利用InDel 標(biāo)記鑒定汴早九號(hào)大白菜雜交種純度

馮健起，王培云，蔡亞平，丁 聰，王惠云，生園園

（1.河南省開(kāi)封市農(nóng)林科學(xué)研究院 河南開(kāi)封 475004； 2.河南省開(kāi)封市種業(yè)發(fā)展中心 河南開(kāi)封 475004；3.河南省開(kāi)封市農(nóng)業(yè)農(nóng)村發(fā)展服務(wù)中心 河南開(kāi)封 475004）

大白菜（Brassica rapa）是起源于我國(guó)的一種重要傳統(tǒng)蔬菜，在平衡穩(wěn)定我國(guó)“菜籃子”中起著重要作用。隨著我國(guó)城鎮(zhèn)化的發(fā)展以及蔬菜多元化的需求，大白菜的消費(fèi)傾向于優(yōu)質(zhì)、小型、軟葉率高的品種，汴早九號(hào)正是以此為目標(biāo)選育出來(lái)的新品種，2018 年該品種在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部完成非主要農(nóng)作物品種登記，編號(hào)為GPD 大白菜（2018）410957，適合黃淮海流域推廣種植，已在河南、河北、安徽、山東等地推廣，田間高抗病毒病，抗霜霉病以及軟腐病。

種子純度是種子主要的質(zhì)量指標(biāo)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，種子純度不合格易造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前，雜交種的純度鑒定通常采用田間形態(tài)學(xué)、蛋白質(zhì)電泳和DNA 分子標(biāo)記鑒定法。田間形態(tài)學(xué)鑒定法存在諸如周期長(zhǎng)、易受環(huán)境影響、重復(fù)性差等問(wèn)題，其準(zhǔn)確性難以把握[2]。而分子標(biāo)記技術(shù)因不受組織特異性及外界環(huán)境的影響，且具有鑒定準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性強(qiáng)等特點(diǎn)，已成為檢測(cè)作物雜交種純度真實(shí)且可靠的方法[3]。鐘開(kāi)勤等[1]利用相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性SRAP（Sequence-Related Amplified Polymorphism）標(biāo)記技術(shù)，快速且準(zhǔn)確鑒定福春1 號(hào)大白菜的純度。宋順華等[4]采用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）技術(shù)，準(zhǔn)確檢測(cè)2 個(gè)大白菜品種（北京新2 號(hào)、京夏王）的純度。楊曉云等[5]利用簡(jiǎn)單序列重復(fù)SSR（Simple Sequence Repeats）共顯性分子標(biāo)記P3鑒定青研早9 號(hào)、青研桔15 和青研春白一號(hào)3 個(gè)大白菜雜交種的純度。趙新等[6]應(yīng)用SSR 分子標(biāo)記及高分辨率溶解曲線HRM（High-Resolution Melting）技術(shù)篩選出用于大白菜雜交種純度鑒定的復(fù)合SSR位點(diǎn)，能對(duì)秋綠75、津秋78 和秋綠60 等10 份大白菜雜交種進(jìn)行純度鑒定；張庶等[7]利用3 對(duì)EST-SSR 引物（BRE28、BRE121 和BRE131）可快速、準(zhǔn)確地對(duì)13 個(gè)大白菜品種進(jìn)行純度鑒定；Zhang 等[8]利用在大白菜10 條染色體上均勻分布的36 個(gè)SSR 標(biāo)記，隨機(jī)選取其中的1～2 個(gè)SSR 標(biāo)記對(duì)大白菜雜交種進(jìn)行純度鑒定，并結(jié)合田間形態(tài)學(xué)鑒定驗(yàn)證了結(jié)果的可靠性；和禹廷等[9]利用2 對(duì)SSR 引物（SSRA 07-1 和SSRA 07-2）可以快速鑒定大白菜陜秋白3 號(hào)種子純度；魏小春等[10]基于自交不親和S 單元型多態(tài)性設(shè)計(jì)引物（BrCI 和BrCII），建立一種廣適應(yīng)性大白菜雜交種純度分子鑒定方法；薛銀鴿等[11]利用InDel（Insertion and Deletion）標(biāo)記引物組合BrID90107 和BrID10667，可將豫新四號(hào)與其親本完全區(qū)分開(kāi)來(lái)，能有效鑒別豫新四號(hào)大白菜雜交種純度；劉栓桃等[12]使用4 對(duì)InDel 引物能有效鑒定大白菜品種牛牌19 雜交種純度；王祥等[13]利用InDel 標(biāo)記可有效鑒定大白菜農(nóng)大Q210及農(nóng)大Q212 種子純度。然而，目前仍缺乏對(duì)汴早九號(hào)大白菜雜交種純度進(jìn)行高效、準(zhǔn)確分子鑒定的方法。

筆者從大量已公布的基于大白菜全基因組開(kāi)發(fā)的InDel 引物中篩選獲得了InDel 引物BrID90029，并利用該引物對(duì)汴早九號(hào)雜交種F1進(jìn)行純度鑒定，與田間形態(tài)的鑒定結(jié)果高度一致，為大白菜雜交種汴早九號(hào)的純度鑒定及良種的安全使用提供分子標(biāo)記依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 時(shí)間和地點(diǎn)

InDel 分子標(biāo)記鑒定試驗(yàn)于2023 年6 月在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行；育苗、大田種植試驗(yàn)于2023 年7-10 月在開(kāi)封市蔬菜科學(xué)研究所試驗(yàn)基地進(jìn)行。

1.2 材料

試驗(yàn)材料大白菜（Brassica rapa）雜交種汴早九號(hào)、母本P1（早85）、父本P2（345×東二）由開(kāi)封市蔬菜科學(xué)研究所十字花科研究室提供，植株表型如圖1所示。塑料大棚內(nèi)育苗，采用72 孔穴盤，根據(jù)天氣情況適時(shí)加蓋遮陽(yáng)網(wǎng)（遮光率40%），待幼苗長(zhǎng)至3 葉1 心期采摘嫩葉提取DNA。

1.3 方法

1.3.1 DNA 提取與定量 采用CTAB 大量法提取大白菜基因組DNA，具體方法參照魏小春[10]等并略有改動(dòng)。提取的基因組DNA 用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，利用凝膠成像系統(tǒng)（Tanon 2500，上海天能）進(jìn)行凝膠成像分析DNA 完整性，運(yùn)用核酸定量?jī)x（Nano-300，杭州奧盛）測(cè)定DNA 濃度，將DNA 模板原液用ddH2O 稀釋為工作液（質(zhì)量濃度為50 ng·μL-1）,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 InDel 引物來(lái)源 選用已公布的基于大白菜全基因組（http://www.brassicadb.cn）[14]開(kāi)發(fā)的32 對(duì)InDel 引物，具體的引物信息見(jiàn)表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.3.3 PCR 擴(kuò)增 采用優(yōu)化后的PCR 反應(yīng)體系，包括10 μL GenFQTaqMaster Mix（濟(jì)凡生物科技（北京）有限公司），上、下游引物（濃度為10 μmol·L-1）各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 6 μL。

PCR 反應(yīng)條件：95 ℃條件預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，10 ℃條件下保存。

1.3.4 InDel 引物篩選及PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)InDel 引物篩選：以汴早九號(hào)雜交種的2 個(gè)親本（P1和P2）DNA 為模板，利用表1 中所列的32 對(duì)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，具體參見(jiàn)1.3.3 部分，篩選出父母本間呈互補(bǔ)帶型、特異性好、易于辨別的清晰條帶的分子標(biāo)記用于后期雜交種純度鑒定。

基于篩選試驗(yàn)獲得1 對(duì)理想的InDel 引物，用于汴早九號(hào)大白菜雜交種純度的分子鑒定。

PCR 產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.3.5 InDel 分子標(biāo)記鑒定 將汴早九號(hào)大白菜雜交種F1種子進(jìn)行催芽和育苗（共288 株汴早九號(hào)大白菜植株），待幼苗長(zhǎng)至2～3 葉期時(shí)，分別進(jìn)行單株采集幼嫩葉片用于DNA 提取，并采用InDel 引物BrID90029 分別進(jìn)行PCR 檢測(cè)。種子純度/%=（供檢株數(shù)-雜株數(shù)量）/供檢株數(shù)×100。同時(shí)，將已采樣的幼苗在大田定植，進(jìn)行田間種植鑒定。

1.3.6 田間純度鑒定方法 自苗期至采收期，觀察并統(tǒng)計(jì)植株田間表型性狀進(jìn)行純度鑒定。根據(jù)植株生長(zhǎng)習(xí)性、生長(zhǎng)勢(shì)、葉面茸毛、外葉形狀、葉色、葉面皺縮情況、抱合方式、球形、球心色等表型特征判定是否為異型株。每隔3～5 d 觀察1 次并記錄。田間純度/%=（供檢株數(shù)-異形株數(shù)）/供檢株數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 汴早九號(hào)多態(tài)性引物篩選

對(duì)汴早九號(hào)的父本、母本各選擇10 株，建立DNA 混合池，然后進(jìn)行引物多態(tài)性篩選，結(jié)果如圖2所示。從已公布的基于大白菜全基因組開(kāi)發(fā)的32對(duì)InDel 核心引物中篩選獲得了1 對(duì)在汴早九號(hào)雜交種親本間具有多態(tài)性、帶型穩(wěn)定、易于辨別的InDel 引物BrID90029，編號(hào)為18。

圖2 汴早九號(hào)親本鑒定多態(tài)性分子標(biāo)記篩選結(jié)果Fig.2 The results of InDel markers screening in the parents of Bianzao No.9

2.2 大白菜雜交種汴早九號(hào)純度的鑒定

利用篩選的InDel 引物BrID90029 對(duì)汴早九號(hào)雜交種進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果如圖3 所示，在汴早九號(hào)苗期鑒定的288 株中，編號(hào)為109、114、120、140、148、170、201 的PCR 產(chǎn)物中只有父本帶或者母本帶，為非雜交種。樣本編號(hào)為109、114、140、148、170、201 的植株P(guān)CR 產(chǎn)物中缺少母本特異條帶，編號(hào)為120 的植株缺少父本特異條帶。其余的281 株，同時(shí)具有父母本特異條帶，為雜交種子。分子標(biāo)記鑒定其雜交種純度為97.57%。

圖3 汴早九號(hào)分子標(biāo)記純度鑒定結(jié)果Fig.3 The results of purity identification of Bianzao No.9 using the InDel marker

2.3 田間雜交種純度鑒定

對(duì)汴早九號(hào)的288 個(gè)單株進(jìn)行田間表型鑒定（圖4），其中發(fā)現(xiàn)編號(hào)為109、114、140、170、201 的5 株為異形株，田間表型鑒定純度為98.26%。經(jīng)計(jì)算，田間表型鑒定與分子標(biāo)記鑒定的吻合度為99.29%（表2）。

表2 汴早九號(hào)InDel 標(biāo)記與田間純度鑒定結(jié)果對(duì)比Table 2 Comparison of the results from InDel marker and field identification analyses in Bianzao No.9

圖4 汴早九號(hào)植株表型Fig.4 Phenotypes of Bianzao No.9 plants

3 討論與結(jié)論

隨著大白菜育種技術(shù)的進(jìn)步，新品種數(shù)量逐年增加。種子純度鑒定能夠保障種子優(yōu)良遺傳特性被充分利用，是防止良種混雜、提高種子質(zhì)量的重要手段。在生產(chǎn)實(shí)踐中，種子純度不合格可能給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

對(duì)大白菜雜交種進(jìn)行純度鑒定，傳統(tǒng)方法是田間形態(tài)學(xué)鑒定，這一方法通常是當(dāng)年收獲種子，秋季進(jìn)行田間鑒定，種子第二年才可銷售，而且容易受天氣等環(huán)境因素的影響，耗時(shí)長(zhǎng)且繁瑣，工作量大。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)越來(lái)越多地應(yīng)用于雜交種的純度鑒定。基于AFLP、SRAP、RAPD、SSR 和InDel 等分子標(biāo)記鑒定各種白菜品種和親本純度的研究結(jié)果表明，分子鑒定結(jié)果是可靠的[15-16]。共顯性DNA 分子標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于多態(tài)性好、易于辨別、操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定可靠。因此，基于DNA 分子標(biāo)記技術(shù)能更加有效地鑒別不同的甚至近親的基因型，該技術(shù)在雜交種純度鑒定等方面具有廣闊應(yīng)用前景。

與SSR 標(biāo)記相比，InDel 標(biāo)記的多態(tài)性較低、分布較密、帶型簡(jiǎn)單，在遺傳分析中的重現(xiàn)性、準(zhǔn)確性都相對(duì)較高[17]，在十字花科蔬菜如大白菜[11-13]、烏菜[18]、蘿卜[19]等品種純度鑒定中應(yīng)用廣泛。利用In-Del 標(biāo)記進(jìn)行雜交種純度鑒定可實(shí)現(xiàn)規(guī)模化檢測(cè)，具備廣闊的應(yīng)用前景，有望成為種子純度鑒定的發(fā)展方向。大白菜雜交種汴早九號(hào)品質(zhì)優(yōu)良，已廣泛應(yīng)用于我國(guó)黃淮海流域。為了準(zhǔn)確、高效地鑒定汴早九號(hào)的種子純度，保障其品質(zhì)和生產(chǎn)實(shí)踐，急需開(kāi)發(fā)適用于汴早九號(hào)雜交種純度鑒定的InDel 分子標(biāo)記檢測(cè)方法。

筆者從已公布的基于大白菜全基因組開(kāi)發(fā)的32 對(duì)InDel 核心引物中篩選獲得了1 對(duì)譜帶差異大且穩(wěn)定的雙親互補(bǔ)型InDel 引物（BrID90029）進(jìn)行汴早九號(hào)雜交種的純度鑒定，對(duì)288 份材料的鑒定結(jié)果與大田調(diào)查結(jié)果高度吻合，分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與田間形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果相比，差異僅為0.69%，結(jié)果偏差≤2%，符合誤差允許范圍[20-21]，檢測(cè)結(jié)果快速、準(zhǔn)確。劉栓桃等[12]使用4 對(duì)InDel 引物對(duì)大白菜品種牛牌19 雜交種進(jìn)行了有效鑒定。王祥等[13]利用InDel 標(biāo)記有效鑒定農(nóng)大Q210 及農(nóng)大Q212大白菜種子純度。可見(jiàn)，針對(duì)不同的大白菜品種雜交一代種子純度鑒定可開(kāi)發(fā)特異性的InDel 標(biāo)記，利用所獲得的InDel 標(biāo)記進(jìn)行分子鑒定，可快速有效地鑒定大白菜雜交種純度。筆者的研究結(jié)果表明，單一InDel 引物BrID90029 可對(duì)大白菜雜交種汴早九號(hào)雜交種純度進(jìn)行有效鑒定，極大提高了檢測(cè)效率，解決了田間形態(tài)學(xué)鑒定種子純度所面臨的難題，可為大白菜種子純度及真實(shí)性鑒定提供新的標(biāo)記方法。