子癇前期14，15-EET、15-HETE 表達(dá)及妊娠結(jié)局分析*

楊佳琪，曹雪燕，薛云薇，施 建，黃 華，蘇 敏**

（南通大學(xué)附屬醫(yī)院1 婦產(chǎn)科；2 酶學(xué)實(shí)驗(yàn)室；3 病理科，江蘇 226001）

妊娠高血壓疾病（hypertensive disorder of pregnancy，HDP）是發(fā)生在妊娠20 周后的妊娠期特有疾病，HDP 孕婦子癇前期（preeclampsia，PE）發(fā)病率3%～8%。花生四烯酸（arachidonic acid）代謝產(chǎn)物是血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡等的重要調(diào)節(jié)因子，與血管功能紊亂性疾病相關(guān)[1]。當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)下，花生四烯酸通過(guò)磷脂酶A2 和磷脂酶C的作用，從磷脂中游離出來(lái)。游離花生四烯酸通過(guò)3條代謝途徑合成具有強(qiáng)大生物學(xué)功能的脂質(zhì)分子：（1）通過(guò)環(huán)氧化酶（COX）途徑代謝為前列腺素和血栓素；（2）通過(guò)脂氧化酶（LOX）途徑轉(zhuǎn)化為白三烯；（3）通過(guò)不同細(xì)胞色素P450（CYP450）酶代謝成為環(huán)氧二十碳三烯酸（EETs）和20-羥基二十碳四烯酸（20-HETEs）[2]。本研究應(yīng)用液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜分析檢測(cè)子癇前期患者胎盤中花生四烯酸19 種代謝產(chǎn)物，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)妊娠高血壓疾病孕婦血清14，15-EET 及15-HETE 水平，分析14，15-EET及15-HETE 在妊娠高血壓疾病發(fā)生發(fā)展中的作用及其與妊娠結(jié)局的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年1 月在我院住院分娩的子癇前期孕婦6 例和正常分娩孕婦6 例，留取胎盤組織。選取2018 年1 月—2020 年12 月在我院產(chǎn)檢和住院分娩的妊娠期高血壓疾病孕婦149 例（其中妊娠期高血壓53 例，子癇前期51 例，重度子癇前期45 例）為觀察組，同期正常健康孕婦50 例為對(duì)照組。子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)參照人民衛(wèi)生出版社第9 版《婦產(chǎn)科學(xué)》[3]，排除合并原發(fā)性高血壓、血液疾病、糖尿病、心血管疾病、腎病、感染性疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜檢測(cè)胎盤組織花生四烯酸代謝產(chǎn)物：胎盤娩出后立即用刀片切取胎盤母體面近臍帶插入部（盡量避開梗死和鈣化的區(qū)域）組織約50 mg，用PBS 沖洗，加入250 μL 甲醇和5 μL 甲酸，混勻后勻漿，冰浴中超聲波破碎，吸取上清液。加入350 μL 雙蒸水和0.5 mL 乙酸乙酯，渦旋30 s，離心10 min 取出有機(jī)相。氮?dú)獯蹈桑状紡?fù)溶。應(yīng)用Waters BEH-C18 柱色譜柱，流動(dòng)相：甲醇∶0.1%甲酸水90∶10。應(yīng)用液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜檢測(cè)19 種花生四烯酸代謝產(chǎn)物：環(huán)氧化酶（COX）代謝產(chǎn)物前列腺素PGD2、PGE2、PGF2α、8iso-PGF2α、15-dPGJ2，血栓烷11-d-TXB2，油酸產(chǎn)物9-HODE、13-HODE 和17S-HODE，脂氧化酶（LOX）代謝產(chǎn)物5-HETE、12-HETE、15-HETE 和白三烯LTB4，細(xì)胞色素P450（CYP） 代謝產(chǎn)物5，6-DHET、8，9-DHET、11，12-DHET、14，15-DHET、14，15-EET 和20-HETE。

1.2.2 血清14，15-EET 及15-HETE 水平測(cè)定：采集各組孕婦靜脈血，離心取血清，置于-70 ℃冰箱保存待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)血清14、15-EET及15-HETE 水平，試驗(yàn)前從低溫冰箱取出血清融凍，按試劑盒說(shuō)明書加樣、溫育、配液、洗滌、加酶、溫育、洗滌、顯色、終止，以450 nm 波長(zhǎng)測(cè)量吸光度（OD 值）。

1.3 不良妊娠結(jié)局判定標(biāo)準(zhǔn) （1）圍產(chǎn)兒死亡（宮內(nèi)死亡或引產(chǎn)、新生兒死亡）；（2）新生兒出生后入住NICU；（3）出生極低體重；（4）娩出后5 min Apgar 評(píng)分＜7 分；（5）宮內(nèi)生長(zhǎng)受限；（6）新生兒呼吸窘迫綜合征；（7）胎盤早剝；（8）羊水過(guò)少；（9）產(chǎn)后出血；（10）HELLP 綜合征；（11）心力衰竭。出現(xiàn)以上任何一種情況即視為不良妊娠結(jié)局。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子癇前期組與對(duì)照組胎盤花生四烯酸代謝產(chǎn)物表達(dá)比較 子癇前期患者胎盤中14，15-EET、15-HETE 及9-HODE 含量較對(duì)照組增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 子癇前期組與對(duì)照組胎盤花生四烯酸代謝產(chǎn)物表達(dá)比較 ng/mL

2.2 各組孕婦血清14，15-EET 及15-HETE 水平比較 重度子癇前期組、子癇前期組、妊娠期高血壓組、對(duì)照組血清14，15-EET 及15-HETE 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），重度子癇前期組高于子癇前期組、妊娠期高血壓組和對(duì)照組，子癇前期組高于妊娠期高血壓組和對(duì)照組，妊娠期高血壓組高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組孕婦血清14，15-EET 及15-HETE 水平比較

2.3 重度子癇前期不同妊娠結(jié)局孕婦血清14，15-EET、15-HETE 表達(dá)水平比較 對(duì)照組50 例中出現(xiàn)不良妊娠結(jié)局1 例（2.00%）（早產(chǎn)兒），妊娠期高血壓組53 例中出現(xiàn)不良妊娠結(jié)局4 例（7.54%）（早產(chǎn)兒3 例，低體重兒2 例，產(chǎn)后出血2 例，新生兒轉(zhuǎn)NICU 2 例，新生兒窒息1 例），子癇前期組51 例中出現(xiàn)不良妊娠結(jié)局12 例（23.53%）（早產(chǎn)兒7 例，新生兒轉(zhuǎn)NICU 6 例，低體重兒5 例，新生兒窒息1 例，胎盤早剝1 例，產(chǎn)后出血2 例，羊水過(guò)少1 例），重度子癇前期組45 例中出現(xiàn)不良妊娠結(jié)局20 例（44.44%）（新生兒轉(zhuǎn)NICU 14 例，早產(chǎn)兒15 例，低體重兒7 例，新生兒窒息2 例，胎盤早剝2 例，產(chǎn)后出血5 例，羊水過(guò)少3 例）。將重度子癇前期組分為不良妊娠結(jié)局組20 例及正常妊娠結(jié)局組25 例，妊娠不良結(jié)局組血清14，15-EET 及15-HETE 水平分別為203.97±24.82 pg/mL 和217.00±35.15 pg/mL，高于妊娠正常結(jié)局組的179.07±20.67 pg/mL 和182.90±30.25 pg/mL，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

部分子癇前期患者病情進(jìn)展迅速，血壓難以控制，嚴(yán)重者可進(jìn)展為子癇，母嬰死亡率較高。目前通過(guò)對(duì)高危因素（高齡、妊娠期高血壓疾病史或家族史、產(chǎn)前體質(zhì)量指數(shù)超標(biāo)、抗磷脂抗體陽(yáng)性[4]、子宮動(dòng)脈多普勒血流檢測(cè)異常等）評(píng)估來(lái)預(yù)測(cè)妊娠期高血壓疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，但缺乏快速、經(jīng)濟(jì)、有效的生化檢測(cè)方法。

CYP450 是龐大的酶代謝超級(jí)家族[5]，CYP2J 亞家族（如CYP2J2）以及CYP2C 亞家族（CYP2C8 和CYP2C9）成員是代謝產(chǎn)生EETs 的主要酶類，EETs有5，6-EET、8，9-EET、11，12-EET 和14，15-EET等4 種異構(gòu)體。EETs 半衰期短，生成后很快被可溶性表氧化物水解酶（sEH）降解為生物活性較低的5，6-二羥基-20 碳三烯酸（DHET）、8，9-DHET、11，12-DHET 和14，15-DHET。LOX 根據(jù)氧分子插入花生四烯酸的位置不同而分為4 種亞型：5-LOX，8-LOX，12-LOX 和15-LOX，可催化花生四烯酸生成5/8/12/15-HETE、15-HETE 等產(chǎn)物，通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載引起外周血管收縮，并增強(qiáng)其它血管活性物質(zhì)的縮血管作用，從而促進(jìn)高血壓的發(fā)生。這些花生四烯酸代謝產(chǎn)物作為PI3K/AKT、MAPK 等信號(hào)通路的上游調(diào)控因子，參與血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的調(diào)控，同時(shí)作為內(nèi)源性血管舒張因子，介導(dǎo)血管的收縮功能。EETs 和HETEs功能、代謝異常，易致血管功能紊亂性疾病如高血壓等的發(fā)生[6]。

本研究結(jié)果顯示，子癇前期患者胎盤中CYP 代謝產(chǎn)物14，15-EETs、LOX 代謝產(chǎn)物15-HETE、COX代謝產(chǎn)物9-HODE 的含量較對(duì)照組增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。血清14，15-EET 及15-HETE水平重度子癇前期組高于子癇前期組、妊娠期高血壓組和對(duì)照組，子癇前期組高于妊娠期高血壓組和對(duì)照組，妊娠期高血壓組高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著妊娠期高血壓疾病的進(jìn)展，血清中14，15-EET 及15-HETE 水平呈上升趨勢(shì)，提示這些花生四烯酸代謝產(chǎn)物與妊娠期高血壓疾病的發(fā)生及病情進(jìn)展有關(guān)。

14，15-EET 在妊娠子宮的胎盤、滋養(yǎng)細(xì)胞、羊膜、絨毛膜、蛻膜和肌層中均有形成，在胚胎-胎盤中升高較血漿更顯著[7]。有研究表明，妊娠期高血壓疾病患者胎盤及蛻膜中CYP2J2 表達(dá)升高，可促進(jìn)胎盤中EETs 的合成和分泌，與母胎循環(huán)改變有關(guān)[4]。能否通過(guò)靶向調(diào)節(jié)妊娠高血壓疾病動(dòng)物模型14，15-EET 含量，達(dá)到舒張血管、改善母胎循環(huán)及不良妊娠結(jié)局的目標(biāo)需要進(jìn)一步研究。

內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡失衡干擾血管重鑄的建立，血管重鑄受15-HETE 等多種花生四烯酸代謝物的影響。HETEs 對(duì)子宮螺旋動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的作用可能引起滋養(yǎng)細(xì)胞入侵障礙，造成子宮螺旋動(dòng)脈重鑄不足，加重胎盤缺血缺氧。缺氧誘導(dǎo)15-脂質(zhì)氧化酶（15-LOX）催化花生四烯酸生成15-HETE，15-HETE 通過(guò)抑制Kv 通道引起動(dòng)脈血管收縮[8]。子癇前期患者因缺氧誘發(fā)母體及胎盤同時(shí)合成15-HETE。本研究結(jié)果顯示，15-HETE 在妊娠期高血壓疾病患者血液及胎盤組織中15-HETE 增高。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）對(duì)15-HETE 調(diào)控人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞血管調(diào)節(jié)作用是必要的，可能是治療血管調(diào)節(jié)相關(guān)疾病的潛在靶點(diǎn)。

本文研究結(jié)果顯示，妊娠不良結(jié)局患者血清14，15-EET 及15-HETE 水平高于妊娠正常結(jié)局患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。有研究表明子癇前期15-HETE 升高與EETs 密切相關(guān)，新生兒臍帶血EETs 濃度是母體循環(huán)的3～5 倍，胎兒臍帶血血?dú)夥治鎏崾酒銹CO2與胎盤血漿EETs 水平呈正相關(guān)，提示14，15-EET 及15-HETE 和新生兒低氧血癥及酸中毒有關(guān)。14，15-EET 及15-HETE 通過(guò)對(duì)母胎界面的影響，可能參與妊娠期高血壓疾病不良妊娠結(jié)局的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，花生四烯酸代謝產(chǎn)物14，15-EET 及15-HETE 參與妊娠期高血壓疾病的病理生理過(guò)程，重度子癇前期孕婦血清中14，15-EET 及15-HETE增高與妊娠不良結(jié)局有關(guān)，提示通過(guò)檢測(cè)孕婦血清14，15-EET 及15-HETE 水平可能有助于預(yù)測(cè)妊娠不良結(jié)局和母嬰預(yù)后。