柴黃清胰活血顆粒對重癥急性胰腺炎大鼠胰腺組織細胞自噬的影響*

蔣亞玲,張雨森,馮 雯,王天剛,陳 輝,向 未,李 翼,王陽洋,李 麗

(西南醫科大學附屬中醫醫院脾胃科,四川瀘州 646000)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是由多種病因引起胰酶異常活化的化學性炎癥,是急性胰腺炎中病情最兇險的一種,其臨床死亡率高達15%～30%[1]。目前,SAP的發病機制主要集中在胰腺腺泡細胞內胰酶的異常激活[2]。研究證實,胰酶異常激活導致細胞損害與自噬受損有較大關系[3-4]。而評價自噬受損的一個重要指標就是自噬通量,它不僅僅是檢測自噬小體數量,還需動態追蹤自噬底物的行程變化,即證實底物是否到達溶酶體,并觀察自噬底物降解率的變化,以此綜合評價自噬水平的高低[5]。課題組前期研究表明[6-9],柴黃清胰活血顆粒能明顯改善患者臨床癥狀和體征,減輕炎癥反應,改善腸道微循環,保護肝肺腎等重要臟器功能,但其具體作用機制尚不明確。本實驗擬探討柴黃清胰活血顆粒對SAP大鼠自噬通量的調控,從而初步揭示其治療SAP的部分機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠48只,體重200～230 g,8周齡,許可證號SCXK(川) 2018-17,購自西南醫科大學實驗動物中心。SPF級動物房恒溫適應性喂養1周,自由飲食。

1.2 試劑與儀器

柴黃清胰活血顆粒(西南醫科大學附屬中醫醫院,批號20220416);牛磺膽酸鈉(美國Sigma公司,貨號T9034);微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)兔多克隆抗體(江蘇親科生物研究中心有限公司,貨號DF7421),自噬效應蛋白(Beclin-1)抗體(江蘇親科生物研究中心有限公司,貨號AF5128),溶酶體相關膜蛋白2(LAMP2)抗體(江蘇親科生物研究中心有限公司,貨號DF6719),SQSTM1/p62 抗體(英國Abcam公司,貨號AF5384),胰島素兔多克隆抗體(Insulin Rabbit pAb,武漢愛博泰克生物科技有限公司,貨號A2090)。辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗(武漢愛博泰克生物科技有限公司,貨號AS014);全自動生化分析儀(日本Olympus公司),光學顯微鏡(福建麥克奧迪實業集團有限公司),激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司),電熱恒溫培養箱(上海博迅實業有限公司)。

1.3 方法

1.3.1造模及分組

本實驗通過西南醫科大學實驗動物倫理委員會批準(20220120-003)。采用隨機數字表法將48只SD大鼠隨機分成假手術組(SO組)、SAP組和柴黃清胰活血顆粒治療組(CH組),每組16只。造模前大鼠禁食12 h,不禁飲。SAP組和CH組分別在十二指腸逆行胰膽管內注入3.5%的牛磺酸膽酸鈉[10]構建SAP大鼠模型。前期實驗證實柴黃清胰活血顆粒的作用呈劑量依賴性,0.2 g/100 g劑量療效最佳[11]。CH組采用柴黃清胰活血顆粒(0.2 g/100 g,生理鹽水1 mL/0.2 g稀釋)灌胃,SO組和SAP組采用生理鹽水(1 mL/100 g)灌胃。各組均每4小時灌胃1次,12、24 h分批處死大鼠,死前4 h停止灌胃。除生理鹽水及藥物灌胃外,所有大鼠持續禁食,但不禁飲。

1.3.2蘇木素-伊紅(HE)染色

胰腺組織用10%多聚甲醛浸泡24 h后,全自動脫水儀進行脫水,石蠟包埋切片,HE染色,顯微鏡下觀察并拍照,參照文獻[12]的評分標準進行病理學評價。

1.3.3Western blot檢測大鼠胰腺組織細胞自噬通量相關蛋白表達水平

一抗濃度:LC3 (1∶1 000)、Beclin-1 (1∶500)、p62 (1∶1 000)、LAMP2(1∶1 000),以β-actin(1∶1 000)為內參,按照Western blot檢測步驟進行實驗,采用Image J軟件對Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62(Insoluble、Soluble)、LAMP2和β-actin的表達條帶進行了灰度值檢測,結果以目的蛋白/內參的比值表示,統計并繪制成柱形圖。

1.3.4免疫熒光雙染色法檢測細胞自噬情況

采用免疫熒光雙染色法處理胰腺組織,LC3兔多克隆一抗及Insulin兔多克隆一抗稀釋比為1∶500,羊抗兔熒光二抗稀釋比為 1∶900,激光共聚焦顯微鏡下拍照,Imag J軟件分析免疫熒光強度及共定位情況。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠胰腺組織病理學評分比較

12、24 h時SO組胰腺組織病理學評分分別為(0.125±0.354) 分、(0.125±0.354)分,SAP組分別為(9.625±1.061)分、(10.250±0.886)分,CH組分別為(8.250±0.707) 分、(7.125±0.835)分。不同時間點SAP組和CH組病理學評分均高于SO組,SAP組高于CH組,差異有統計學意義(P<0.05),見圖1。

2.2 各組大鼠胰腺組織細胞自噬通量相關蛋白表達水平比較

12、24 h時SO組大鼠胰腺組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、LAMP2、p62(Insoluble)相對表達水平均低于SAP組和CH組,p62(Soluble)相對表達水平均高于SAP組和CH組,差異有統計學意義(P<0.05)。12、24 h時SAP組大鼠胰腺組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、LAMP2、p62(Insoluble)相對表達水平明顯高于CH組,24 h時SAP組Beclin-1相對表達水平高于CH組,差異有統計學意義(P<0.05)。SAP組12、24 h時p62(Soluble)相對表達水平及12 h時Beclin-1相對表達水平與CH組比較無差異(P>0.05),見圖2。

2.3 各組大鼠胰腺組織LC3表達水平及與Insulin共定位情況

12、24 h時SO組大鼠胰腺組織LC3免疫熒光強度分別為(30.18±4.67)、(49.74±9.44),LC3主要表達于胰腺腺泡細胞;SAP組免疫熒光強度分別為(85.90±14.57)、(102.80±18.71),LC3主要分布于胰腺腺泡細胞,少量分布于胰島細胞;CH組免疫熒光強度分別為(68.42±12.18)、(74.61±9.23),LC3主要分布于胰腺腺泡細胞,極少量分布于胰島細胞。SAP、CH組LC3陽性表達率明顯高于SO組(P<0.05),CH組明顯低于SAP組(P<0.05),見圖3～6。12、24 h時SAP組LC3和Insulin在胰島細胞的細胞質區域、分泌顆粒區域中均有分布,SO組、CH組LC3及Insulin未見明顯共定位,見圖7、8。

圖3 各組大鼠胰腺組織免疫熒光雙染圖(100×)

圖4 各組大鼠12 h免疫熒光雙染LC3表達情況(100×)

圖5 各組大鼠24 h免疫熒光雙染LC3表達情況(100×)

a:P<0.05。

圖7 各組大鼠胰島細胞團LC3、Insulin截面分布(400×)

3 討 論

SAP是由于胰酶異常活化導致胰腺充血水腫壞死,常合并多器官功能障礙和全身炎癥性反應綜合征的臨床急危重癥。中醫學理論認為,SAP主要病機是濕熱壅滯、血瘀互結、氣滯痰凝,治療當以通腑泄熱,化濕解毒,散淤止痛為法。柴黃清胰活血顆粒是遵從上述治則,長期廣泛運用于臨床且療效確切的院內制劑。方中生大黃、柴胡共為君藥,以除少陽陽明之邪;黃芩、桅子、延胡索、赤芍、丹參、桃仁共為臣藥,行氣止痛,清熱涼血活血,入營入血,透邪于外;枳實、厚樸、黃芪、白芍共為佐使,通腑泄熱,補氣升陽,斂陰養血,柔肝止痛;諸藥合用,共奏通腑泄熱、清熱解毒、行氣止痛、活血化瘀之功效。

本研究采用牛磺膽酸鈉建立SAP模型,SAP組、CH組胰腺組織HE染色及病理學評分達到診斷標準,提示造模成功。予以柴黃清胰活血顆粒干預后,胰腺組織壞死面積及病理學評分明顯降低,從組織學水平上證實了柴黃清胰活血顆粒對SAP有確切的改善作用。

目前SAP發病機制仍主要集中在胰酶的異常激活,早期SAP病理學改變以腺泡細胞受損為主。研究證實,腺泡細胞的損傷、胰酶酶原異常激活均與自噬損傷密切相關[13-14]。GRASSO等[15]的研究表明,在胰腺炎早期,自噬可以選擇性地吞噬胰蛋白酶,從而保護胰腺細胞。隨著病程發展,自噬小體生成速率與溶酶體降解率之間失衡導致自噬通量降低。TANG等[16]證明miR-20b-5p可通過靶向作用AKT3調節自噬來改善SAP,隨后抑制炎癥和凋亡,促進血管生成。CHOI等[17]研究闡明了番茄紅素可以抑制胰腺腺泡細胞自噬損傷,從而減輕AP的炎癥反應。自噬損傷可能出現在自噬過程中的任何環節,其中包含了自噬小體形成的異常、自噬小體和溶酶體的融合受到阻礙、溶酶體的降解功能障礙等。

評價自噬受損的重要指標就是自噬通量,又稱自噬流。自噬通量是指細胞內自噬過程的速率或強度,可以通過以下指標來描述:(1)LC3 包括LC3-Ⅰ與LC3-Ⅱ,LC3-Ⅱ被募集到自噬小體膜上,修飾后的LC3-Ⅱ只存在于自噬小體上,待自噬小體與溶酶體融合后,LC3-Ⅱ被溶酶體水解酶降解。因此,LC3-Ⅱ增多反映了自噬小體的形成增多,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ反映了自噬的活躍度。(2)p62 是一個與LC3相互作用的蛋白,p62分為Soluble和Insoluble[18],當細胞出現自噬現象的時候,自噬小體所攜帶的底物會穿過細胞骨架的微管系統,而p62(Soluble)會將自噬小體所攜帶的底物通過泛素化蛋白Ubiquitin修飾,然后與LC3-Ⅱ一起轉運到溶酶體中進行分解[19],故而p62(Soluble) 可作為自噬小體的標記蛋白[20]。但當細胞損傷時內源性的p62 也可能出現不可溶性聚集體(Triton X-100),導致自噬流受阻,因此p62(Insoluble) 能側面反映自噬底物降解水平。(3)Beclin-1 與Ⅲ型磷酸肌醇-3激酶(Vps34)發生相互作用,在細胞自噬的關鍵環節自噬小體的產生中發揮了重要作用。研究發現,Beclin-1-Vps34復合物激酶活化可以提高磷脂酰肌醇3-磷酸的生成,進而提高脂質膜延伸、底物招募及參與自噬隔離膜的構建,加快自噬小體的成熟[21],因此Beclin-1是激活自噬的重要蛋白。(4)LAMP 與溶酶體功能密切相關,溶酶體降解率受體內酸性水解酶Cathepsins B的影響,LAMP和Cathepsins B可協同作用于溶酶體的降解,可以顯示溶酶體功能的變化[19]。在LAMP2缺陷小鼠中,溶酶體-自噬功能障礙可導致自發性胰腺炎[22]。因此,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、LAMP2、p62(Soluble、Insoluble)表達水平可系統評價自噬流通暢度,較好地反映自噬-溶酶體系統運行情況。

本研究結果表明,SAP組、CH組大鼠胰腺組織Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、LAMP2、p62(Insoluble)相對表達水平及LC3免疫熒光強度均明顯高于SO組,提示SAP組及CH組自噬活性明顯增強,且存在異常自噬,這可能是導致胰腺組織出現壞死的重要原因之一。與SAP組比較,CH組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、LAMP2、p62(Insoluble)相對表達水平降低,LC3免熒光強度降低,周邊胰腺腺泡細胞及胰島細胞LC3占比減少,提示CH組自噬溶酶體清除功能初步恢復,自噬通量部分恢復通暢。通過共定位分析發現LC3和Insulin在胰島細胞團中的空間位置上存在重疊和相關性,表明它們可能在胰島細胞中具有一定的功能聯系,但還需要進行更多的實驗和研究來進一步探索它們之間的相互作用機制和生物學功能關系。

綜上所述,柴黃清胰活血顆粒可通過抑制SAP中異常活躍自噬,提高自噬通量,從而對胰腺細胞起到一定的保護作用,為進一步挖掘傳統中醫藥治療SAP的價值提供依據。