130112；2.吉林省中藥材種植（養殖）重點實驗室，吉林 長春 130112]

人參（Panax ginseng C.A.Meyer）是五加科人參屬多年生草本植物，其含有各種活性成分，如人參皂苷、多糖和酚類物質等，具有改善血液循環、抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老以及提高人體免疫力等多種藥理作用[1,2]。人參栽培模式通常包括林下護育和農田栽培，其中農田栽培需要4～ 6 年才能收獲。在長期的栽培過程中人參易受到非生物脅迫（如養分、干旱和重金屬脅迫等）和生物脅迫（病蟲害）的影響，其中農田土壤中磷缺乏已成為限制人參生長的重要因子之一。

磷（P）是植物生長和代謝的必要元素之一，直接參與核酸、蛋白質、ATP以及磷脂等生物大分子的合成[3]，涉及調控光合作用、呼吸代謝、能量轉化和信號轉導等過程[4]，在植物整個生命周期中起到十分重要的作用。據估計，耕地中累積的磷可維持全球最大作物產量約100 年[5]。然而，土壤中可被植物吸收利用的P 即正磷酸鹽（HPO42-和H2PO4-）僅占土壤總P 的0.1%～0.5%[6]，難以滿足植物正常生長的需要，而其他大部分P 主要存在于土壤礦物復合物中，如磷酸三鈣、磷酸鐵和磷酸鋁[7]以及構成土壤有機磷的植酸鹽中[8]。在農業系統中通常使用化學磷肥提高土壤肥力和作物產量，陳光等[9]研究發現，對人參適量施磷肥能增強光合作用，增加人參干物質積累。然而，肥料中超過80%的P 通過固定、吸附或沉淀等反應，導致植物無法利用，不僅造成資源浪費，還會造成環境污染[6]。

微生物在土壤養分循環中起著關鍵作用[10]，其中溶磷細菌（Phosphate solubilizing bacteria,PSB）是土壤磷循環的一個重要組成部分，占土壤可培養細菌的40%以上，能將土壤中不溶性的磷酸鹽轉化為植物可吸收利用的形式[11,12]。研究表明，PSB 通過分泌有機酸、磷酸酶和植酸酶等代謝產物活化土壤難溶性無機磷和有機磷，釋放磷酸根離子供其自身和植物根系吸收[13]。Pseudomonas、Azotobacter、Xanthomonas、Rhodococcus，Arthrobacter、Serratia、Phyllobacterium 和Delftia sp.等多種細菌均表現出較強的P 溶解能力及植物生長促進作用[14-16]。基于PSB（Bacillus megaterium）研發的新型微生物肥料，能分泌有機酸將土壤中難溶的磷酸鹽轉化為可溶形式，從而促進植物生長[17]。因此，本研究從林下山參根際土壤分離篩選PSB 菌株，利用16S rRNA 測序對其進行鑒定，通過室內盆栽試驗研究其促生作用和機制，以期為人參專用微生物肥料的研發以及人參栽培產業的綠色可持續發展提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 根際土壤樣品 土壤樣品采集于吉林省敦化紫鑫藥業林下山參基地（128°8'25"E，43°7'45"N，743.68m），該地區屬中溫帶冷涼氣候，土壤屬于暗棕壤，年平均氣溫2.6 ℃，年平均降水量631.8 mm。土壤樣品采集于10 年生林下山參根際，采樣深度0～20 cm，采樣時間為2021 年9 月。去除人參地上部分，使用竹簽挖出人參，輕輕抖動去除人參根系上的大塊土壤，將緊密黏附的土壤（一般5 mm，視為根際土壤）置于無菌塑料袋中，冰上保存帶回實驗室，用于后續菌種的分離培養。

1.1.2 試驗儀器 SevenExcellence S400-Basic pH 測定儀（瑞士）；SpectraMax iD5 酶標儀（美國）；UV-VIS SPECTROPHOTOMETER T9 紫外分光光度計（PUXI，中國）；IMAGING-PAM 葉綠素熒光儀型號+儀器（中國）；Centrifuge 5430 R 離心機（德國）；ZWTR-D2403搖床（上海智城）。

1.1.3 試驗耗材 Takara試劑盒（貨號：R001B，規格：1 000 U）購于北京依珊匯通科技有限公司；土壤酸性磷酸酶活性測定試劑盒（貨號：SACP-1-W，規格：100 管/96 樣）和土壤植酸酶試劑盒（貨號：SSM-1-G，規格：100 管/48 樣）購于蘇州科銘生物技術有限公司。

胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）：葡萄糖2.5 g、胰酪胨17 g、大豆木瓜蛋白酶水解物3 g、NaCl 5 g、K2HPO42.5 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

無機磷液體培養基：葡萄糖10 g、酵母浸粉0.5 g、Ca3(PO4)25 g、(NH4)2SO40.5 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、MgSO47H2O 0.3 g、FeSO47H2O 0.03 g、MnSO44H2O 0.03 g、CaCO31 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

有機磷液體培養基：葡萄糖10 g、酵母浸粉0.5 g、卵磷脂0.2 g、(NH4)2SO40.5 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、MgSO47H2O 0.3 g，FeSO47H2O 0.03 g、MnSO44H2O 0.03 g、CaCO31 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

固體培養基是在液體培養基中加入瓊脂粉15 g/L。

1.2 試驗方法

1.2.1 人參根際PSB 的分離、純化與鑒定 稱取10 g人參根際土壤轉移到90mL無菌蒸餾水中，28 ℃、180 r/min 震蕩30 min，取上清液按十進制進行稀釋（10-1～10-6）。分別取不同稀釋梯度的土壤懸浮液0.1 mL均勻涂布于TSB 固體培養基，每個梯度重復3 次，28 ℃倒置培養7 d，挑選形態具有明顯差異的細菌在TSB 固體培養基進行劃線純化，直至無雜菌。

純化后的菌株轉移至TSB 液體培養基，28 ℃、180 r/min 搖床培養3 d，OD 值調整為0.8。吸取細菌懸浮液0.1 mL 于無機磷/有機磷固體培養基中央，每個菌株重復3 次，28 ℃倒置培養7 d，測量菌落直徑（d）和透明圈直徑（D），計算增溶指數（D/d）。

采用Takara試劑盒提取D/d值較大的溶磷菌DNA，用細菌通用引物799F（5'-AACMGGATTAGATACC CKG-3'）和1193R（5'-ACGTCATCCCCACCTTCC-3'）進行PCR 擴增，擴增產物送上海生工測序部測序，并使用NCBI 數據庫上的BLAST 工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行比對，篩選出相似性高的菌株序列，采用MEGA 5.0 軟件，通過鄰近法（NJ）自舉1 000 次進行置信度檢測，以構建系統發育進化樹。

1.2.2 人參根際PSB 溶磷能力的測定 將篩選的溶磷菌接種到TSB 培養基，28 ℃、180 r/min 搖床培養3 d，OD 值調整為0.8。吸取細菌懸浮液1 mL 接種到裝有100 mL 無機磷/有機磷液體培養基的250 mL 三角瓶中，以未接菌株為對照，重復3 次，28 ℃、180 r/min 搖床培養7d，培養液以10 000 r/min 離心后，取上清液測定pH，用鉬銻抗比色法測定培養液中的可溶性磷含量。

1.2.3 盆栽試驗設計 試驗采用單因素完全隨機區組設計，于2022 年5 月在中國農業科學院特產研究所藥用植物栽培實驗室進行盆栽試驗，土壤使用未栽種人參的土壤、草炭土、蛭石和河沙按4:2:1:1 的比例混合而成，121 ℃高溫滅菌1 h。土壤基本理化性質pH為7.38，堿解氮33.48 mg/kg，速效磷10.07 mg/kg，速效鉀86.48 mg/kg。試驗材料為1 年生人參幼苗，每盆栽種5棵，每盆裝土1.5 kg。設置對照組（CK）：滅菌后的TSB液體培養基；處理組（FT）：篩選出的PSB 菌液。接種時用玻璃棒在距幼苗根莖附近扎3 cm 深左右的孔，用一次性注射器吸取20 mL菌液注入孔中，生長1 周后，再次接種20 mL，每個處理重復3 次，每隔7 d 澆水1 次。90 d 后進行取樣測定各項指標。

1.2.4 指標測定方法 人參光合指標使用葉綠素熒光儀測定；土壤理化性質和植物樣品P 含量的測定參照《土壤農化分析》[18]；土壤酸性磷酸酶和植酸酶活性分別按照土壤酸性磷酸酶活性測定試劑盒和土壤植酸酶試劑盒（蘇州科銘）產品說明書進行測定。P 吸收效率參考陳貴等[19]的計算方法：

P 吸收效率=植物P 吸收量/土壤供P 量

土壤供P 量：土壤在未栽種植物前，能提供給植物的有效P 總量。

1.3 數據處理

采用Excel 2010 對數據進行整理分析，采用IBM SPSS Statistics 23 軟件進行方差分析，使用GraphPad Prism 5 進行可視化繪圖。

2 結果與分析

2.1 PSB的分離、純化與鑒定

如圖1 所示，分離篩選到的菌株在有機磷/無機磷培養基上的溶磷情況，篩選出溶無機磷菌株2 株，分別為FT4 和FT6；溶有機磷菌株2 株，分別為FT6 和FT10，其中菌株FT6 同時具備溶解有機磷和無機磷的能力。如表1 所示，FT4 溶無機磷的D/d 值為1.48，FT10 溶有機磷的D/d 值為2.23，FT6 溶無機磷和有機磷的D/d 值分別為1.45 和2.21。

表1 溶磷細菌溶磷圈的測定Table 1 Determination of phosphorolytic ring of phosphate-solubilizing bacteria

圖1 溶磷細菌溶解無機磷和有機磷的透明圈Fig.1 Transparent circle of inorganic phosphorus and organic phosphorus dissolved by phosphate-sdubilizing bacteria

16S rRNA 基因序列比對結果顯示，FT4 與Nocardioides allogilvus序列同源性最高達98.43%，FT6 與Pseudomonas reactans序列同源性最高達99.74%，FT10與Bacillus tequilensis 序列同源性最高達100%。基于NJ方法構建的系統發育進化樹分析表明，菌株FT4與Nocardioides allogilvus 關系密切，菌株FT10 與Bacillus tequilensis 關系密切，菌株FT6 與Pseudomonas reactans 關系密切，見圖2。

圖2 溶磷細菌的系統發育進化樹Fig.2 Phylogenetic tree showing the relationship among strains of phosphate-solubilizing bacteria

2.2 PSB的溶磷能力

如表2 所示，菌株FT4 在無機磷培養基中的溶磷量為302.69 mg/L，菌株FT6 在無機磷培養基中的溶磷量為390.99 mg/L，二者分別是對照的76 倍和98倍；菌株FT6 在有機磷培養基中的溶磷量為11.53 mg/L，FT10 在有機磷培養基中的溶磷量為7.5 mg/L，二者分別是對照的12 倍和8 倍。FT4、FT6 和FT10 處理的pH 均顯著低于對照（P <0.05），無機磷培養基中pH隨溶磷量增加而降低，有機磷培養基中pH 與溶磷量沒有明顯關系。

表2 溶磷細菌的溶磷量測定Table 2 Determination of phosphorus solubilization by phosphorus-solubilizing bacteria

2.3 PSB對人參生長的影響

如圖3 所示，與CK 相比，FT6 處理后地上部鮮重、干重和葉綠素分別提高了45.8%、35.0%和56.0%（圖3 A、圖3 B、圖3 D，P<0.05），FT4 和FT10 對干重、鮮重和葉綠素無顯著影響（P>0.05）；與CK 相比，FT6 和FT10 顯著提高人參株高，分別為38.1%和24.3%（圖3 C，P<0.05），FT4 對株高無顯著影響（P>0.05）；與CK 相比，FT4、FT6 和FT10 使人參地上部P 含量分別提高了54.5%、106.2%和49.1%（圖3 E，P <0.05），P 吸收效率分別提高了61.1%、178.0%和62.9%（圖3 F，P<0.05）。

圖3 不同處理對人參地上部分生長指標的影響Fig.3 Effects of different treatments on growth indices of aboveground parts of ginseng

PSB 提高人參葉片的光合效率，見圖4。與CK 相比，FT4、FT6 和FT10 分別提高了PSⅡ最大光合效率32.2%、32.3%和25.9%（圖4 B，P<0.05）；與CK 相比，FT4 和FT6 分別提高PSⅡ實際光合效率37.3%和55.2%（圖4 C，P<0.05），而FT10 對PSⅡ實際光合效率沒有顯著影響（P >0.05）。FT6 在PSII 最大光合效率和實際光合效率中均略高于FT4 和FT10 處理。

圖4 不同處理對人參光合指標的影響Fig.4 Effects of different treatments on photosynthetic indices of ginseng

2.4 PSB對人參根際土壤理化性質的影響

如圖5A 所示，與CK 相比，FT4、FT6 和FT10處理使根際土壤pH 分別降低了0.29、0.45 和0.26（圖5A，P<0.05）；與CK 相比，FT4 處理土壤速效磷含量降低了11.9%，FT6 提高了11.2%（圖5B，P<0.05），FT10 處理對土壤速效磷含量沒有顯著影響（P>0.05）；與CK 相比，FT4 和FT6 使根際土壤酸性磷酸酶活性分別提高了54.5%和42.5%（P <0.05），FT10 處理對土壤酸性磷酸酶活性沒有顯著影響（圖5C，P>0.05）；與CK 相比，FT4 和FT10 雖提高了根際土壤植酸酶活性，但差異不顯著（P >0.05），FT6 使根際土壤植酸酶活性顯著提高595.5%（圖5D，P<0.05）。

圖5 不同處理對人參根際土壤理化性質的影響Fig.5 Effects of different treatments on physicochemical properties of ginseng rhizosphere soil

3 討論與結論

為解決土壤磷利用率低的問題，傳統農業大多采用施用化學磷肥的方法，然而，植物對磷肥當季利用率僅為10%～25%，大部分P 被鐵、鋁氧化物和氫氧化物吸附固定或通過淋溶方式進入環境，導致環境污染，資源浪費，因此，通過溶磷微生物增加土壤中難溶性磷的利用，不僅可以提高肥力，而且對提高植物產量和品質具有重要意義[20]。研究表明，接種PSB 可促進植物生長[21,22]。PSB 已從小麥[23]、玉米[24]、水稻[25]和人參[26]等植物根際土壤分離得到。本研究從林下山參根際土壤分離出了3 株PSB，其中FT6 能同時溶解無機磷和有機磷，且溶磷能力和促生作用最為明顯，經16S rRNA 分析鑒定為Pseudomonas reactans。

以難溶性無機磷或有機磷作為唯一磷源的功能性培養基是篩選PSB 的常用方法之一[27]。本研究發現，分離的溶磷細菌FT4 和FT10 在平板篩選中具有較大的D/d 值，但在定量檢測中具有較低的溶磷能力，這與Li 等[28]的研究結果相似。可能是與PSB 在平板上產生溶磷圈的大小與其分泌的代謝酶、有機酸類型、釋放速率以及菌株本身的遺傳特性有關[29]。定量測定結果表明，菌株FT6 溶無機磷和有機磷的能力最強，顯著高于FT4 和FT10，表明菌株FT6 有作為生物菌肥的優勢，具備提高土壤磷利用率的潛力。

研究表明，PSB 接種對連翹[30]、滇重樓[31]和雷公藤[32]等多種藥用植物的生長具有促進作用。光合作用是植物積累干物質的主要途徑，而P 是植物光合作用過程的重要參與者，如ATP、核酮糖二磷酸（RuBP）和RuBP 羧化酶等關鍵物質的合成[33]。劉偉等[34]研究發現，施加P 能提高黃瓜幼苗的光合作用，促進其干物質積累。趙巖等[35]研究發現，在番茄根際接種PSB，番茄凈光合速率比對照提高27 倍。本研究表明，FT6 顯著提高了人參最大光合效率和實際光合效率，說明PSB 可增加P 吸收效率從而提高了人參的光合效率。

分泌有機酸是PSB 溶解土壤無機磷的主要機制之一[36]。Ahmad 等[37]研究發現，溶磷菌Pseudomonas sp.strain AZ15 可生產草酸、葡萄糖酸、乙酸、乳酸和檸檬酸，溶磷量高達109.4 mg/L。PSB 通過有機碳化合物的呼吸或直接氧化作用可產生有機酸，有機酸分泌導致根際土壤酸化，通過質子取代Fe3+和Al3+等陽離子或通過酸性陰離子交換磷酸鹽（PO43-）將難溶性無機磷中P 釋放[36,38]。葡萄糖酸是PSB 分泌的主要有機酸之一[39]，其中吡咯喹啉（PQQ）合成酶能調控葡萄糖酸的分泌。Li 等[40]研究報道，在Rahnella aquatilis HX2 中，編碼PQQ 合成酶的pqqA 基因缺失能顯著降低培養基中葡萄糖酸的含量，并導致其溶磷量從465.9 mg/L 降低至99.7 mg/L。本研究表明，PSB 溶解無機磷的能力與培養基pH 成反比，接種PSB 的土壤pH 均比對照處理低，推測PSB 分泌的檸檬酸、葡萄糖酸、草酸和酒石酸等有機酸降低了土壤pH，進而溶解無機磷酸鹽[36]，其具體機制仍需進一步深入研究。PSB通過分泌胞外酶，如酸性磷酸酶和植酸酶溶解土壤有機磷[36]。Ben 等[41]對Pseudomonas corrugate SP77和SerratialiquefaciensLR88 產植酸酶的能力進行研究，發現兩者植酸酶活性分別高達23.02U/mL和24.84U/mL，磷溶解效率分別高至714.96 mg/L 和306.74 mg/L。本研究表明，接種FT6 顯著提高了土壤中酸性磷酸酶和植酸酶活性，表明Pseudomonas reactans 可能通過分泌酸性磷酸酶和植酸酶從而溶解根際土壤中的有機磷。酸性磷酸酶和植酸酶能水解土壤中大多形式的有機磷，如酸性磷酸酶能催化土壤磷酸單酯中P的水解，植酸酶能水解土壤中的肌醇磷酸鹽[42]。Tandra等[43]觀察到土壤中的磷酸酶基因豐度（phoC 和phoD）、根際磷酸酶活性和植物磷吸收之間存在正相關關系，表明PSB對土壤有機磷周轉的重要性。Shulse等[44]使用人工生物學方法設計具有不同植酸酶基因的根際細菌Pseudomonas simiaeWCS417r、Ralstoniasp.UNC404CL21Col和Pseudomonas putida KT2440，與沒有植酸酶基因的菌株相比，工程菌株在液體培養基中溶解植酸鹽的能力從58mol/L 提高至500mol/L。

綜上所述，本研究從林下山參根際土壤篩選出3株溶磷菌，經分子生物學鑒定分別為Nocardioides allogilvus、Pseudomonas reactans 和Bacillus tequilensis，其中Pseudomonas reactans 效果最好。盆栽試驗表明，Pseudomonas reactans 能顯著提高人參根際土壤酸性磷酸酶和植酸酶活性，增加土壤P 的利用效率，增強人參對P 的吸收，提高人參光合作用，從而促進其生長。雖然與Pseudomonas reactans 相比，Nocardioides allogilvus 和Bacillus tequilensis 的促生作用較弱，但后續試驗發現，這兩個菌株具有產生長素和鐵載體的能力，而利用合成微生物群落構建技術將不同功能菌株組成群落[45]，從而提高菌群的穩定性、定殖能力以及促生作用，是下一步研究的重點與難點。總之，本研究可為人參土壤磷元素轉化與循環提供理論依據，為人參等藥用植物生物菌肥的研發提供科學技術支撐，促進人參栽培產業的綠色健康可持續發展。