β-磷酸三鈣復合改良型富血小板纖維蛋白對兔成骨細胞增殖與分化的影響*

高 也,蘆 帥,孫 勇

(1.西南醫科大學口腔醫學院,四川瀘州 646000;2.蒲江縣人民醫院口腔科,成都 611630;3.西部戰區總醫院口腔科,成都 610083)

β-磷酸三鈣(β-tricalcium phosphate,β-TCP)屬于陶瓷磷酸鈣類人工骨材料,具有良好的骨傳導性能和生物降解性能,還具有一定的骨誘導性[1-3]。改良型富血小板纖維蛋白(advanced platelet-rich fibrin,A-PRF)來源于自體血液,包含較多白細胞、骨祖細胞、血小板和細胞因子,具有良好的骨誘導性[4],能有效促進軟硬組織的創傷愈合和修復重建[5-6],并通過促進血管形成來刺激骨缺損愈合[7-8]。上述兩種材料聯合應用,不僅可以彌補傳統骨支架材料骨誘導性能欠佳的問題,而且在滿足骨替代材料支架作用的同時,可以增加材料的骨誘導和成骨性能;此外,還可以避免異體骨和異種骨導致的疾病傳播和倫理風險,有望成為理想的骨移植材料。本研究旨在探討β-TCP和A-PRF復合材料對成骨細胞的影響,為后期研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

健康成年雄性新西蘭大白兔6只,3月齡,體重(2 500±500)g,清潔級;新西蘭乳兔同胎4只,出生24 h內,體重20～25 g,清潔級,均購于成都達碩生物科技有限公司。實驗操作遵循《關于善待動物的指導性意見》。

1.1.2主要儀器與試劑

β-TCP(上海貝奧路生物材料有限公司),A-PRF工具盒(法國Nice公司),A-PRF真空塑料管(德國Greiner bio-one公司),細胞計數試劑盒8(CCK-8,日本株式會社同仁化學研究所),兔Ⅰ型膠原蛋白(collagen-Ⅰ,Col-Ⅰ)、兔堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、兔骨鈣素(osteocalcin,OCN)ELISA試劑盒(上海橋杜生物科技有限公司),茜素紅染劑(北京索萊寶科技有限公司);掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司),電子分析天平(德國Sartorius公司),倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司),酶聯免疫檢測儀(美國Themor公司),低速離心機(美國Beckman Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1兔成骨細胞的制取

取新西蘭乳兔(出生<24 h)4只,頸椎脫臼法快速處死后,浸泡于75%乙醇內10 min,移至無菌培養皿內,于無菌操作臺分離取出兔顱頂骨,采用組織塊貼壁培養法聯合改良二次酶消化法[9]的復合培養方法培養,經傳代培養取對數生長期的第3代細胞(P3)備用。

1.2.2β-TCP的預備

將包裝完整的無菌β-TCP顆粒(直徑<0.1 mm)和β-TCP圓片(直徑6 mm,高度2 mm)去包裝后,分別緩慢浸沒于完全培養基中,輕柔震蕩,進行濕潤處理,24 h后取出,見材料完全浸沒并沉淀于培養皿底部。移液管輕輕吸取多余培養基,加入磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次后,最后一次吸干液體,收集剩余濕潤β-TCP材料,備用。

1.2.3兔A-PRF的制備

取成年雄性新西蘭大白兔6只,稱重后固定制動,聚維酮碘消毒,使用A-PRF專用離心管Vacuette(A-PRF不抗凝真空玻璃涂層塑料管)快速采集兔耳中央動脈血4管,每管約10 mL。迅速將A-PRF離心管放入離心機內,配平后2 000 r/min離心24 min,取出室溫下靜置5 min。棄上清液,輕柔剝離下部紅細胞層后,獲得中間A-PRF凝膠層,并于A-PRF專用工具盒內壓制成約1.0 mm厚的膜,制備成大小約1.0 mm×1.0 mm的碎屑,備用。另將A-PRF壓制成約2 mm厚的膜,并修剪為直徑約6 mm的膜片,備用。

1.2.4材料復合

將上述完成制備的β-TCP顆粒/圓片和兔A-PRF碎屑以1∶1的質量比進行混合[10],備用。

1.2.5實驗分組

實驗分為4組,包括無材料對照組(空白組)和3個實驗組。實驗組分別為β-TCP組(β-TCP顆粒/圓片)、A-PRF組(A-PRF碎屑/膜片)及復合組(β-TCP顆粒/圓片+A-PRF碎屑),將預先制備的材料移至孔板內,要求3個實驗組材料重量一致。每組設置3個副孔,依次加入P3細胞,共培養。

1.2.6掃描電鏡觀察細胞形態和黏附

取濕潤β-TCP圓片和A-PRF膜片,分別行掃描電鏡檢測,以觀察β-TCP和A-PRF樣品的表面形貌及納微結構特征。分別在各實驗組材料與細胞共培養第1、3、5天同一時間點取出培養板中β-TCP圓片和A-PRF膜片,進行掃描電鏡檢測。操作時注意正反面,貼近培養板底部為反面,遠離培養板底部為正面,正面為檢測面。

1.2.7CCK-8檢測細胞增殖

取24孔板,按照上述實驗分組將各實驗組材料均勻覆蓋于孔板底部,材料與細胞共培養(空白組不放置任何材料,純細胞培養),第1、3、5、7、9、14天分別取上清液加入CCK-8試劑檢測細胞增殖情況,測得450 nm處吸光度[A(450)]值。實驗重復3次。

1.2.8ELISA檢測成骨相關蛋白分泌

同1.2.7材料與細胞共培養(空白組不放置任何材料,純細胞培養),采用ELISA試劑盒于第2、4、8天分別檢測各組細胞Col-Ⅰ、ALP的分泌量,第12、14、16、18天檢測各組細胞OCN的分泌量。實驗重復3次。

1.2.9茜素紅染色及礦化結節定量分析

取24孔板,預先在孔板內放置無菌玻片,同1.2.7材料與細胞共培養(空白組不放置任何材料,純細胞培養),每組3個副孔,同時4組分別加設空白材料對照(即不接種任何細胞),消除材料導致的干擾因素。材料與細胞共培養,第4周時鏡下各組均見無定形物質形成,即礦化結節,取出玻片經茜素紅染色后,各組礦化結節呈形態不一的橘紅色結節狀。采用10%十六烷基氯化吡啶溶解著色礦化結節染料,測得570 nm處吸光度[A(570)]值,定量分析礦化結節生成情況。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 掃描電鏡觀察細胞形態和黏附

β-TCP和實驗制得A-PRF樣品的表面形貌及納微結構特征見圖1。A-PRF圓片、β-TCP圓片及復合物(β-TCP圓片和A-PRF碎屑復合)分別與成骨細胞共培養24 h后,掃描電鏡檢測可見少量細胞在材料表面及孔隙中黏附,伸出多個長短不一的包漿突起緊緊黏附在材料表面及孔隙內,細胞形態為不規則多邊形;培養第3天時,細胞形態變大,細胞繼續伸展,伸出更多偽足并相互連接,與材料黏附更加緊密;培養第5天,細胞數目繼續擴增,細胞邊緣伸出較多突起、偽足,并向四周伸展與相鄰細胞間突起偽足相互連接,融合成片,橫跨材料孔隙,細胞及細胞分泌的細胞外基質覆蓋材料表面。4組觀察結果顯示,兔成骨細胞在β-TCP與A-PRF材料表面及多孔β-TCP內部孔隙內黏附、生長、增殖,形態多樣。隨時間延長,材料上細胞數量增加,并大量分泌細胞外基質,細胞與基質逐漸融合成片狀,覆蓋支架材料表面。單位觀察視野內復合組與A-PRF組細胞數目較多,其中復合組增殖最明顯,β-TCP組細胞數目相對較少,見圖2。

A:A-PRF;B:β-TCP。

2.2 CCK-8檢測細胞增殖

細胞增殖曲線圖顯示:除β-TCP組,其余3組細胞培養第1～5天,細胞數量呈對數增長;培養第5天開始,細胞增殖速度略微減慢;培養第10天后生長逐漸進入平臺期。β-TCP組在培養的前5天,細胞增殖稍受抑制,培養5 d后進入快速增殖期,見圖3A。統計分析結果顯示:同一時間點復合組和A-PRF組細胞數量明顯高于β-TCP組(P<0.05),且復合組最高,見圖3B。

2.3 ELISA檢測成骨相關蛋白分泌量

各組成骨細胞內Col-Ⅰ、ALP、OCN分泌量隨著培養時間延長而逐漸增多。統計分析結果顯示:各組成骨細胞同一時間點Col-Ⅰ、ALP、OCN分泌量β-TCP組最高,復合組和A-PRF組次之,空白組最低(P<0.05),見圖4。

A:Col-Ⅰ分泌量的統計分析柱狀圖;B:ALP分泌量的統計分析柱狀圖;C:OCN分泌量的統計分析柱狀圖;a:P<0.05,與空白組比較;b:P<0.05。

2.4 茜素紅染色

材料與細胞共培養4周后,鏡下各組均見無定形物質形成,即礦化結節,經茜素紅染色后,各組礦化結節呈形態不一的橘紅色結節狀,復合組生成結節最多,β-TCP組和A-PRF組次之,空白組最少(P<0.05),見圖5。

A:茜素紅染色后肉眼觀(左上順時針依次為空白組、A-PRF組、β-TCP組和復合組);B:茜素紅染色鏡下觀(40×,左上順時針依次為空白組、A-PRF組、β-TCP組和復合組);C:礦化結節的統計分析柱狀圖;a:P<0.05,與空白組比較;b:P<0.05。

3 討 論

骨移植材料在臨床上用以恢復骨缺損空間,促進缺損區恢復良好的骨量和較高的骨密度。理想的骨移植材料應具備以下4個重要性質:生物相容性、良好的機械性能、生物可吸收性和三維高孔隙率結構[11]。β-TCP屬于目前研究較多的人工骨替代材料,具有良好的骨引導作用和一定的骨誘導性能。但是由于β-TCP降解速度過快,與成骨速度不相匹配,常常需要與其他材料相結合,本實驗中β-TCP與自體來源、新鮮制備的A-PRF材料復合,不存在任何疾病傳播、免疫原性和致畸致癌風險,復合后用骨水泥的方式進行骨缺損注射填充,引導和誘導骨組織再生,是一種安全有效的骨缺損再生方法。

骨移植材料的作用本質為刺激周圍骨相關細胞在材料表面定植增殖和分化成骨,移植材料的化學成分、晶體結構和表面形態是調節細胞黏附生長、增殖分化、鈣鹽沉積和新骨形成的關鍵[12-13]。磷酸鈣材料在接觸培養溶液后釋放出鈣離子,使得材料表面帶有正電的Zeta電勢增加[14-15],吸引帶負電荷的纖維連接蛋白(fibronectin,FN)結合,進而促進整合素附著[16-17]。整合素是一種跨膜受體,能與特定的細胞基質蛋白組分,如Ⅰ型膠原蛋白和FN等結合形成細胞黏附位點,從而介導細胞黏附[18],增加材料表面對成骨的增殖和分化作用[19-20]。除了磷酸鈣材料表面蛋白吸附作用,材料周圍滲透壓和pH值的變化也是影響細胞生物特性的重要因素。細胞培養環境在一定范圍內適當堿化,能促進體外細胞黏附和生長,增強成骨細胞分化和成骨功能[21]。然而,隨著材料溶解增加,培養環境中滲透壓和pH值過高時,細胞運動明顯減少,甚至產生完全不可逆的運動抑制,從而導致細胞凋亡[22]。而A-PRF來自身血液,對成骨細胞具有較好的親和性,培養過程中緩慢釋放生長因子、細胞因子等成分[23],具有誘導成骨細胞、促進成骨細胞的趨化和增強有絲分裂的作用,進而促進骨細胞的增殖和合成活性,調節骨折愈合和缺損重塑[24]。

本實驗中,成骨細胞分別與β-TCP、A-PRF及二者的復合材料進行共培養,在細胞共培養早期主要由整合素介導進行細胞黏附,特異性基質蛋白成分主要來源于培養基,β-TCP的Zeta電位作用與A-PRF的蛋白親和性使得各組之間蛋白定植情況基本相似[25],細胞的黏附也無明顯差異,細胞形態符合正常成骨細胞形態結構,細胞生物相容性良好。

隨著培養時間延長,因β-TCP材料析出鈣磷離子增加,材料周圍滲透壓和pH值升高,細胞培養環境的適當堿化能一定程度上促進體外細胞黏附和生長,增強成骨細胞分化和成骨功能。然而,當β-TCP材料繼續溶解時,過多的溶解產物會導致培養環境滲透壓和pH值進一步增加,當培養環境中滲透壓和pH值過高時,細胞不能適應這種培養條件,細胞運動和增殖明顯減少;而A-PRF能持續釋放生長因子等活性成分,促進糖酵解和細胞增殖[26],因此A-PRF組細胞增殖呈現穩步快速上升,且見細胞外基質的形成和堆積。復合組各含一半質量的β-TCP和A-PRF,結合兩種材料的優勢,避免高滲透壓和pH值,細胞增殖效應大于單一材料組,因此觀察到成骨細胞的快速增殖且分泌功能旺盛。此外,隨著培養時間延長,培養基的更換,滲透壓升高抑制鈣離子析出,成骨細胞釋放酸性代謝物質,培養基的滲透壓和pH值得到改善,因此觀察到β-TCP組在經歷培養初期細胞生長增殖抑制后,開始快速增殖,但是相對于其他3個組,β-TCP組細胞增殖仍然較慢。在整個增殖過程中,復合組細胞增殖最明顯,A-PRF組次之,這與細胞黏附實驗結果一致。

β-TCP材料具有較粗糙的多孔材料表面,鈣離子的析出使得培養基適當堿化,可促進細胞糖酵解,促進膠原蛋白合成,ALP活性增加,也可促進后期鈣沉積和礦化結節生成[15]。A-PRF內存在的生長因子對成骨細胞的增殖分化作用并不是單一促進作用,具有雙向多效性,能促進ALP等蛋白分泌,也可抑制成骨細胞終末分化,即礦化結節的形成[6]。但A-PRF的生長因子釋放主要集中在細胞培養前10 d,而鈣結節的沉積主要在細胞培養3周后[8],所以其最終對鈣結節沉積沒有明顯的抑制作用。復合培養組中β-TCP含量減少,相關蛋白分泌稍有減弱,但由于加入了A-PRF,在細胞培養后期降解產物酸化培養基時可促進β-TCP的鈣離子釋放,從而促進鈣沉積和礦化結節形成。

綜上所述,β-TCP聯合A-PRF材料復合組綜合了兩種材料的優勢,能有效促進兔成骨細胞的增殖、成骨相關蛋白及礦化結節的形成,有望成為一種良好的骨替代材料。