InnowaveDX MTB/RIF對結核分枝桿菌復合群及利福平耐藥檢測性能的評估

劉梅 吳霞 古旭 李娜娜 張萬敏 張小可 蘭遠波

對結核病進行早期診斷并開展有效治療,是阻斷結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)傳播,遏制結核病發病和耐藥的重要手段。針對 MTB病原體及其耐藥性檢測,臨床常采用PCR技術,特別是GeneXpert MTB/RIF(簡稱“Xpert”)技術[1]。該種檢測技術能夠快速、高效完成 MTB和利福平耐藥檢測,為世界衛生組織所推薦常規使用[2]。但Xpert對硬件水平要求高、檢測成本高,使其在臨床廣泛應用受到了限制,尤其在結核病發病率較高的發展中國家[3]。InnowaveDX MTB/RIF(簡稱“InnowaveDX”)檢測是一種自動化分子診斷系統,該檢測技術是在實時熒光定量核酸檢測方法的基礎上開展的,采用IS6110和rpoB雙靶基因組合檢測,能夠同時檢測MTB和利福平耐藥性。此外,InnowaveDX檢測適用于不同類型樣本,在縮短了檢測時間的同時,檢測通量可以滿足不同層級實驗室的診斷需求。本研究中,筆者評估了InnowaveDX檢測不同標本中結核分枝桿菌復合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex,MTBC)DNA和利福平耐藥性的效能,現將結果報道如下。

資料和方法

一、研究對象

1.研究對象:采用前瞻性研究方法,連續納入2023年3月1日至6月30日遵義醫科大學附屬醫院具有結核病相關體征/癥狀,或胸部X線檢查結果提示疑似結核病的患者作為研究對象,共107例,排除3例(含涂片和培養結果均不明確2例,InnowaveDX 結果不明確1例),最終納入104例。研究對象中,93例診斷為結核病(包括肺結核88例,泌尿系結核2例,結核性腦膜炎1例,胸椎結核1例,淋巴結結核1例),其中68例經病原學陽性確診,25例病原學陰性經臨床診斷確診;11例臨床診斷為非結核病,其中10例無結核病病史(包括肺部惡性腫瘤2例,慢性阻塞性肺疾病3例,支氣管感染1例,肺部感染、肺炎4例),1例有結核病病史(本次診斷為肺炎)。

2.入組標準:(1)結核病診斷:①病原學診斷:參照《WS 288—2017 肺結核診斷》[4],具有結核病臨床表現,病原學診斷依據。本文中病原學診斷依據涂片顯微鏡檢查和培養結果,即涂片陽性和(或)分枝桿菌培養陽性(經鑒定為 MTBC)。②臨床診斷:無病原學依據,參照《WS 288—2017 肺結核診斷》[4],具有結核病臨床表現、具備結核病影像學表現,排除肺部其他疾病。(2)非結核病:主要指肺炎、肺癌等易混淆疾病,均按相應疾病的診斷標準進行診斷,并經臨床診斷及鑒別診斷最終確診。

3.排除標準:(1)近期接受抗結核治療;(2)最終診斷結果不明確;(3)同一患者的重復樣本;(4)采集樣本量<3 ml。

二、檢測方法

1.標本采集:結核病組采集標本類型包括痰液71份,支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)16份,尿液2份,胸腔積液1份,膿液1份,淋巴穿刺液1份,腦脊液1份。非結核病組采集了痰液8份,BALF 3份。標本送至醫院臨床實驗室進行處理,參照《結核病實驗室檢驗規程》[5]對所有標本同時進行Xpert檢測、InnowaveDX檢測、涂片顯微鏡檢、培養。

2.Xpert檢測:嚴格按照美國Cepheid公司Xpert MTB/RIF說明書操作,前處理管中以1∶2加入標本和樣本處理液,漩渦振蕩10 s,室溫靜置15 min,取1 ml標本充分液化后,加入Cartridge試劑匣,上機檢測。按照說明書進行結果判讀:(1)至少2條探針循環閾值(Ct值)≤38,則表示檢測到MTB;(2)當5條探針的Ct值均≤38,且早期Ct值和晚期Ct值之差<3.5,代表 MTB 檢出同時對利福平敏感;(3)5條探針中有1條或者多條探針陰性,或雖5條探針的Ct值均≤38但早期Ct值和晚期Ct值之差≥3.5,代表標本中的MTB的探針相對應的rpoB基因片段發生突變,即利福平耐藥檢出。對于MTB陽性的樣本,Xpert系統會根據Ct值給出MTB載量,分級包括高(Ct值<16)、中(Ct值為16～22)、低(Ct值為22～28)和極低(Ct值>28)。

3.InnowaveDX檢查:產品為蘇州創瀾生物科技有限公司生產。根據產品說明書進行操作,取1 ml 標本加入前處理管中,并依次向前處理管中加入6 ml含胍鹽的裂解液和150 μl內參,充分混合后超聲處理5 min;將超聲處理后的樣品放入配套的核酸提取儀中進行核酸提取,轉移25 μl的提取產物至反應管A和反應管B中,用熒光定量PCR儀(SLAN-96S全自動醫用PCR分析系統,上海宏石醫療科技有限公司)進行擴增。按照說明書進行結果解讀:(1)IS6110基因 PCR 擴增結果Ct值小于等于說明書規定的 Cutoff值,表明檢測到MTBC的目標DNA,即MTB陽性;反之即MTB陰性;(2)InnowaveDX為MTBC及利福平耐藥基因突變檢測的雙功能試劑,僅在 MTB檢出的情況下,報告利福平耐藥突變檢測結果。當5條位于rpoB基因RRDR區域探針中任意1條探針與位于rpoB基因RRDR區域之外的非突變區域探針的ΔCt值大于等于說明書規定Cutoff值,表明檢測到標本中的MTB利福平耐藥相關的rpoB基因突變,即對利福平產生了耐藥;反之,則表明未檢測到標本中的MTB利福平耐藥相關的rpoB基因突變,即對利福平敏感。不同于Xpert,此方法無MTB菌載量與Ct值之間的相關定義。

4.涂片顯微鏡檢及培養:參照《結核病實驗室檢驗規程》[5]進行涂片萋-尼抗酸桿菌染色顯微鏡檢及固體培養。

三、統計學處理

采用 SPSS 24.0軟件進行數據的統計分析。計數資料以“百分率(%)”描述,組間差異的比較采用χ2檢驗、配對χ2檢驗及Fisher精確概率法,以P<0.05為差異有統計學意義。分析各檢測方法的檢測效能,各指標計算公式:敏感度=真陽性數/(真陽性數+假陰性數)×100%;特異度=真陰性數/(真陰性數+假陽性數)×100%;陽性預測值=真陽性數/(真陽性數+假陽性數)×100%;陰性預測值=真陰性數/(真陰性數+假陰性數)×100%;一致率=(真陽性數+真陰性數)/(真陽性數+真陰性數+假陰性數+假陽性數)×100%;一致性分析采用Kappa檢驗,Kappa值>0.80為一致性好,Kappa值為0.40～0.80為一致性良好,Kappa值<0.40為一致性較差。

結 果

一、InnowaveDX和Xpert對結核病的診斷價值比較

以病原學和臨床診斷為參照標準,InnowaveDX檢測結核病的敏感度、特異度、一致率、Kappa值分別為92.5%(86/93)、100.0%(11/11)、93.3%(97/104)、0.72;Xpert檢測結核病的敏感度、特異度、一致率、Kappa值分別為93.6%(87/93)、100.0%(11/11)、94.2%(98/104)、0.75(表1)。

表1 InnowaveDX和Xpert對結核病的檢測效能

在病原學陽性結核病組中,InnowaveDX 檢測陽性率為 97.1%(66/68),Xpert檢測陽性率為95.6%(65/68),兩種技術檢測陽性率差異無統計學意義(χ2=0.000,P=1.000)。在病原學陰性結核病組中,InnowaveDX檢測陽性率為80.0%(20/25),Xpert檢測陽性率為88.0%(22/25),兩種技術檢測陽性率差異無統計學意義(χ2=0.149,P=0.700)。

二、InnowaveDX和 Xpert對不同標本的檢測價值

93例結核病患者標本中,痰標本71份(76.3%),其他類型標本22份(23.7%)。InnowaveDX和Xpert檢測痰標本陽性率均為91.5%(65/71),差異無統計學意義(χ2=0.000,P=1.000)。InnowaveDX和Xpert檢測其他類型標本陽性率分別為95.5%(21/22)和100.0%(22/22),差異無統計學意義(Fisher精確概率法,P=1.000);InnowaveDX未檢出的1份標本為BALF標本。

三、InnowaveDX與Xpert對利福平耐藥的檢測價值

93份結核病患者標本中,InnowaveDX和Xpert檢測MTBC均報告“檢出”的標本有85份,其中1份Xpert檢測“利福平耐藥”結果為“不明確”,故最終納入84份標本進行利福平耐藥檢測效能分析。以Xpert檢測MTB利福平耐藥性結果為參照,InnowaveDX檢測MTB利福平耐藥的敏感度為97.0%,特異度為92.2%,Kappa值為0.88,一致性較好(表2)。

表2 InnowaveDX和Xpert對結核分枝桿菌利福平耐藥性的檢測效能

討 論

隨著檢測技術的不斷發展和增容,基于核酸擴增試驗、核酸分子雜交和基因測序的結核病分子診斷技術得到了飛速發展,其發展也極大地推動了結核病的病原學診斷和快速藥物敏感性分析的進步[6]。在我國,針對結核病實驗室診斷,大多依靠涂片抗酸桿菌染色顯微鏡檢的方式,但是由于該方法對標本的含菌量有著較高的要求,因此,在診斷過程中出現敏感度較低的結果[7]。分枝桿菌培養,近年來也在基層醫院開展,但是由于培養耗時較長,不利于快速診斷。基于核酸檢測的分子生物學方法中,Xpert能夠達到較高的檢測敏感度,同時能夠在分子水平快速診斷利福平耐藥,然而其缺點在于依賴進口儀器及試劑,儀器維修維護及試劑成本均較高,限制了其在國內的廣泛應用。相比于涂片抗酸桿菌染色顯微鏡檢和培養方法,InnowaveDX是一種快速、簡單、經濟、有效的檢測方法,其采用自動化分子診斷系統,可在原始樣本中同時定性檢測MTBC和MTB利福平耐藥相關rpoB基因突變,3 h內即可完成檢測,大大節省了檢測的時間,且通量靈活,檢測效能與Xpert的一致性較好[8],可以滿足不同層級實驗室的診斷需求。

本次研究中,以病原學和臨床診斷為參照標準,InnowaveDX檢測結核病的敏感度、特異度、一致率、Kappa值分別為92.5%、100.0%、93.3%、0.72;Xpert檢測結核病的敏感度、特異度、一致率、Kappa值分別為93.6%、100.0%、94.2%、0.75。在病原學陽性結核病組中,InnowaveDX 檢測陽性率為 97.1%,Xpert檢測陽性率為95.6%,差異無統計學意義;在病原學陰性結核病組中,InnowaveDX檢測陽性率為80.0%,Xpert檢測陽性率為88.0%,差異無統計學意義。可見,InnowaveDX對MTBC有較好的檢測效能。

另外,本研究納入的93份結核病患者標本中,除痰標本外,還包括BALF、尿液、胸腔積液、膿液、淋巴穿刺液及腦脊液,InnowaveDX檢測結核病患者痰標本和其他類型標本的陽性率分別為91.5%和95.5%,與Xpert檢測結果(分別為91.5%和100.0%)差異無統計學意義。這說明,InnowaveDX與Xpert對于結核病患者不同類型標本的檢測價值相似。

耐多藥結核病仍是全球關注的問題。針對結核病開展有效診治的關鍵在于對耐藥結核病的快速診斷。耐藥診斷的方法中,表型藥物敏感性試驗(簡稱“表型藥敏試驗”)是診斷耐藥的金標準,但其檢測周期長。因此,基因型藥敏檢測如Xpert檢測,目前成為了診斷耐藥結核病的一種常用的方式,并且該種方式在臨床中被廣泛使用[9-10]。本研究顯示,以Xpert檢測MTB利福平耐藥性結果為參照,InnowaveDX 檢測MTB利福平耐藥的敏感度為97.0%,特異度為92.2%,兩種方法檢測結果的一致性較好(Kappa值為 0.88)。

綜上,InnowaveDX對于MTBC具有較好的檢測效能,且適用于不同類型的標本;另外,在MTB利福平耐藥檢測方面,以Xpert檢測結果為參考,也顯示了較好的檢測效能;加之其具備的檢測周期短、成本低、通量靈活的優點,顯示出其具有在結核病病原學檢測及耐藥性檢測方面的推廣應用價值。值得注意的是,礙于本次研究樣本量的限制,尤其作為對照組的非結核病患者例數較少,因此,本次研究結果存在一定的局限性,有待后續擴大樣本量進一步驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻劉梅:醞釀和設計實驗、起草文章、統計分析;吳霞和古旭:采集數據;李娜娜:分析/解釋數據;張萬敏和張小可:實施研究;蘭運波:醞釀和設計實驗、對文章的知識性內容作批評性審閱、指導