韭菜灰霉病菌對嘧霉胺和咯菌腈抗性評價及抗性菌株適合度分析

張艷麗，陳 娟，張藝瀟，陳燕玲

（1.平?jīng)鍪修r(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢驗檢測中心 甘肅平?jīng)?744000； 2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州 730000）

韭菜是我國栽培區(qū)域最廣泛的蔬菜之一。近年來，在韭菜種植過程中灰霉病時常發(fā)生，成為影響韭菜安全生產(chǎn)的重要因素之一。韭菜灰霉病是由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的一種病害[1]，直接影響韭菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。防治韭菜灰霉病的登記農(nóng)藥有腐霉利、嘧霉胺和咯菌腈3 種。腐霉利作為二甲酰亞胺類殺菌劑在我國有20～30 年的使用歷史，已表現(xiàn)出灰霉病菌對腐霉利的敏感性下降[2]，且腐霉利在蔬菜中檢出的農(nóng)藥殘留頻率最高[3-4]。研究表明，其他蔬菜上灰霉病菌對嘧霉胺的抗性頻率已達(dá)到43.64%[5]，不同地區(qū)灰霉病菌對嘧霉胺的抗性水平有差異，但其抗性菌株的適合度鮮有報道?？┚鎸颐共【z生長有較高的抑制作用，在國內(nèi)已有灰霉病病菌對咯菌腈產(chǎn)生抗性的報道[6]。陳淑寧等[7]研究表明，在咯菌腈藥劑條件下，灰霉病菌敏感菌株可以在競爭中淘汰掉多重抗性菌株。目前在甘肅省內(nèi)還沒有關(guān)于韭菜灰霉病菌對嘧霉胺和咯菌腈抗藥性的報道，且GB 2763-2021[8]中還未規(guī)定嘧霉胺在韭菜中的最大殘留限量值。為此，筆者通過對甘肅省7 個地州市（張掖、武威、隴南、慶陽、平?jīng)觥⑻m州、白銀）的韭菜灰霉病菌進(jìn)行分離及敏感性檢測，并對其進(jìn)行抗性評價，以期研究抗性菌株的適合度，用于指導(dǎo)甘肅省境內(nèi)田間韭菜種植的科學(xué)用藥和殺菌劑抗性管理。

1 材料與方法

1.1 供試材料

99.9%嘧霉胺、咯菌腈原液1000 μg·mL-1，由北京萊鉑銳科技有限公司提供。嘧霉胺、咯菌腈原液用丙酮配制成100 μg·mL-1母液，冰箱冷藏保存。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）[9]用于韭菜灰霉病菌對咯菌腈的敏感性測定；L-asp 培養(yǎng)基[10]用于韭菜灰霉病菌對嘧霉胺的敏感性測定。

試驗于2020 年3-11 月在甘肅省隴中（蘭州、白銀），隴東（慶陽、平?jīng)鍪校?，隴南和河西（張掖、武威市）等7 個市的設(shè)施大棚內(nèi)開展。采集韭菜灰霉病病葉，采用何烈干等[11]的方法純化分離菌株，得到54 株菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）[12]，所有菌株在4 ℃下保存。菌株命名以“采樣市州+序列號”表示。

1.2 敏感基線建立及抗性水平測定

采用抗藥性鑒定MIC 法（最低抑制濃度法），在分離出的54 株灰霉病菌菌落邊緣打取直徑5 mm的菌絲塊，分別接種至含系列濃度的嘧霉胺和咯菌腈的L-asp、PDA 培養(yǎng)基上，每處理3 次重復(fù)。在25 ℃培養(yǎng)12 d 后，不能或幾乎不能在該培養(yǎng)基上生長的藥劑濃度為嘧霉胺和咯菌腈對韭菜灰霉病菌的最低抑制濃度，以此劃分敏感菌株和抗性菌株。

采用菌絲生長速率法[11]分別測定韭菜灰霉病菌對嘧霉胺、咯菌腈的敏感性，對嘧霉胺敏感菌株濃度（ρ）設(shè)定分別為0.05、0.1、0.5、1.0、2.0 μg·mL-1，抗性菌株濃度設(shè)定分別為1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 μg·mL-1；咯菌腈濃度設(shè)定分別為0.01、0.05、0.1、0.2、0.3 μg·mL-1。以不加藥劑作為對照，將打取的菌餅（5 mm）接種于平板培養(yǎng)基上，每處理3 次重復(fù)，在25 ℃恒溫培養(yǎng)6 d。采用十字交叉法測定菌落直徑，利用Graphpad prism 5.0 軟件處理后得出EC50值。

分別選取嘧霉胺壓力下32 株和咯菌腈壓力下54 株菌株EC50值進(jìn)行正態(tài)分布驗證，以符合該正態(tài)分布所有菌株的平均EC50值為敏感基線，作為比較抗性有無和抗性水平高低的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)抗性菌株與敏感基線EC50的比值確定抗性倍數(shù)[13]，1≤抗性倍數(shù)≤5 時，為低抗菌株（LR）；5＜抗性倍數(shù)≤10 時，為中抗菌株；抗性倍數(shù)＞10 時，為高抗菌株。

1.3 抗性菌株穩(wěn)定性測定

在嘧霉胺壓力下，挑選菌株P(guān)L-2（低抗）、BY-6（中抗）和LZ-3（高抗）；在咯菌腈壓力下選取菌株QY-6（低抗菌株）分別在L-asp 和PDA 無藥培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)代培養(yǎng)8 次后，分別測定第2、4、6、8 代菌株對藥劑的敏感性，比較繼代前后菌株間抗藥性水平（EC50）差異。

1.4 抗性菌株適合度測定

1.4.1 抗/敏菌株菌絲生長速率及產(chǎn)孢量的測定選取菌株ZY-3、PL-2、BY-6、LZ-3 和PL-4、QY-6，在其菌落邊緣打取直徑5 mm 菌餅，分別接種于L-asp、PDA 平板上，在25 ℃下培養(yǎng)，分別測量生長12、24、48、72 和96 h 后的菌落直徑，計算菌株生長速率。將上述菌株繼續(xù)培養(yǎng)10 d 后，用10 mL 無菌水沖洗孢子，尼龍紗布過濾，定容后采用血球計數(shù)板計數(shù)。每個菌株3 次重復(fù)。

1.4.2 抗/敏菌株致病性測定 采用任璐等[14]的方法。將采集到的同葉位韭菜葉清洗消毒后，制成3 cm 的葉盤。分別配置嘧霉胺、咯菌腈最低抑制濃度溶液，將葉盤浸入藥液2 min 后，晾干，以浸入無菌水為對照；將1.4.1 中制備的孢子液稀釋至1×104個·mL-1，均勻噴灑于葉盤，放入無菌培養(yǎng)皿中，每皿4 片，每處理3 次重復(fù)，用透明坐標(biāo)紙統(tǒng)計葉盤發(fā)病面積，按公式（1）計算發(fā)病率。

1.4.3 抗/敏菌株分生孢子競爭力測定 參照史曉晶等[15]的方法，對嘧霉胺和咯菌腈的敏感菌株與抗性菌株孢子液按體積比1∶1 配置成不同的組合：Cp1 為ZY-3+PL-2，Cp2 為ZY-3+BY-6，Cp3 為ZY-3+LZ-3，Cf4 為PL-4+QY-6。將孢子混合液用毛筆涂抹于無菌韭菜葉片上，在25 ℃培養(yǎng)，發(fā)病后打取1 cm 病斑葉片懸浮于嘧霉胺、咯菌腈最低抑制濃度溶液中繼續(xù)培養(yǎng)，記錄病斑數(shù)量并觀察病斑是否擴(kuò)大，每個處理檢測病斑數(shù)50 個。按公式（2）計算抗性突變體頻率。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理與表格繪制；采用Graphpad prism 5.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，數(shù)值采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 敏感基線建立及抗性水平測定

所測嘧霉胺、咯菌腈最低抑制濃度（MIC）分別為4.80、0.15 μg·mL-1。54 株菌株對嘧霉胺和咯菌腈的EC50值變化范圍分別為0.280～6.280 μg·mL-1、0.019 2～0.146 0 μg·mL-1。采用Graphpad prism 5.0軟件通過KS normailty 驗證，其中32 株菌株對嘧霉胺和54 株菌株對咯菌腈敏感性（EC50）均符合正態(tài)分布（p＞0.01）（圖1），因此可將這32 株灰霉病菌株對嘧霉胺的平均EC50值（0.407 7±0.401 7）和54 株灰霉病菌株對咯菌腈的平均EC50值（0.085 9±0.312 1）作為敏感基線。

圖1 甘肅韭菜灰霉病菌對嘧霉胺和咯菌腈的敏感性Fig.1 Sensitivity to pyrimethanil and fludioxonil of Chinese chive gray mold in Gansu province

由表1 可知，采集的54 株韭菜灰霉病菌株，有19 株對嘧霉胺產(chǎn)生抗性，抗性頻率為35.2%。各地區(qū)均已出現(xiàn)不同抗性的菌株，高抗菌株出現(xiàn)在隴中（蘭州、白銀）和河西（武威）地區(qū)，隴南地區(qū)抗性菌株均為低抗菌株。54 株灰霉病菌中僅有5 株對咯菌腈產(chǎn)生抗性，均為低抗菌株，抗性頻率為9.3%（表2）。

表1 甘肅各地韭菜灰霉病菌抗嘧霉胺分布Table 1 Distribution of pyrimethanil in chinese chiv gray mold in Gansu province

表2 甘肅各地韭菜灰霉病菌抗咯菌腈分布Table 2 Distribution of fludioxonil in chinese chiv gray mold in Gansu province

2.2 抗性菌株遺傳穩(wěn)定性

對嘧霉胺和咯菌腈的不同抗性菌株在連續(xù)轉(zhuǎn)接8 代后，各EC50值通過Graphpad Prism 5.0 系統(tǒng)t檢測分析（圖2）。在嘧霉胺壓力下，菌株BY-6 和LZ-3 轉(zhuǎn)代后的EC50與轉(zhuǎn)代前相比差異不顯著；菌株P(guān)L-2 轉(zhuǎn)接第6 代的EC50與轉(zhuǎn)代前比較差異顯著，且第8 代與第6 代差異顯著。在咯菌腈壓力下，菌株QY-6 轉(zhuǎn)代前后的EC50無顯著差異。

圖2 韭菜灰霉病菌對嘧霉胺及咯菌腈抗性遺傳穩(wěn)定性Fig.2 Genetic stability of resistance to pyrimethanil and fludioxonil in Chinese chive gray mold

2.3 抗性菌株適合度測定

2.3.1 抗/敏菌株菌絲生長速率及產(chǎn)孢量的測定由表3 可見，對嘧霉胺敏感性而言，不同菌株的菌絲生長速率有所差異，敏感菌株ZY-3 的生長速率最快，抗性菌株P(guān)L-2 和BY-6 的生長速率顯著高于LZ-3；在產(chǎn)孢量方面，LZ-3 和BY-6 間無顯著性差異，但LZ-3 顯著高于ZY-3 和PL-2，BY-6 顯著高于ZY-3。對咯菌腈敏感性而言，敏感菌株P(guān)L-4 和抗性菌株QY-6 的生長速率無顯著差異，但產(chǎn)孢量PL-4 顯著高于QY-6。

表3 抗/敏菌株的生長速率及產(chǎn)孢量Table 3 The growth rate and spore production of resistant and sensitive strains

2.3.2 抗/敏菌株致病性測定 由圖3 可知，在無嘧霉胺藥劑處理的葉盤上，各抗性菌株的發(fā)病率均顯著低于敏感菌株ZY-3，菌株發(fā)病率從高到低依次為：ZY-3＞PL-2＞BY-6＞LZ-3；在嘧霉胺處理的葉盤上，各抗性菌株發(fā)病率均顯著高于敏感菌株ZY-3，其中菌株P(guān)L-2 發(fā)病率顯著低于BY-6 和LZ-3。在無咯菌腈藥劑處理的葉盤上，低抗菌株QY-6 的發(fā)病率顯著低于敏感菌株P(guān)L-4，在咯菌腈處理的葉盤上兩者的發(fā)病率無顯著差異。

圖3 抗/敏菌株發(fā)病率Fig.3 Pathogenic frequency of resistant and sensitive strains

2.3.3 抗/敏菌株分生孢子競爭力測定 由圖4 可知，組合Cp1、Cp2、Cp3 及Cf4 中，敏感菌株侵染所致的病斑頻率均高于抗性菌株，說明敏感菌株孢子競爭力強(qiáng)于抗性菌株。在組合Cp1～Cp3 間，組合Cp3 中的抗性菌株孢子競爭力最大。在組合Cf4中，抗性菌株孢子競爭力達(dá)到了48%，幾乎與敏感菌株持平。

圖4 抗/敏菌株孢子競爭力Fig.4 Spore competitiveness between resistant and sensitive isolate

3 討論與結(jié)論

在甘肅省境內(nèi)采集分離得到的54 株韭菜灰霉病菌，對嘧霉胺的抗性表現(xiàn)為中抗、高抗水平，且具有地域性特點，高抗菌株出現(xiàn)在隴中（蘭州、白銀）和河西地區(qū)（武威），隴東地區(qū)（慶陽、平?jīng)觯┮灾小⒌涂咕隇橹鳎]南均為低抗菌株。甘肅省境內(nèi)韭菜灰霉病菌對嘧霉胺的敏感性處于下降趨勢，這與賈曉華[10]、Shattock[16]、紀(jì)明山等[17]研究結(jié)果相符。嘧霉胺屬于苯氨基嘧啶類殺菌劑，但是苯氨基嘧啶類殺菌劑作用靶點單一，容易產(chǎn)生抗藥性[17]，在農(nóng)藥壓力選擇下，中、高抗菌株將占據(jù)有利的選擇優(yōu)勢，逐漸成為主導(dǎo)菌株，不利于韭菜灰霉病菌的防治。采集的5 株韭菜灰霉病菌經(jīng)檢測對咯菌腈產(chǎn)生了低抗藥性，與普繼雄等[3]研究一致。相關(guān)研究表明，灰霉病菌對咯菌腈抗性適合度低于野生菌株，優(yōu)勢種群不易形成[18-19]，這也可能是抗性菌株比率較低的原因。對不同抗性菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性分析，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)代培養(yǎng)8 次后，低抗菌株對嘧霉胺的敏感性差異顯著，有向敏感菌株轉(zhuǎn)變的趨勢；中、高抗菌株敏感性無顯著變化，抗性水平可穩(wěn)定遺傳。韭菜灰霉病菌對嘧霉胺產(chǎn)生低抗藥性初期，應(yīng)加強(qiáng)田間菌株敏感性動態(tài)變化及抗藥性監(jiān)測，及時掌握其抗性水平的動態(tài)變化，適時調(diào)整用藥策略，可避免抗性菌株向中、高抗性發(fā)展。對咯菌腈產(chǎn)生低抗藥性的菌株轉(zhuǎn)接8 代后抗性水平可穩(wěn)定遺傳。

在抗性風(fēng)險評價中，營養(yǎng)生長、繁殖能力、抗性菌株致病性等適合度參數(shù)是評價抗性風(fēng)險的重要指標(biāo)，特別是營養(yǎng)生長和繁殖能力，能夠快速生長繁殖就意味著適合度更高[20]。當(dāng)韭菜灰霉病菌對嘧霉胺和咯菌腈產(chǎn)生抗性后，抗性菌株適合度的群體變化會在田間有所體現(xiàn)。通過對適合度研究，表明對嘧霉胺、咯菌腈產(chǎn)生抗性的菌株其菌絲生長速率均低于其敏感菌株，但是產(chǎn)孢量卻高于敏感菌株，這與史曉晶等[15]研究結(jié)果一致。任璐等[14]的研究表明，在相同生長環(huán)境中，抗性菌株菌絲生長速率、產(chǎn)孢量、致病力等適合度指標(biāo)均低于敏感菌株，筆者的研究在產(chǎn)孢量方面與其不一致。有研究表明，適合度與環(huán)境條件有密切關(guān)系[21]，這可能是因為室內(nèi)培養(yǎng)為抗性菌株提供了充足養(yǎng)分、適宜溫度等條件，有利于抗性菌株孢子產(chǎn)生，因此特定環(huán)境對適和度的影響還有待進(jìn)一步研究。對嘧霉胺產(chǎn)生抗性的菌株，環(huán)境適合度下降，特別是中、高抗菌株，適合度顯著低于低抗菌株，與敏感菌株不具有競爭優(yōu)勢，在田間不易形成優(yōu)勢群體。對咯菌腈產(chǎn)生抗性的低抗菌株致病性低于敏感菌株，但是孢子競爭力幾乎與敏感菌株保持相當(dāng)水平。這表明對咯菌腈產(chǎn)生抗性的低抗菌株有一定的生存能力，有必要重視可能發(fā)展成為優(yōu)勢菌群的風(fēng)險。

甘肅省部分區(qū)域韭菜灰霉病菌對嘧霉胺已經(jīng)產(chǎn)生了中、高水平抗藥性，但是抗性菌株適合度指標(biāo)均下降，生存能力下降，在與敏感群體生存競爭中不占優(yōu)勢。韭菜灰霉病菌對咯菌腈的抗性水平較低，但低抗菌株表現(xiàn)一定的適合度，生產(chǎn)中應(yīng)避免單一使用該藥劑，防止抗性菌株成為田間優(yōu)勢菌群。同時應(yīng)加強(qiáng)田間抗性監(jiān)測，根據(jù)不同區(qū)域韭菜灰霉病菌對藥劑的抗性水平，科學(xué)制定防治策略以期達(dá)到緩解韭菜灰霉病菌對嘧霉胺和咯菌腈的抗藥性壓力，有望延長此類藥劑的使用年限。