小西葫蘆黃花葉病毒甜瓜分離物的基因組及其侵染性克隆

劉莉銘，彭 斌，康保珊，吳會杰，劉 茜，古勤生

（1.河南省果樹瓜類生物學重點實驗室·中國農業科學院鄭州果樹研究所 鄭州 450009；2.中國農業科學院中原研究中心 河南新鄉 453500）

小西葫蘆黃花葉病毒（zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）屬于馬鈴薯Y 病毒屬（Potyvirus），通過蚜蟲、機械接觸和種子進行傳播，主要侵染甜瓜、黃瓜、西瓜、西葫蘆等瓜類作物，引起植株生長緩慢、矮化、花葉、蕨葉、新葉變小、果實畸形等，造成巨大經濟損失，嚴重制約瓜果產業的可持續發展。該病毒于1981 年在意大利首次發現[1]，1991 年在我國新疆首次報道[2]，目前在世界范圍內廣泛分布[3-4]。

獲得ZYMV 不同分離物的序列信息，分析其系統進化關系，可以了解它們的發生、起源及變異規律，為防控病害發生提供重要理論依據[5-15]。病毒侵染性克隆的獲得使RNA 病毒能夠在DNA 水平上應用基因工程手段研究病毒各基因功能及致病機制。前期筆者團隊（中國農業科學院鄭州果樹研究所西瓜甜瓜病蟲害防控課題組）從河南臨穎的甜瓜發病植株中分離獲得ZYMV 分離物CH99/87（CH-87），并對其外殼蛋白基因進行了克隆和序列分析[16]。筆者在此基礎上擬通過擴增獲得該分離物的全基因組序列，以分析與其他ZYMV 分離物之間的序列一致性和系統進化關系，為深入開展該病毒的遺傳多樣性分析和進化機制研究奠定基礎。同時通過構建全長cDNA 克隆，分析該克隆在不同瓜類作物上的侵染性，為在瓜類作物上開展該病毒的分子致病性和寄主抗病性等研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2021 年4—9 月在中國農業科學院鄭州果樹研究所進行，ZYMV 分離物CH-87 分離自甜瓜發病植株，由中國農業科學院鄭州果樹研究所西瓜甜瓜病蟲害防控課題組鑒定和保存。

1.2 載體構建

取約0.1 g 甜瓜發病葉片，提取葉片總RNA并合成cDNA，具體操作參照RNAsimple 總RNA 提取試劑盒和PrimeScript ?RT reagent Kit with gDNA Eraser 說明書。根據NCBI 數據庫中已知ZYMV 分離物的全基因組序列信息，設計4 對引物HF-Z-1F/Z-1R、Z-2F/Z-2R、Z-3F/Z-3R、Z-4F/HF-Z-4R（表1），以cDNA 為模板，對分離物CH99/87 的全基因組進行分段擴增。利用NEBuilder 高保真DNA 組裝預混液將獲得的4 個PCR 產物與經StuI 和SmaI 雙酶切處理的植物表達載體pXT1（由南京農業大學陶小榮教授饋贈）進行同源重組、轉化、菌液PCR 篩選、測序驗證，最終獲得含有 CH- 87 全基因組的 cDNA 克隆pXT1-ZYMV。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers used in the study

1.3 序列分析

對pXT1-ZYMV 進行測序、拼接，獲得CH-87分離物的全基因組序列。利用Mega X 中的Clustal W 對CH-87 分離物與NCBI 數據庫中已知ZYMV 分離物的序列進行比對，再用BioEdit軟件進行序列一致性分析[17]。以西瓜花葉病毒（watermelon mosaic virus，WMV，AY437609）為外組，分別基于CP 蛋白和多聚蛋白的氨基酸序列，利用Mega X 軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）對ZYMV 分離物進行系統進化分析[18]。

1.4 侵染性分析

試驗于2021 年6—8 月在中國農業科學院鄭州果樹研究所西瓜甜瓜病蟲害防控課題組溫室進行。其中，甜瓜品種為白玫，由新疆農業科學院哈密瓜研究中心提供；黃瓜品種為津研4 號，種子購自天津科潤農業科技股份有限公司；西瓜品種為鄭抗2 號，由中國農業科學院鄭州果樹研究所提供；西葫蘆品種為歐諾，種子購自太谷區雨潤谷禾種業有限公司。當以上瓜類作物植株培養至子葉完全展開時用于試驗。將pXT1-ZYMV 利用液氮凍融法轉入農桿菌GV3101 菌株中，利用菌液PCR 篩選獲得陽性克隆，隨后進行擴大培養和接種檢測，并將發病葉片進一步進行摩擦接種分析，每次接種甜瓜、黃瓜、西瓜、西葫蘆各8 株，3 次重復，以接種誘導緩沖液的植株為對照，具體農桿菌培養、誘導和接種方法參照劉莉銘等[19]。待接種28 d 后，利用引物Z-8284F/Z-T7-9337R 對發病葉片進行RT-PCR 擴增，分析pXT1-ZYMV 在不同瓜類作物中的侵染性，以Z-8927F/Z-T7-9337R 為引物，對CH-87 分離物基因組的8927～9337 nt 區域進行擴增，PCR 產物經體外轉錄獲得地高辛標記的RNA 探針，利用dot blot方法進一步檢測植株葉片中ZYMV 的侵染情況。

2 結果與分析

2.1 ZYMV分離物CH-87的基因組

CH-87 基因組全長為9592 nt，它的5’UTR 和3’UTR 分別對應基因組的1～138 nt 和9382～9592 nt，全基因組編碼1 個由3080 個氨基酸組成的多聚蛋白（139～9381nt，9243nt），經蛋白酶切割，形成10個成熟的蛋 白 質，包 括P1（139～1068 nt，930 nt，310 aa）、HC-Pro（1069～2436 nt，1368 nt，456 aa）、P3（2437～3474 nt，1038 nt，346 aa）、6K1（3475～3630 nt，156 nt，52 aa）、CI（3631～5532 nt，1902nt，634 aa）、6K2（5533～5691 nt，159 nt，53 aa）、NIa-VPg（5692～6261 nt，570 nt，190 aa）、NIa-Pro（6262～6990 nt，729 nt，243 aa）、NIb（6991～8541 nt，1551 nt，517 aa）和CP（8542～9378 nt，837 nt，279 aa），P3 編碼區內部通過+2 移碼產生PIPO（2889～3122 nt，234 nt）。其具體基因組結構如圖1 所示，GenBank 登錄號為MN296124。

圖1 ZYMV 分離物CH-87 的基因組結構示意圖Fig.1 Schematic representation of ZYMV isolate CH-87 genome organization

2.2 分離物CH-87序列分析

序列一致性分析表明，分離物CH-87 與其他分離物的全基因組核苷酸序列一致性平均值為91.42%，與美國BL-67 分離物一致性最高，為97.60%，與韓國分離物KR-PE 和KR-PS 一致性次之，與澳大利亞分離物Gld-1 和Knx-22 一致性最低（表2）。分離物CH-87 與其他分離物的多聚蛋白氨基酸序列一致性平均值為96.45%，與美國BL-67分離物一致性最高，為99.30%，與韓國分離物BR1一致性次之，與新加坡分離物Singapore 一致性最低（表2）。

表2 ZYMV 分離物CH-87 與其他分離物全基因組核苷酸和氨基酸的序列一致性Table 2 The identity of nucleotide sequences and amino acid sequences of complete genome between ZYMV isolate CH-87 and other isolates

基于ZYMV CP 蛋白氨基酸序列的系統進化分析結果顯示，供試45 個ZYMV 分離物可以分為A、B 兩組，A 組由來自17 個國家的40 個分離物組成，B 組由來自新加坡和澳大利亞的西瓜和西葫蘆分離物組成（圖2）。其中，A 組進一步聚類為5個亞組I～V。亞組I由來自斯洛伐克、印度、捷克、西班牙、埃及、阿根廷、伊朗、土耳其、伊拉克、以色列、澳大利亞和中國臺灣的西葫蘆、大豆、西印度黃瓜、筍瓜、南瓜、黃瓜和甜瓜分離物組成，亞組Ⅱ由來自澳大利亞和日本的西瓜、黃瓜、西葫蘆、帽兒瓜分離物組成，亞組Ⅲ由來自意大利、澳大利亞和特立尼達和多巴哥的西葫蘆、甜瓜和南瓜分離物組成，亞組Ⅳ由來自土耳其、韓國和中國的西葫蘆和南瓜分離物組成，亞組V由來自韓國、中國和美國的甜瓜、南瓜、絲瓜和芝麻分離物組成。而筆者獲得的CH-87 分離物與美國南瓜分離物（BL-67）親緣關系最近，與中國絲瓜分離物（CN∶Lc∶17）、芝麻分離物（zz）和韓國的3 個南瓜分離物（BR1、KR-PE、KR-PS）親緣關系次之，它們均聚于亞組V中（圖2）。

圖2 基于CP 蛋白氨基酸序列的ZYMV 分離物系統進化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of ZYMV isolates based on the amino acid sequences of CP

基于ZYMV 多聚蛋白氨基酸序列的系統進化分析結果顯示，供試ZYMV 分離物也可以分為2 組（圖3），與圖2 系統進化分析結果相比，兩者的B 組分離物成員一致，A 組亞組成員組成中有所差異，其中，CH-87 分離物與美國南瓜分離物（BL-67）親緣關系最近，與中國絲瓜分離物（CN∶Lc∶17）親緣關系次之，而與中國芝麻分離物（zz）和韓國的3 個南瓜分離物親緣關系稍遠。

圖3 基于多聚蛋白氨基酸序列的ZYMV 分離物系統進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of ZYMV isolates based on the amino acid sequences of ployprotein

2.3 分離物CH-87全長cDNA克隆的侵染性

將CH-87 的全長cDNA 克隆pXT1-ZYMV 經農桿菌介導的方法接種甜瓜、黃瓜、西瓜和西葫蘆植株。接種后1 周左右，甜瓜接種植株開始產生花葉癥狀，接種后2 周左右，甜瓜花葉明顯，黃瓜、西瓜和西葫蘆接種植株開始產生癥狀（圖4-A）。隨著接種時間的延長，甜瓜、西瓜和西葫蘆接種植株發病逐漸嚴重，植株矮化明顯，葉片花葉嚴重、畸形、葉緣呈鋸齒狀（圖4-B）。利用一步RT-PCR 方法對發病植株中ZYMV 的侵染情況進行檢測，并經dot blot 進一步分析，確認發病植株均被ZYMV 所侵染（圖4-C～D）。將甜瓜發病葉片通過摩擦接種方式進一步接種甜瓜和西瓜植株，在接種后1～2 周，所有接種植株也均可發病，經PCR 分析進一步證實了ZYMV 的侵染。以上結果說明分離物CH-87 的侵染性克隆構建成功，該克隆在4 種供試瓜類作物上均可系統侵染，并產生典型的花葉癥狀。

3 討論與結論

筆者基于CP 蛋白和多聚蛋白的氨基酸序列對ZYMV 進行了系統進化分析，發現亞洲的日本、新加坡、韓國、以色列、伊朗、印度、中國、伊拉克、土耳其分離物分散分布于A 組中的3 個或4 個亞組和B 組中，歐洲的斯洛伐克、捷克、西班牙、意大利分離物分布于A 組中的2 個亞組中，而來自不同國家和地區的多個寄主分離物則分散分布于A 組各亞組或B 組中，即各組是有多個來自不同寄主的分離物組成，而并非由單個寄主分離物組成，說明ZYMV 在進化上與地域差異和寄主范圍不相關，與付晶晶等[11]報道一致。另外，通過對比本研究的兩組系統進化分析結果，發現CH-87 分離物與zz、KR-PA、KR-PS、KR-PE 等這些分離物的親緣關系遠近有所差異。已有研究者發現，基于單一區域序列的分析難以準確反映馬鈴薯Y 病毒屬成員的系統進化關系[13，20-21]，筆者在本研究中進一步證實了基于單一區域序列進行進化分析的局限性。

針對ZYMV 序列進行的多項研究表明，不同分離物之間存在不同程度的序列差異，其中尤以P1 保守性最差[12-13，22]。ZYMV 侵染性克隆的獲得使人們可以開展該病毒分子致病性相關工作，以揭示不同分離物之間的序列差異在病毒致病性中所起的作用及對寄主范圍的影響。目前已有ZYMV 侵染性克隆成功構建的報道[23-25]，筆者在本研究中針對甜瓜分離物CH-87 進行了侵染性克隆的構建，并通過接種試驗證實了該克隆在4 種瓜類作物上的適用性。另外，在此侵染性克隆的基礎上，筆者已成功表達了eGFP 報告基因[19]。筆者的試驗對該分離物的基因組信息的詳細描述和系統分析為更好地將該分離物的侵染性克隆和eGFP 重組克隆應用于瓜類作物相關研究提供了基礎。