不同液體培養基質與模式對星孢寄生菇生長發育的影響

彭澤琴，唐榮平，周會明，王 婷，肖龍濱，王 穎，朱遠愛，崔羽彤，李賢林

（滇西科技師范學院生物技術與工程學院 云南臨滄 677000）

星孢寄生菇（Asterophora lycoperdoides）是一種兼有寄生與腐生營養方式的寄生菇屬（Asterophora）真菌，既寄生于紅菇屬真菌黑菇（Russula adusta）、稀褶黑菇（R.nigricans）、密褶黑菇（R.densifolia）等變黑且腐爛的子實體菌蓋中央、菌褶及菌柄之上并擁有擔孢子與厚垣孢子兩大孢子體系，又在人工培養基上比普通菇類更容易栽培出菇[1-2]。營養生理是眾多野生珍稀菇類人工馴化解決的首要問題，個體發育是菇類營養生理在菌體轉化與形態發生不同階段的直觀體現，獨特的營養方式又是菇類基于遺傳特性對外界營養脅迫的一種生存適應性，因此，獨特的星孢寄生菇是研究擔子菌個體發育的理想材料，探究營養因子變化對其個體發育的影響，有助于弄清該菇生長發育過程及其與基質的關系，同時也為弄清其他腐生與寄生野生菇類營養需求機制提供有利的理論參考。

目前，針對星孢寄生菇的種質資源評價[3]、形態學分類[4]、親緣關系分析[5]等研究報道居多，而有關營養生理的研究比較滯后。王建東等[6]采用固體基質培養法對其基礎培養基、碳氮源、pH 以及溫度僅進行了初步試驗，然而，目前諸多野生菇類生長環境遭到人為破壞[7]且未受到有效保護與利用[8]，菇類個體發育因缺乏合適的材料已成為食用菌領域研究的難點[9]，且受外界條件[10-14]與內在因素[15-16]的影響極為顯著。因此，針對星孢寄生菇個體發育與營養基質關系的研究，尋找影響菇體馴化出菇的營養障礙，對開發其他珍稀菇類有重要的參考意義。

菇類的個體發育過程受營養條件影響較大[17-19]。液體培養比固體培養更容易觀察和測定菇類菌絲體的生長變化情況。筆者基于星孢寄生菇容易培養出菇的特性，采用液體搖動與靜置培養相結合的方法，分析了營養變化對該菇整個生活史中菌絲生長期、子實體形成期、厚垣孢子形成期3 個重要時期生長發育過程的影響，以期為其他珍稀大型真菌的開發利用提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 星孢寄生菇保存于云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所，菌株編號：YAASM4665。新鮮的水葫蘆采集于滇西科技師范學院人工湖，靈芝、荷葉離褶傘、香菇由食用菌課題組提供新鮮完整子實體和靈芝菌糠，剩余添加材料均購買于云南省臨滄市批發市場。

1.1.2 培養基 以基礎培養基（馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、水1 L，pH 自然）為對照配方1，添加經200 目篩且80 ℃下烘干處理的水葫蘆（配方2）、木屑（配方3）、棉籽殼（配方4）、雞糞（配方5）、黑豆（配方6）、菌糠（配方7）、靈芝（配方8）、荷葉離褶傘（配方9）、香菇（配方10）、野生香菇（配方11）、灰肉紅菇（配方12）的超細粉各3 g 依次制備成液體培養基配方，取100 mL 培養液分裝于250 mL 的三角瓶中，每處理9 次重復，采用封口膜及4 層報紙封口，121 ℃下滅菌30 min，冷卻至30 ℃左右接種。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化與接菌 試驗于2022 年5 月在滇西科技師范學院食用菌實訓室內進行。將該菇母種在室溫下培養6 d，然后接種于PSA（馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g、水1 L，pH 自然）培養基平板中，于25 ℃下培養7 d。在無菌操作下取5 塊直徑5 mm 的同心圓菌落接入上述液體培養基內[20]并將搖瓶置于搖床內在25 ℃下靜置培養。

1.2.2 液體搖動培養 搖瓶靜置培養24 h 后，調節搖床轉速，在150 r·min-1下進行搖動培養，記錄菌絲萌發和菌球形成的時間（d）。培養12 d 后，每組隨機選取3 個搖瓶，測定菌絲形成期培養液的體積（mL）、pH、顏色、氣味，菌球顏色、形狀、氣味、數量（個·mL-1）、直徑（mm）及生長速度（mm·d-1）。將菌球（培養液經5 層紗布過濾）在80 ℃下烘干至恒質量，然后稱質量即菌球生物量（mg·mL-1）[21]。菌球形成率/%=菌球干質量/基質干質量×100。

1.2.3 液體靜置培養 在培養物經搖動培養12 d后轉為靜置培養，記錄其表面原基、菌膜、菇蕾、幼菇、厚垣孢子初期（第一朵子實體出現厚垣孢子）、厚垣孢子中期（超過1/2 的子實體出現厚垣孢子）、厚垣孢子后期（全部子實體出現厚垣孢子）形成時間（d）。當菌液表面出現10～25 個子實體時，隨機選取3 瓶培養物，測定子實體形成期上述各項參數，菌膜與子實體生物量的測定方法與菌球生物量相同，生物量=菌球生物量+菌膜生物量+子實體生物量，絕對生物學效率/%=子實體鮮質量/基質干質量×100。當培養物表面所有子實體均出現厚垣孢子時為厚垣孢子形成期，測定參數同1.2.2。

1.3 統計分析

采用SPSS 19.0 統計軟件對上述試驗結果進行差異顯著性分析[22]。

2 結果與分析

2.1 不同液體基質對星孢寄生菇個體發育的影響

由圖1 可知，不同基質對該菇3 個發育時期的培養液色澤、菌球、菌膜等生長特征、周期、顏色及氣味影響較大。添加棉籽殼、黑豆、香菇以及灰肉紅菇的基質上該菇子實體發育正常，其余基質上均出現不同程度的畸形菇，以木屑與荷葉離褶傘基質畸形菇最為嚴重。培養液多為淡黃色、腐木味或菇香味；菌球以枯茶色、腐木味、球形略多，但添加木屑、棉籽殼、菌糠的基質中菌球為橢球形；菌膜在子實體形成期主要為亞麻色與淡黃色，厚垣孢子形成期以香色、亞麻色及練色為主，添加黑豆的基質上為淡黃色，添加荷葉離褶傘與野生香菇的基質上為亞麻色，添加菇類的基質上以亞麻色居多；子實體在其形成期以灰白色、菇香味為主，少數為白色、無味；厚垣孢子形成期以肌色為主，部分乳白色、灰白色及象牙色，菇香味，添加黑豆的基質上為灰白色，越到后期其菇香味越明顯。

圖1 不同基質對星孢寄生菇發育特征的影響Fig.1 Effects of different matrix on the developmental characteristics of Asterophora lycoperdoides

液體搖動培養階段，與對照相比，除添加木屑的基質不利于該菇菌絲萌發（3 d）和菌球形成（5 d）外，在其他基質上菌絲萌發（2 d）和菌球形成（3 d）的時間相同（圖2）。液體靜置培養階段，該菇在不同基質上從原基形成至所有子實體上出現厚垣孢子的周期由長至短依次為添加雞糞、黑豆、灰肉紅菇、棉籽殼、菌糠、水葫蘆、對照、荷葉離褶傘、野生香菇、香菇、靈芝、木屑的基質。與對照相比，添加木屑的基質最有利于縮短原基、菌膜、菇蕾等農藝性狀的形成時間，尤其是所有子實體上布滿厚垣孢子的周期最短（14 d），其次是靈芝、香菇、野生香菇基質，而添加雞糞的基質上，該菇上述農藝性狀的形成時間最長，其中厚垣孢子布滿所有子實體的周期達到30 d，與其余配方相比呈極顯著差異，其次是黑豆、灰肉紅菇、棉籽殼。

圖2 不同基質對星孢寄生菇發育周期的影響Fig.2 Effect of different matrix on the development cycle of Asterophora lycoperdoides

2.2 不同液體基質對星孢寄生菇培養液pH與體積的影響

由表1 可知，不同基質滅菌后pH 發生了不同程度的下降，其中對照降低幅度最小。接菌后，菌絲生長期培養液pH 除對照降低外，其余配方均快速上升；子實體形成期至厚垣孢子形成期，其pH 保持緩慢上升的趨勢，除添加雞糞、黑豆的基質外，厚垣孢子形成期菇類基質（配方8～12）pH 均大于其余配方，該菇在添加灰肉紅菇的基質上接種后其pH提高最快且在3 個時期均最高，分別為8.49、8.53、8.61，在菌絲生長期、子實體形成期、厚垣孢子形成期pH 最低分別為對照、添加菌糠、棉籽殼的基質，分別為6.08、7.45、7.70。

表1 不同基質對星孢寄生菇培養液pH 與體積的影響Table 1 Effect of different matrix on pH and volume of culture liquid of Asterophora lycoperdoides

該菇接菌后培養液總體積（100.00 mL）隨著個體發育的推進逐漸減少，其中菌絲生長期在添加野生香菇的基質上體積減少最多（10.00 mL），在菌糠基質上減少最小（7.00 mL）；子實體形成期在添加香菇的基質上體積減少最多（19.00 mL），在棉籽殼和菌糠基質上減少最小（11.00 mL）；厚垣孢子形成期在添加菌糠的基質上體積減少最多（19.97 mL），在對照上減少最小（14.67 mL）。在菌絲生長期菌糠培養液總體積最大，為93.00 mL；在子實體形成期棉籽殼與菌糠培養液總體積最大，為89.00 mL；在厚垣孢子形成期對照培養液總體積最大，為85.33 mL，均與添加荷葉離褶傘與野生香菇基質呈極顯著差異，3 個時期培養液總體積最小的分別為添加野生香菇、香菇、菌糠的培養基，分別為90.00、81.00、80.03 mL。

2.3 不同液體基質對星孢寄生菇菌球直徑、數量及生長速度的影響

由表2 可知，該菇菌球數量在菌絲生長期、子實體形成期、厚垣孢子形成期分別以添加荷葉離褶傘、野生香菇、水葫蘆的基質上最多，分別為29.20、35.20、8.42 個·mL-1，在添加木屑、黑豆、棉籽殼基質上最少，分別為4.20、0.10、1.25 個·mL-1。菌球直徑在各期分別以添加木屑、雞糞、木屑的基質上發育最大，分別為2.60、5.44、4.13 mm，在水葫蘆、靈芝、對照基質上最小，分別為1.08、0.74、1.75 mm。菌球的生長速度在各期分別以添加木屑[（0.37±0.03）mm·d-1]、雞糞[（0.18±0.03）mm·d-1]、木屑[（0.11±0.02）mm·d-1]的基質上最快，且與其余配方相比呈極顯著差異，在添加水葫蘆[（0.12±0.01）mm·d-1]、黑豆[（0.03±0.00）mm·d-1]、對照[（0.02±0.00）mm·d-1]基質上的菌球生長速度最慢。

表2 不同液體基質對星孢寄生菇菌球直徑、數量及生長速度的影響Table 2 Effect of different liquid matrix on diameter,quantity and growth rate of mycelium ball of Asterophora lycoperdoides

總之，該菇菌球數量在添加荷葉離褶傘的基質上均值最多，雞糞基質上菌球數量均值最少，菌球直徑與生長速度在添加雞糞的基質上均值最大，棉籽殼基質上均值均最小。

2.4 不同液體基質對星孢寄生菇菌膜與子實體的影響

由表3 可知，該菇菌膜厚度在子實體形成期以添加靈芝的基質上最大（5.00 mm），添加木屑的基質上最小（1.20 mm），厚垣孢子形成期以添加棉籽殼的基質上最大（4.50 mm），添加木屑的基質上最小（2.33 mm）。菌膜生長速度在子實體形成期、厚垣孢子形成期分別以添加靈芝[（1.67±0.09）mm·d-1]、雞糞[（0.21±0.03）mm·d-1]的基質上最大，除棉籽殼、灰肉紅菇基質外，均與其余配方呈顯著差異，但均在木屑基質上最小。該菇子實體數量在各期以添加野生香菇（0.49 個·mL-1）、木屑（1.03 個·mL-1）的基質上最多，以添加荷葉離褶傘（0.04 個·mL-1）、雞糞（0.13 個·mL-1）的基質上最少。

總之，該菇菌膜厚度與生長速度在添加靈芝的基質上均值最大，木屑基質上最小，子實體數量在添加木屑的基質上均值最多，雞糞基質上最少。

2.5 不同液體基質對星孢寄生菇生物量、菌球形成率及絕對生物學效率的影響

由表4 可知，該菇生物量在菌絲生長期以添加野生香菇的基質上最大[（5.60±0.11）mg·mL-1]，其次是黑豆基質[（5.52±0.11）mg·mL-1]，與其余配方呈極顯著差異，而對照基質上該值最小，與其余配方呈極顯著差異；生物量在子實體形成期、厚垣孢子形成期分別以添加棉籽殼[（6.47±0.47）mg·mL-1]、菌糠[（6.10±0.76）mg·mL-1]的基質上最大，除荷葉離褶傘基質外，均與其余配方呈顯著差異，而在對照基質上均最小。菌球形成率在菌絲生長期、子實體形成期、厚垣孢子形成期分別以添加黑豆（4.41%）、靈芝（3.00%）、菌糠（2.35%）的基質上最大，在添加雞糞（2.40%）、對照（0.71%）、對照（0.64%）的基質上最小。絕對生物學效率在后2 個時期分別以添加木屑（6.59%）、靈芝（7.73%）的基質上最大，在雞糞（0.35%）、棉籽殼（0.25%）的基質上最小。

表4 不同液體基質對星孢寄生菇生物量、菌球形成率及絕對生物學效率的影響Table 4 Effect of different liquid matrix on biomass,mycelium ball formation rate and absolute biological efficiency of Asterophora lycoperdoides

總之，該菇生物量在添加棉籽殼的基質上均值最大，對照最小；菌球形成率在添加靈芝的基質上均值最大，對照最小；絕對生物學效率在添加木屑的基質上均值最大，在添加雞糞的基質上均值最小。

3 討論與結論

菇類生長發育的基礎是營養基質[23-26]，其原基的發生是基于特定營養條件下菌絲對外界脅迫的響應，子實體的發育是遺傳物質、營養條件及外界環境共同互作的結果。

試驗表明，星孢寄生菇在不同基質上的農藝性狀、培養物體積、培養液pH 等差異較大，添加棉籽殼、黑豆、香菇和灰肉紅菇有利于該菇在液體培養下子實體的形成，上述結果可能與基質養分利用、氮素含量、有機酸分泌等因素有關。

菇類在營養生長與生殖生長兩個階段利用的養分種類不同，前者以無氮浸出物為主，后者則通過胞外酶降解大分子物質（纖維素、半纖維素、木質素等）為主[27]。氮素在基質中通過促進菇類菌絲細胞中酶、輔酶、核酸等[28]物質合成的數量進而影響其新陳代謝與營養元素的吸收轉化速度。因此，基質中的養分利用和氮素含量不同會影響該菇類的形態發生特征和菌體轉化速度，最終影響其農藝性狀和培養物體積。基質pH 的變化主要與有機酸產生有關，且有機酸分泌受多種因素的影響[29-31]。基質加熱、菇體代謝、代謝產物互相反應等可能是該菇培養液pH 存在差異的主要原因。同時，棉籽殼含有豐富的無氮浸出物（39.5%）和粗纖維（34.5%）[32]，黑豆素有“植物蛋白之王”的美譽且蛋白質（36.1%）和碳水化合物（23.3%）含量高[33]，添加上述兩種物質均能滿足該菇的養分需求，促進其子實體發育。香菇與灰肉紅菇極有可能與黑紅菇[2]一樣其菇體中的某些物質對星孢寄生菇的子實體的形成有促進作用。此外，菌株種類、滅菌時間、培養時間等是否是改變上述試驗結果的因素之一有待進一步研究。

在12 種培養基質與2 種培養模式下，星孢寄生菇的個體發育與農藝性狀存在一定程度的差異。棉籽殼、黑豆、香菇、灰肉紅菇4 種基質有利于該菇子實體的發育。與對照相比，雞糞、黑豆、灰肉紅菇、棉籽殼能顯著延長該菇生命周期，而木屑、靈芝、香菇、野生香菇則相反。在搖瓶發酵階段，黑豆、野生香菇、香菇、荷葉離褶傘、灰肉紅菇和靈芝能夠提高該菇的生物量。在靜置發酵階段，棉籽殼和菌糠更有利于該菇生物量的積累。在添加木屑的基質上，該菇的絕對生物學效率最高；在添加靈芝的基質上，該菇的菌球形成率最高。總之，筆者的研究為進一步探究星孢寄生菇的發育機制以及其他珍稀菇類的馴化提供了理論參考。