超聲評價大鼠宮腔粘連模型的可行性研究*

蔡瑤瑤,蔡麗君,夏維婷

(溫州醫科大學附屬第一醫院:1.產科;2.生殖中心;3.婦科,浙江溫州 325000)

宮腔粘連(intrauterine adhesion,IUA)是指各種因素導致子宮內膜基底層受到損傷,引起宮腔部分或全部堵塞所致的一系列綜合征,主要由醫源性宮腔操作引起,臨床上主要表現為育齡期女性出現閉經、下腹痛、繼發不孕、反復流產、生育能力降低等,其所致的并發癥嚴重威脅女性生殖健康,且目前尚無有效及統一的治療方法[1-3]。由此,深入研究宮腔粘連的病因及內膜修復機制,探索可能的干預措施具有重大意義。目前相關研究主要集中于動物實驗,而在動物實驗過程中,動物模型評價方法十分有限,本文通過對比傳統大鼠形態學檢查及超聲檢查評價宮腔粘連模型,探討超聲檢查評價大鼠宮腔粘連模型的可行性及優勢。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

SD雌性大鼠16只,體重230～250 g;雄性大鼠4只,體重250～280 g。所有實驗動物由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供,實驗大鼠飼養于溫州醫科大學動物實驗中心無特殊病原體(SPF)屏障環境中,實驗動物使用許可證號為SYXK(浙)2015-0009。實驗前適應性飼養1周,保障動物自由飲水和攝食。

1.1.2主要儀器與試劑

蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);Masson染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);Olympus43光學顯微鏡(日本Olympus公司);RM2245輪轉切片機(德國萊卡公司);DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司);GE Voluson E8彩色多普勒超聲診斷儀(美國GE公司),探頭頻率1.5～9.8 MHz。

1.2 方法

1.2.1造模方法

采用機械法損傷大鼠單側子宮腔內膜建立宮腔粘連模型(模型側/模型組),對側子宮作為對照側(對照組)。每天觀察大鼠陰道涂片,處于動情間期的雌鼠用于模型構建。1%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉大鼠后,下腹部消毒,于尿道上端1 cm處切開皮膚進入腹腔,暴露子宮,Y型子宮分叉處切口,利用刮勺刮除子宮內膜造成病理性子宮內膜損傷。其中8只大鼠用于進行形態學分析,其余8只大鼠用于功能學評價。相關動物實驗操作經由倫理委員會批準(倫理號wydw2016-0213)。

1.2.2病理學評價

8只雌性大鼠處死后取子宮組織,多聚甲醛固定標本24 h后乙醇梯度脫水,行石蠟包埋,5 μm厚度連續切片,行HE和Masson染色,在高倍顯微鏡下選取視野,每張切片3個視野。HE染色切片行子宮內膜腺體計數,Masson染色后計算各側子宮內膜纖維化的面積比,根據上述2個參數進行子宮內膜纖維化半定量評分[4]。

1.2.3生殖能力評估

另8只雌性大鼠術后2周開始以2∶1的比例與雄鼠合籠,以見交配栓當天為妊娠第0.5天,妊娠第17.5天開腹計數子宮內胚胎數目。

1.2.4超聲檢查

(1)大鼠內膜情況判斷:子宮內膜線模糊、局部內膜線連續性差、回聲中斷等表現提示內膜異常,判斷為宮腔粘連陽性;而宮腔內膜線完整、連續、光滑則提示內膜正常,判斷為宮腔粘連陰性。(2)合籠后妊娠第17.5天超聲下動態觀察并計數每側大鼠子宮胎鼠數目。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 大鼠子宮超聲檢查結果分析

建模后2周行常規超聲檢查(圖1),可見造模側子宮內膜線模糊、局部內膜線連續性差、回聲中斷等表現(圖2B、C),而對照側大鼠宮腔內膜線均完整、連續、光滑(圖2A)。

圖1 大鼠建模后2周行常規超聲檢查

A:大鼠對照側子宮超聲(箭頭所示:子宮內膜線光滑連續);B:大鼠模型側子宮超聲(箭頭所示:子宮內膜局部連續性差,回聲中斷);C:大鼠模型側子宮超聲(箭頭所示:子宮局部內膜線消失);D:大鼠髂骨位置(箭頭處);E:大鼠宮頸處(箭頭處);F:大鼠宮頸上方分為兩側宮角處(箭頭處)。

2.2 大鼠子宮病理學檢查結果分析

通過組織病理學觀察發現:與對照側比較,模型側子宮內膜腺體數目明顯減少,纖維化面積比例增加(圖3);模型側子宮內膜纖維化半定量評分為(5.50±2.12)分,對照側為0分,差異有統計學意義(P<0.01)。

A、B:分別為大鼠對照側及模型側子宮內膜HE染色;C、D:分別為大鼠對照側及模型側子宮內膜Masson染色。

2.3 大鼠子宮超聲與病理檢查結果對比分析

妊娠第17.5天超聲與開腹計數兩組子宮胚胎數目,模型側均明顯少于對照側(P<0.05);而同組兩種方法計數結果均無明顯差異(P>0.05),見表1、圖4。模型組超聲檢查宮腔粘連陽性率為75.0%(6/8),對照組為0,差異有統計學意義(P<0.05);點二系列相關分析顯示,超聲檢查宮腔粘連陽性率與大鼠子宮內膜纖維化半定量評分呈正相關(r=0.927,P<0.01)。

表1 超聲與開腹計數胚胎數目比較

A、B:大鼠妊娠第17.5天剖腹探查所見(箭頭所示:模型側宮角妊娠情況);C、D:分別為大鼠妊娠第17.5天超聲所見對照側及模型側宮角妊娠情況(箭頭所示:胚胎)。

3 討 論

宮腔粘連是婦科常見病之一,我國由于人工流產數逐年增加,宮腔粘連發生率較高[5]。宮腔鏡是目前診斷和治療宮腔粘連的主要方法,但中、重度宮腔粘連術后再粘連發生率較高,治療困難,影響育齡期婦女生殖及身心健康[6]。雖然宮腔粘連病因學研究不斷深入,但其發生機制至今未完全闡明。由于臨床宮腔粘連患者病理標本取材困難,大大限制了宮腔粘連的治療研究進展,因此建立穩定可靠的動物模型是研究宮腔粘連發生機制、預防和治療方法的關鍵[7]。目前,宮腔粘連的建模方法主要有機械損傷、化學損傷和電燒傷等[8]。大鼠宮腔粘連模型因與臨床子宮內膜損傷及宮腔粘連病理狀況相似,被廣泛用于研究[9-10]。目前宮腔粘連動物模型的評價主要通過處死動物后的組織病理形態[8,11-12],表現為子宮內膜組織萎縮,腺體減少且大多無活性,內膜纖維化程度增加,宮腔纖維組織黏稠,血管堵塞造成粘連部位缺血等[13-14]。該評價方法無法后續觀察活體動物模型的病灶動態變化,限制了宮腔粘連在生殖醫學領域的深入研究。超聲檢查以無創、方便和可反復進行的優點在動物實驗中逐漸得到廣泛應用[15-17],但目前較少有文獻報道將超聲評價應用于宮腔粘連相關的動物研究中,本研究通過對比傳統大鼠形態學檢查及超聲檢查結果,探討超聲檢查評價大鼠宮腔粘連模型的可行性。

檢測病理組織的腺體數量和纖維化程度是目前大多數研究評價宮腔粘連動物模型的主要標準。陳醒等[8]通過子宮內膜刮除法建立大鼠宮腔粘連模型,發現模型組子宮內膜腺體數量較對照組減少,纖維化面積增加。徐倩等[4]利用兩種機械損傷法分別建立宮腔粘連模型,同樣通過上述病理學評價模型的有效性。張璐等[18]則在上述評價指標的基礎上,增加了細胞角蛋白-19(CK-19)和波形蛋白(vimentin)免疫組織化學評價。韓華等[19]通過注射95%乙醇溶液建立宮腔粘連大鼠模型,發現子宮內膜胞飲突的形成和整合素β3表達均受到明顯抑制。還有學者聯合運用多種發病機制建立宮腔粘連模型,常使用的方法有機械損傷聯合不同感染,其穩定性及成模率較單一機制形成的模型更佳[20-21]。總而言之,目前大部分對于宮腔粘連動物模型的評價都是依賴于病理學檢查。

超聲在動物實驗中應用較為廣泛,較為常見的有心臟超聲無創評價心功能[22-23],以及對于肝臟、腦血管等的評價[24-25],而關于小動物子宮疾病的研究應用較少。李秀梅等[26]發現超聲測量大鼠子宮體厚度可作為判斷大鼠子宮腺肌病建模是否成功的無創手段。在臨床上超聲檢查已被廣泛用于宮腔粘連的診斷[27],宮腔粘連患者超聲影像通常表現為宮腔線模糊,局部連續性不佳,內膜回聲中斷,局部“三線征”消失,內膜與肌層分界不清,局部毛糙;三維超聲顯示局部呈低回聲或者缺損[28]。本研究中宮腔粘連大鼠的子宮超聲形態表現與上述表現相似,且超聲檢查宮腔粘連陽性率與大鼠子宮內膜纖維化半定量評分呈正相關性,表明超聲檢查能較好地對模型大鼠進行判斷。此外,本研究運用超聲計數孕晚期妊娠大鼠的胚胎數目,并與開腹計數胚胎數目進行比較,結果顯示二者無明顯差異,提示超聲檢查能較為準確地計數胎鼠數目,對宮腔粘連模型進行生育力評價。

綜上所述,本研究結果提示超聲檢查可通過形態學評價及生殖功能評價兩方面全面評價宮腔粘連大鼠模型,能對活體動物模型進行較為準確的評價,避免了處死動物才能評價模型的局限性,這對于采用宮腔粘連動物實驗進行的基礎研究具有重要意義。