蠶絲基小口徑人工血管研究進展

曾 姚, 呂金鳳, 王介平, 劉 彬, 周 嬋

(1.重慶市畜牧科學院 蠶業研究所,重慶 402460; 2.西南大學 生命科學學院,重慶 400715)

心血管疾病(Cardiovascular Disease,CVD)是一類由心臟和血管異常引起的疾病,包括心肌梗塞、心力衰竭、心律異常、主動脈瘤、外周動脈疾病、血管栓塞性疾病和靜脈血栓等[1],它具有高患病率、高致殘率和高死亡率的特點,約占全世界死亡人數的1/3[2]。引發該類疾病的因素包括過度飲酒、吸煙、肥胖、高膽固醇及高血糖等[3-5],這表明衰老并不是心血管疾病的唯一誘因[6]。并且統計結果顯示,預計2030年全球心血管病死亡人數將上升至2 340萬人[7]。因此,尋找合適的預防和治療手段來應對心血管疾病迫在眉睫。

心血管疾病治療方式廣泛,當血管堵塞程度較輕時,藥物治療和保持良好生活方式是最佳的治療方案。他汀類藥物的降脂療效常被用于心血管疾病的防治[8]。支架植入是將球囊導管擴張或金屬支架置入冠狀動脈病變處,以膨脹的方式支撐血管壁,從而使狹窄、閉塞的血管擴張保持血流通暢,它是處理急性血管閉塞最有效的手段[9]。旁路移植是取自體動靜脈或人工血管移植物,繞過動脈閉塞部位,連接阻塞部位的上下端,從而直接建立一條新的血流通路的方法,目前包括大隱靜脈、乳內動脈和橈動脈等在內的動靜脈移植物仍然是血管重建的“金標準”[10]。但是,自體移植會對患者造成二次傷害,并且血管的來源有限,因此人工血管移植治療是目前心血管疾病最有希望的療法。

研究表明,滌綸[11]、聚四氟乙烯[12]和聚氨酯[13]等材料被廣泛應用于大口徑血管(內徑≥6 mm)移植手術,但是它們在小口徑人工血管(內徑<6 mm)的應用上存在較大的局限。如小口徑的滌綸管狀織物會與血液形成纖維—血栓復合體從而引發血管阻塞,最終導致機體死亡[14],使用組織纖溶酶原選擇性經導管溶栓啟動激活劑([tPA]阿替普酶)對血栓溶解后進行移植[15],可大幅度提高血管通暢率。聚四氟乙烯制備的狗靜脈移植物在植入動物體內后,狗的存活率只有36%,死亡原因主要是血管栓塞[16]。聚氨酯移植物用于Sprague-Dawley(SD)大鼠的腎下主動脈移植手術,在植入后存在易形成血栓、長期順應性不強等問題[17]。滌綸、聚四氟乙烯和聚氨酯等材料用于小口徑血管移植,如何保持其長期通暢性一直是外科手術的難題。同時,這些材料制備的血管難以在體內促進血管內皮化,從而導致移植效果不佳。近年來的研究結果顯示,桑蠶絲具有良好的生物相容性、機械性能、可降解性和促進細胞黏附等特性而被廣泛應用于生物醫學工程領域[18-19],并且它在小口徑血管移植手術方面也顯示出獨特的修復作用[20]。基于此,本文綜述了蠶絲基人工小口徑血管的應用現狀及其性能優勢,同時也討論了存在的問題和未來發展,以期為改進小口徑血管研究及轉化提供參考。

1 蠶絲性能及生物醫學應用

蠶絲是一種天然蛋白質纖維,由家蠶五齡幼蟲分泌,包含絲膠蛋白和絲素蛋白。絲蛋白具有重復性一級結構,包括無規卷曲、α-螺旋、β-轉角和β-折疊等在內的二級結構和晶體網格結構,這些多級結構是影響力學性能的關鍵[21]。蠶絲具有吸濕性被用于傷口縫合[22],同時它還具有良好的生物相容性、可調控的降解性和優秀的機械性能而被廣泛用于骨、軟骨、韌帶、肌腱和骨骼肌等運動系統中[23]。研究結果表明,家蠶絲纖維具有良好的機械性能(拉伸強度4.3～5.2 g/den,拉伸模量84～121 g/den,斷裂應變10%～23.4%)[24]常被用作組織工程材料。因此,蠶絲是一種極具潛力的生物醫用材料。

2 蠶絲基小口徑人工血管的應用與優勢

蠶絲是一種來源豐富、性質優良的天然蛋白質纖維,它被廣泛用于制備生物醫用材料,人工血管是其中之一。以蠶絲為原料制備人工血管,具有制備方式多樣、生物相容性良好、抗血栓形成和促進血管內皮化等優勢。

2.1 制備方式多樣

人工血管的制備需具備快捷、方便、批量生產、合理的制造成本,以及制備出的血管要接近天然血管性能等特點[25]。具備一定降解率的蠶絲基組織工程材料能夠為細胞生長和組織形成提供良好的環境[26]。研究表明,蠶絲具有可控的降解性,通過控制溶解、水解條件等方法來改變制備的組織工程移植體的降解速率,其降解產物可以促進內皮細胞增殖[27]。因此,可使用蠶絲通過凝膠紡絲、編織和浸漬、雙拉舍爾針織、靜電紡絲、冷凍干燥和塑模及3D打印等方式制備小口徑人工血管,如表1所示。利用蠶絲或蠶繭制備血管移植體時,首先需要將其進行脫膠和溶解,該過程通常使用0.02～0.05 M的碳酸鈉和9.3 M的溴化鋰來實現。

表1 蠶絲基血管移植體的制備方法Tab.1 Preparation method of vascular graft based on silk

凝膠紡絲程序是利用0.02 M碳酸鈉溶液對蠶繭進行脫絲膠處理得到絲素纖維,將絲素溶于9.3 M溴化鋰,再經過透析、濃縮得到25%～35%的絲素水溶液,所得溶液通過27或30號針排出并纏繞在旋轉的芯軸上得到管狀物,該管狀物需進行冷凍干燥和甲醇處理后用于移植[28]。編織和浸漬獲得的血管移植物通常也需要碳酸鈉或馬賽皂進行脫絲膠處理,隨后在編織機上借助聚氯乙烯棒編織絲素纖維以形成管狀物,同時將絲素管浸入絲素蛋白水溶液,最后浸入50%乙醇使涂覆的絲素蛋白不溶[29]。以生絲為原料,使用雙拉舍爾針織機制備蠶絲管后經過脫絲膠處理,然后用含有聚乙二醇二縮水甘油醚的絲素蛋白水溶液涂覆絲管,冷凍干燥得到血管移植體[30]。生絲脫絲膠得到絲素纖維,將其溶解、透析和澆鑄獲得絲素膜,再將絲素膜溶于甲酸混勻獲得紡絲液,將其注入注射泵輸送至噴絲頭,噴絲頭在電壓差的作用下產生纖維被圓柱形旋轉收集器收集,形成管狀移植物,再將管狀物浸入乙醇,最后真空干燥[31]。為了避免有機溶劑在制備生物醫用材料過程中的大量使用,Zhou等[32]的研究結果表明,水可以作為一種優良溶劑用于靜電紡絲制備人工血管,并且使用水作溶劑可以獲得連續纖維,同時可以將水溶性生物活性分子混合賦予移植物基本功能。Chan等[33]對比了水紡制和六氟異丙醇紡制的移植體,結果顯示水紡制的移植物從3周到6周的新生內膜面積急劇增加,然后達到穩定水平。相比之下,六氟異丙醇紡制的移植體從3周逐漸增加到24周,比水紡制具有更長的穩定周期,并且在移植時細胞的滲透速度顯著高于水紡制,這得益于六氟異丙醇紡制比水紡制具有更高的孔隙率(45.1%±1.2% vs 23.3%±1.7%)。雖然靜電紡絲技術被廣泛用于制備人工血管,但是在靜電紡絲和紡織層之間實現強黏合可能是一個挑戰,因為沉積靜電紡絲纖維的紡織品表面不是均勻平坦的,而是存在微觀的粗糙或凹陷的部位,這阻止了兩個表面之間的連續接觸[34]。用Na2CO3溶液進行脫絲膠獲得絲素纖維,再將絲素纖維溶于溴化鋰,透析獲得絲素蛋白水溶液。將水溶性有機溶劑加入絲素蛋白水溶液,混合后注入模具,在低溫(-20 ℃,-70 ℃,-196 ℃)下進行冷凍和干燥處理,浸入甲醇誘導絲素蛋白結晶,最終形成管狀移植體[35]。與其他工藝獲得的絲素管相比,凍干管增加了孔隙率,有助于細胞向管內遷移[28],但有研究發現,經過冷凍干燥制備的血管支架在力學性能上難以達到預期目標[32]。Kim等[26]利用甲基丙烯酸縮水甘油酯化學改性絲素蛋白能夠制備出有效的數字光處理3D生物打印墨水,該墨水能夠根據設計的CAD圖像打印出血管,但是通過打印的方法制備組織工程材料需要克服生物相容性和結構穩定性等問題,并且絲素蛋白沒有合適的光固化位點。Cheng等[36]將豬頸動脈脫細胞后所得細胞外基質作為支架制備的組織工程血管移植體顯示出巨大的潛力,這提示蠶絲基或可用于脫細胞組織工程制備血管移植體。人工血管表面孔隙率是誘導血小板聚集的重要因素,冷凍干燥絲素管表面粗糙并具有高孔隙率能夠有助于細胞生長遷移,在凍干管中制備過程中加入肝素能夠抑制平滑肌細胞的增殖,同時能促進新血管形成,這與高孔隙率和溫和的制造工藝(如使用乙醇作為制備溶劑)密不可分[35]。綜上,不同制備工藝對于人造血管的孔徑、力學性能、細胞遷移速率、細胞附著率等影響較大,如調節靜電紡絲參數(溶劑、紡絲液濃度和流速等)以增加絲血管移植物的纖維和孔徑可增強宿主的體內重塑[33]。增加靜電紡絲制備絲素管過程中甲醇的處理時間,材料結晶度增加,這對絲素血管移植體的生物降解速率產生了顯著的影響[37]。調節凝膠紡絲過程中絲素蛋白溶液的濃度可以提高絲素管的孔隙率,這有利于細胞的進入和移植體的降解[38]。以蠶絲基為原料利用不同的制備方法生產的血管移植體具有多種尺寸和孔徑可以更好地滿足外科手術,這得益于蠶絲獨特的生物可控降解性,但是在方法的選擇上要綜合考慮是否能夠保持良好的力學性能及良好的生物相容性(如靜電紡絲)。選擇六氟異丙醇和乙醇作為溶劑能夠有效地控制絲纖維的厚度和孔隙率,這對移植后血管重塑具有深遠的影響。

2.2 生物相容性良好

具備良好的細胞相容性通常是血管移植體在進行植入手術前的基本要求。以蠶絲基為基礎的小口徑血管移植體在與人冠狀動脈平滑肌細胞、人主動脈內皮細胞、人臍靜脈內皮細胞、平滑肌細胞、小鼠成纖維細胞、NIH 3T3細胞和人臍動脈平滑肌細胞等[39-43]進行共培養時顯示出極佳的細胞相容性。靜電紡絲制備的絲素血管移植體有利于細胞黏附、存活和生長,在將成年人冠狀動脈內皮細胞、人主動脈平滑肌細胞和人主動脈不定纖維細胞接種至移植體后3 h檢測到每種細胞類型的黏附率為61%±5%,三種細胞類型顯示出活躍的新陳代謝(葡萄糖和谷氨酰胺的消耗,乳酸的釋放)和長達20 d的增殖時間[34]。Shayan等[44]利用靜電紡絲技術將薄層鎳鈦諾和絲素蛋白組合以制備復合移植物,當移植物與平滑肌細胞和內皮細胞共培養48 h后細胞以梭形形態擴散,并穩定地附著在移植體上,并且附著的內皮細胞數量及其在移植體上擴散形態均優于滌綸和膨體聚四氟乙烯。Marcolin等[18]的研究結果表明,涂覆明膠的絲素蛋白管狀移植體與L929小鼠成纖維細胞系共培養24 h后細胞就已經擴散變平,經過7 d的培養細胞密度變大,與臍靜脈內皮細胞共培養3 d和7 d后細胞黏附及生存狀態良好[45]。Liu等[40]通過與氯磺酸反應制備了硫酸化絲素蛋白,并用硫酸化絲素蛋白海綿修飾了針織絲素蛋白支架,提高了血管移植體的血液相容性。

研究表明,絲素蛋白管上接種NIH 3T3細胞24 h后,細胞黏附到管上,細胞活力隨著培養時間的增加呈線性增加,并且時間越長細胞更加扁平和擴展[37]。Ma等[43]將NIH 3T3細胞與絲素蛋白納米纖維、低聚原花青素納米纖維和聚氨酯納米纖維共培養7 d后檢測細胞生長狀況,除了聚氨酯納米纖維表現出很低的細胞生長數,另外兩者共培養后的細胞數呈對數級增長,均顯示出良好的細胞相容性。即使是在動態培養的條件下,將血管細胞(人冠狀動脈平滑肌細胞和人主動脈內皮細胞)接種到模擬血管結構的管狀電紡絲素蛋白支架上,細胞也能在支架上增殖和排列,細胞有效分配營養和氧氣方面動態流動也優于靜態培養[39]。同時,人冠狀動脈平滑肌細胞與靜電紡絲絲素蛋白支架共培養36 d后,細胞生長狀態仍良好[42]。有研究顯示,在移植體中摻入膠原蛋白可以進一步促進細胞生長和增殖,提高生物相容性,但是過量的膠原蛋白則會導致移植體機械性能降低[32]。這些結果表明,以蠶絲基為基礎制備的血管移植體具有良好的細胞相容性,細胞與支架共培養后生長狀況良好,并且能夠在材料上定植生長,共培養結果顯示出蠶絲基血管支架具有使細胞短期高效定植的特點,這些特性有利于移植后血管內皮化的進程,但是也要預防在這個過程中細胞發生過度增殖的現象。

2.3 抗血栓形成

在血管移植手術后,移植物中形成血栓易引起血管堵塞,這對于手術的成功是極大的阻礙因素,也極易造成死亡[14]。從制備材料上著手降低血栓形成的風險對于血管置換手術至關重要。

Lovett等[28]將蠶絲和聚四氟乙烯這兩種血管移植材料制備的管狀物與天然大鼠腹主動脈力學性能相比,聚四氟乙烯(彈性模量(918±52.9) MPa,極限抗拉強度(43.4±4.6) MPa)相較于蠶絲(彈性模量(2.20±0.90) MPa,極限抗拉強度(0.273±0.11) MPa)顯示出更好的強度,將其用于治療血流量較高且阻力低的大直徑血管移植是有益的,但是蠶絲更能與小直徑的大鼠主動脈(彈性模量(2.44±0.76) MPa,極限抗拉強度(0.519±0.11) MPa)的機械性能匹配,從而降低血栓形成的可能性。結合編織和靜電紡絲技術,以絲素為原料制備出包括內部和外部靜電紡絲層和中間紡織層的仿生血管移植體具有良好的血液相容性,在體內試驗期間未觀察到血栓形成[34]。Yagi等[30]通過彩色多普勒成像和脈沖波監測SD大鼠體內絲素蛋白制備的血管移植物通暢性,結果顯示,植入大鼠腹主動脈21周后的移植物幾乎沒有血栓形成。同樣地,Enomoto等[46]也通過彩色多普勒成像和脈沖波監測到10個聚四氟乙烯移植物有4個在第4周時堵塞,相比之下27個絲素蛋白移植物只有3個發生了堵塞,絲素移植物的通暢率(85%)顯著高于聚四氟乙烯(48%),并且堵塞的聚四氟乙烯移植物中有血栓形成。通過端到端吻合的方式將絲血管移植物植入SD大鼠的腹主動脈,大鼠沒有表現出急性血栓、凝血和下肢缺血的現象,并且蠶絲膜上黏附的蛋白量低于聚四氟乙烯膜[38]。蠶絲基血管移植物在植入犬頸動脈3個月后的評估中,移植物的腔內層中觀察到充分的膠原化和內皮化,這表明該移植物具有高效的抗血栓形成作用[47]。膨體聚四氟乙烯血管移植體在第4周的通暢率(80%)低于絲素蛋白血管移植體通暢率(100%),通暢性的喪失是由于血栓形成,因為紅細胞和纖維蛋白積聚在管腔內[48]。為了實現小口徑血管移植的長期通暢和結構完整性,理想的血管移植體應該具有抗血栓表面,多項研究結果均表明蠶絲基的抗血栓能力較強,這與其良好的生物相容性和機械性能密不可分。但是蠶絲基人工小口徑血管也顯示出平滑肌細胞的過度增生問題[28],這是導致血栓的潛在因素之一,未來或可通過將絲蛋白與抗凝劑如肝素、水蛭素,以及抗血栓形成靶因子如紫杉醇、華法林、阿司匹林和氯吡格雷等混合,以提高抗血栓形成性。

2.4 促進血管內皮化

天然血管有三個解剖層:內膜、中膜和外膜。內膜由單層內皮細胞組成,中膜主要包含平滑肌細胞和彈性蛋白纖維,外膜由膠原蛋白、彈性蛋白、成纖維細胞及最主要的結締組織成分組成(圖1)[49]。其中,內皮細胞參與血栓溶解和凝血過程,并且在正常穩態條件下內皮細胞可防止血栓形成[50]。健康的內皮發育對于血管移植手術的成功是有利的[51],內皮細胞的正常生長對于血管重塑十分必要。

圖1 血管結構Fig.1 Vascular structure

利用絲素網與內皮細胞共培養,細胞可沿著絲素網黏附和擴散,并且這些細胞在絲素網上形成微血管樣結構[29]。通過靜電紡絲的方法利用絲素蛋白溶液制備的血管移植體,植入動物體內7 d后,支架內表面的彈性蛋白表達量約為天然血管中定量的50%[52],1個月時,宿主細胞沿著移植物內腔快速遷移,并形成融合內皮[38],3個月時,移植體管腔中有內皮細胞穩定定植[31]。通過冷凍干燥制備的絲素蛋白多孔血管支架,植入SD大鼠皮下2周后可以明顯地觀察到新生毛細血管[35]。將水凝膠紡絲技術生產血管移植物,植入SD大鼠腹主動脈4周后,管腔表面產生了血管細胞重塑的融合內皮[28],在聚四氟乙烯移植物上并未觀察到血管細胞較為活躍的增殖現象。通過雙拉舍爾針織機制備絲素纖維管狀物,再將移植物表面進行硫酸化處理,結果顯示移植體上內皮細胞能夠穩定存在14 d以上,這有利于血管移植物的內皮化及加速形成融合功能性內皮單層[40]。針織獲得的絲素管狀移植物植入動物體內3周時,移植體內表面出現明顯的內皮細胞定植[47],植入4周后,移植物的內部被血管內皮細胞覆蓋,CD31陽性內皮細胞數量顯著多于膨體聚四氟乙烯組[48],3個月在移植物表面聚集了平滑肌細胞和血管內皮細胞[53]。通過編織的方法制備的絲素血管移植體在植入動物體內1個月,在移植體外部形成了一層薄再生組織[54],植入3個月后,所有移植物都有血管內皮細胞生長[55],在3個月和12個月時,移植體中CD31的基因表達水平分別為自體血管的45.8%和75.3%[56],1年后,絲素蛋白移植物的組織學分析顯示移植物內形成內皮層和介質樣平滑肌層,這顯示正常血管中血管細胞產生了遷移[46],內皮細胞和平滑肌細胞遷移到絲素移植體中,并組成內皮和中膜樣平滑肌層[29]。蠶絲基血管移植體植入體內后,血管內皮細胞能夠順利地遷移并定植到移植體內腔,同時,管腔表面能夠產生融合內皮這對于進行血管置換手術后的血管重塑具有重要意義,也表明利用絲素蛋白制備的血管移植體有望成為天然血管的有效替代品。但是,通過研究可以發現,蠶絲基血管移植物產生的內皮化過程主要集中在血管移植體和天然血管的縫合部位[57],少有研究可以直接證實內皮化過程可以在血管移植物中心進行。因此,如何加快整個蠶絲基小口徑血管移植體的內皮化和提高內皮化的完整性,尚需要進行深入研究。

3 結 語

在外科血管移植手術領域,對于人工血管的需求越來越大,特別是小口徑的血管移植體,因為它通常與血栓形成的高發生率相關,最終導致移植失敗。蠶絲具有可控的生物降解性使它可以通過多種方式制備血管移植體,良好的細胞相容性能讓它在體內逃過免疫系統的視線,它的抗血栓形成能力可以最大限度地避免移植體植入體內后的栓塞,并且近似天然血管的機械性能和順應性保證移植體與宿主的適應,從而保證短期和長期內移植處血液的通暢性。這些研究結果表明,蠶絲基人工小口徑血管具有獨特的優勢,也顯示出了極大的臨床應用前景,蠶絲基小口徑人工血管在不久的將來或許能夠用于臨床治療。此外,可以從基因工程改善蠶絲性能、脫細胞基質、新型梯度多層片和絲織物表面改性等方面入手制備組織工程血管移植體。雖然,眾多研究都驗證了蠶絲基血管移植體的有效性,但它在動物體內的應用中也存在一定缺陷:1) 在制備移植體時脫膠和溶解絲素蛋白的試劑殘留對于體內的長期植入是否存在副作用,以及是否影響了血管移植物的有效性缺乏驗證;2) 對于植入動物體內的遠期通暢率來說,缺乏足夠長的時間和移植物數量來驗證;3) 關于移植體的臨床應用,缺乏與人類親緣關系相近的物種作為試驗動物模型;4) 蠶絲具有可降解性,降解過程大多需要借助炎癥反應,如何平衡降解和機體炎癥之間的關系需要更深入的研究;5) 蠶絲基血管移植體降解過程要能保持合適的力學性能和抵抗長期變形的能力以便滿足組織重塑的要求,這是保證較高遠期通暢率的因素之一,但目前缺乏相關的參考數據;6) 蠶絲基小口徑血管能夠有效地促進內皮增生,但是如何控制這種增生的速度和預防過度增生也是一個問題;7) 目前常用的制備方法中絲素血管移植體表面普遍存粗糙和不平整等問題,這可能會導致移植體表面吸附蛋白質和聚集血小板,從而影響血流。因此,今后可以著重從改進制備方式優化研制工藝入手來提高絲素血管移植體質量,同時對于蠶絲的可控降解性也需要更深入地研究,這有利于詮釋降解與機體炎癥和組織重塑之間的內在聯系,也能為蠶絲在生物醫學材料領域的應用提供有力的參考數據。

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