多重核酸檢測(cè)系統(tǒng)同時(shí)檢測(cè)22種呼吸道病原體的應(yīng)用效果研究*

徐 亮,邱燦林,徐子強(qiáng),鄧俊興,豐建國(guó),曾 鑫,王衍芬

(韶關(guān)市疾病預(yù)防控制中心,廣東 韶關(guān) 512000)

急性呼吸道感染是嬰幼兒的常見(jiàn)和多發(fā)病,發(fā)病率高,給嬰幼兒造成不同程度的健康威脅。國(guó)內(nèi)外研究顯示,病毒感染是急性呼吸道感染的主要致病源之一[1-4]。因此,研究韶關(guān)市不同年齡兒童在不同季節(jié)常見(jiàn)呼吸道病毒病原及其流行病學(xué)特點(diǎn),將有助于提高兒童急性呼吸道感染病毒病原監(jiān)測(cè)能力,對(duì)診斷和預(yù)防起到關(guān)鍵作用。本研究選取3個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn),對(duì)韶關(guān)市兒童急性呼吸道病毒感染情況進(jìn)行分析,結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 2020年8月至2021年7月從粵北人民醫(yī)院采集符合病例定義的886份患兒咽拭子,同時(shí)收集姓名、年齡、發(fā)病日期、采樣日期及臨床癥狀等信息。病例定義及標(biāo)本采集詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[5]。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 于2020年8月至2021年7月對(duì)符合病例定義的886例患兒進(jìn)行采樣,采集發(fā)病時(shí)間在1～3 d內(nèi)的咽拭子,放置于病毒保存液中,0～4 ℃低溫保存,盡快送往實(shí)驗(yàn)室,提取核酸后置于-80 ℃下備用。

1.2.2儀器及試劑 ABI7500PCR擴(kuò)增儀,Auto-Pure32A全自動(dòng)核酸提取儀(杭州奧盛儀器有限公司),核酸提取試劑盒(磁珠法,中元匯吉),實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)試劑盒AgPath-IDTM One-Step RT-PCR Kit(美國(guó)AB公司),各型病毒的引物和探針由日本TaKaRa公司合成。多病原檢測(cè)采用HOPE ONE檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3核酸提取及熒光定量PCR 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書,提取病毒總核酸,然后對(duì)提取的核酸在同一反應(yīng)條件下同時(shí)進(jìn)行9種病原體的擴(kuò)增,每種病原體為1個(gè)反應(yīng)孔。反應(yīng)條件:50 ℃ 30 min;95 ℃ 15 min;95 ℃ 15 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,5個(gè)循環(huán);95 ℃ 15 s,55 ℃ 60 s,40個(gè)循環(huán);55 ℃收集熒光信號(hào)。實(shí)驗(yàn)中使用核糖核蛋白(RNP)為內(nèi)對(duì)照。采用多重核酸檢測(cè)系統(tǒng)同時(shí)定性檢測(cè)22種呼吸道病原體,包括16種RNA病毒、2種DNA病毒及4種細(xì)菌:甲型流感病毒、乙型流感病毒,甲型流感病毒H1N1、呼吸道合胞病毒A型和B型、副流感病毒-1/-2/-3/-4、冠狀病毒OC43/229E/HKU1/NL63、肺炎衣原體、肺炎支原體、嗜肺軍團(tuán)桿菌、百日咳鮑特菌、鼻病毒、腸病毒、人偏肺病毒、腺病毒和博卡病毒。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Excel2003進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總處理,應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)數(shù)資料以率表示,采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1呼吸道病毒檢出情況 一共檢測(cè)886份標(biāo)本,陽(yáng)性425例,總檢出率為47.97%(425/886)。9種呼吸道病毒均有檢出,其中FluA檢出率最高,為15.46%(137/886),其后依次為HRV、HPIV、FluB、RSV、ADV、MPV、HCoV、HBoV。見(jiàn)表1。

表1 呼吸道病毒病原譜及檢出情況

2.2呼吸道病毒的流行特征

2.2.1不同季節(jié)病毒分布情況 FluA在冬季的檢出率最高;HRV的檢出高峰主要在秋季;HPIV的高峰在春季。春季檢出率最高為FluA、其次為HPIV、FluB和RSV;夏季依次為FluA、HRV、HPIV和FluB;秋季為HRV、HPIV、FluA;冬季以FluA最高,其后為HRV和MPV。見(jiàn)表2。

表2 呼吸道病毒在不同季節(jié)的分布情況[n(%)]

2.2.2不同年齡病毒分布情況 在886例患兒中年齡最小者為1.8個(gè)月,最大者為13歲。各種病毒在不同年齡段檢出率分布見(jiàn)表3。0～<1歲組病毒檢出以FluA、HRV為主;1～<3歲組以HRV、FluA為主;3～<6歲組和≥6歲組都以FluA為主。除ADV和HBoV外及其他病毒在各年齡段檢出率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 呼吸道病毒在不同年齡的分布情況[n(%)]

2.3呼吸道病毒混合感染 在886份標(biāo)本中,同時(shí)檢出2種以上呼吸道病毒混合感染43份,檢出率為4.85%(43/886)。9種呼吸道病毒都存在混合感染的情況,以HRV和其他呼吸道病毒合并感染為主。

3 討 論

呼吸道感染的病毒病原學(xué)因地域、年份、季節(jié)和年齡等的不同而有差異[6]。據(jù)報(bào)道,呼吸道病毒檢出率均超過(guò)20%(21.6%～58.2%),RSV、HPIV、ADV 和Flu是最常見(jiàn)的呼吸道感染病毒病原[7-10]。通過(guò)對(duì)韶關(guān)市886 例急性呼吸道感染患兒咽拭子的病毒病原學(xué)檢測(cè),共檢出9種呼吸道病毒,陽(yáng)性425例,總檢出率為47.97%,FluA是2019年兒童急性呼吸道感染首位病毒病原,其后是HRV和HPIV,3種病毒病原占總檢出數(shù)的65.65%。本研究病例中呼吸道病毒檢出率與何英等[10]報(bào)道深圳市檢出率(48.0%)的結(jié)果一致,略低于韶關(guān)市前幾年的檢出率(51.36%)[11],而高于以往北京(32.0%)、上海(32.09%)等地區(qū)的報(bào)道[12-13]。

兒童急性呼吸道病毒感染全年均可發(fā)病,而且不同季節(jié)病毒主要感染類型也有所不同。本研究發(fā)現(xiàn),2019年不同季節(jié)FluA、HRV、HPIV、FluB、RSV和MPV的檢出率均有差異,其中FluA和MPV的發(fā)病高峰在冬季;HRV的高峰在秋季;而HPIV、FluB和RSV主要集中在春季,ADV、HCoV和HBoV發(fā)病季節(jié)特征不明顯。提示不同季節(jié)的就診患兒應(yīng)有針對(duì)性地關(guān)注不同呼吸道病毒病原體的感染[14-16]。

本研究發(fā)現(xiàn),不同年齡組患兒的呼吸道病毒病原體檢出率存在差異,3～<6歲組患兒9種病毒病原體檢出率最高,0～<1歲組患兒檢出率最低。0～<1、3～<6歲和≥6歲組患兒的FluA檢出率最高,1～<3歲組的HRV檢出率最高,與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道基本相符。3～<6歲組兒童日常主要在托幼機(jī)構(gòu)聚集活動(dòng),近距離飛沫傳染的概率大,伴隨著年齡增長(zhǎng),活動(dòng)能力逐步增強(qiáng),活動(dòng)范圍也不斷擴(kuò)大,從而接觸呼吸道病原體的概率也較高,但是其自身免疫功能還在逐步完善,抵抗力相對(duì)較弱,這與病毒感染有關(guān)。0～<1歲組嬰兒大部分以母乳喂養(yǎng)為主,母乳中的免疫球蛋白含量較高,所以自身對(duì)病原體有一定的抵抗力;且嬰兒接觸外界的概率較低,主要是家庭小范圍活動(dòng),因而接觸病原體的機(jī)會(huì)也相對(duì)較少。

本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)呼吸道病毒病原體的方法得出兒童呼吸道病毒病原分布情況及其流行特點(diǎn),這與韶關(guān)市長(zhǎng)期流行特點(diǎn)是否一致需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究,不同地區(qū)、時(shí)間、溫濕度、氣候條件、病原體的感染及其流行情況存在較大差異。韶關(guān)市急性呼吸道感染患兒病毒檢出率相對(duì)于國(guó)內(nèi)其他地區(qū)而言處在中上位置。究其原因可能是:首先,與兒童自身的生長(zhǎng)發(fā)育特點(diǎn)有關(guān);其次,與韶關(guān)市所處的地理位置、氣候環(huán)境等相關(guān),因此應(yīng)繼續(xù)對(duì)更多可能影響因素進(jìn)行深入研究,這樣才能制定符合韶關(guān)市有效的兒童急性呼吸道感染疾病診斷、治療和防控措施。