新疆某羊場羊棘球蚴基因型的鑒定與分析

馬穎超，黃 琴，陳紅強，張怡淼，胡建軍，靳 玲

（1.塔里木大學，新疆生產建設兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木大學動物科學與技術學院，新疆 阿拉爾 843300；3.新疆生產建設兵團第一師畜牧獸醫工作站，新疆 阿拉爾 843300）

棘球蚴病又名包蟲病，是一種人畜共患寄生蟲病，幼蟲寄生于羊、豬、牛等動物的肝、肺等內臟器官，成蟲寄生于狐貍、犬、狼等動物的小腸中。該病對綿羊的危害最為嚴重。世界上流行的棘球絳蟲有5 種，我國主要蟲種是細粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲，前者更為多見，其幼蟲會引起囊型棘球蚴病和泡狀棘球蚴病，因極強的致病性被世界衛生組織列為十大寄生蟲病。根據基因組特征、DNA 序列的差異，細粒棘球蚴被劃分為10個基因型（G1～G10）［1］。蟲種及其基因分型鑒定作為寄生蟲種群遺傳機制研究的基礎，在提高臨床療效，控制包蟲病流行等方面具有重要意義。

本研究基于線粒體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶第一基因（英文簡稱ND1），鑒定分析新疆南疆地區某羊場羊感染細粒棘球蚴的基因型，為該地區細粒棘球蚴病的防治提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 病料來源 新疆南疆某牧區規模羊場羊群出現部分羊消瘦，并有發病死亡。解剖后發現病死羊的肺臟存在化膿灶，肝臟上有棘球蚴，剝離肝臟與肺臟包囊，保存備用。根據寄生部位，棘球蚴分別命名為Gxjy（肝臟）和Fxjy（肺臟）。

1.2 主要試劑 TIANamp Genomic DNA Kit 血液/細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒，普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒，均為天根生化科技（北京）有限公司產品。

1.3 方法

1.3.1 形態學檢查 將肝臟與肺臟上的棘球蚴囊泡置入干凈的平皿，用無菌注射器抽取囊泡中的囊液，滴加至載玻片，鏡檢。

1.3.2 樣本總DNA 提取 取25 mL 棘球蚴囊壁于液氮中充分研磨后，采用DNA提取試劑盒進行DNA 提取，提取后的全基因組DNA 用于ND1 的序列擴增。

1.3.3 ND1基因的PCR擴增 參照文獻［2］中的特異性引物ND1 基因引物（ND1-F、ND1-R），設計ND1基因的上、下游引物（Fw、Rv），引物由上海英濰捷基公司合成（見表1）。PCR 反應體系：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，ddH2O 18 μL，模板DNA 5 μL，上、下游引物各1 μL。PCR 反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35 個循環；72 ℃延伸10 min。取擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 ND1基因的上、下游引物序列

1.3.4 PCR 產物純化回收 將PCR 擴增產物切膠，按照TIANgel Midi Purification Kit 試劑盒說明書純化回收PCR產物，送生工生物工程（上海）股份有限公司正向測序。

1.3.5 序列分析 測序結果在NCBI中作Blast比對，用DNAstar軟件進行核苷酸序列同源性分析、系統發育分析，用MEGA 5.0 軟件繪制遺傳進化樹。

2 結果

2.1 病理剖檢 肉眼可見病死羊的肝臟明顯增大，表面不平整，有大小不一的白色或黃色凸起，其中最大的直徑約8 cm，內含有淡黃色的圓狀棘球蚴卵囊，單個或多個附著于肝上，卵囊壁光滑透明，囊壁分兩層（角質層和生發層），包囊內含有大量淡黃色渾濁液體。肺臟表面的一些棘球蚴病灶發生化膿。由此可見，本病的靶心病灶在于肝、肺兩大器官。

2.2 ND1基因PCR擴增 以提取的棘球蚴蟲體組織DNA為模板，利用棘球蚴特異性引物（ND1-F、ND1-R）對ND1 基因（Fw、Rv）進行擴增，擴增出510 bp 大小的片段（圖1），與預期的目的片段大小相符。

圖1 細粒棘球蚴ND1基因的PCR擴增結果

2.3 ND1 基因核苷酸同源性比較 測序結果在NCBI 中進行Blast 比對，并應用DNAstar 對Gxjy（肝臟）與Fxjy（肺臟）進行ND1 基因核苷酸序列同源性比較，結果兩者之間的核苷酸同源性為100%，即肝臟上的棘球蚴Gxjy 與肺臟上的棘球蚴Fxjy為同一棘球絳蟲株。

應用DNAstar對Gxjy的ND1基因核苷酸與棘球蚴參考株的核苷酸序列進行對比，結果核苷酸同源性可達84.1%以上（圖2）。通過MegAlign 軟件用鄰近法（NJ）構建系統進化樹（圖3），結果得出：Gxjy與棘球蚴參考株JN604111.1、GQ358013.1、KU169241.1、KC579443.1、KF731935.1、DQ341530.1、JQ317989.1處于同一分支。

圖2 肝臟中棘球蚴ND1基因與參考株的核苷酸同源性比較

圖3 以肝臟中棘球蚴ND1基因構建的系統進化樹

3 討論

3.1 棘球絳蟲的分類及危害性 世界上流行的棘球絳蟲有5種，分別為細粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲、少節棘球絳蟲、伏氏棘球絳蟲和石渠棘球絳蟲［3］。其中細粒棘球蚴是我國主要流行的蟲種，特別是西部的青海、新疆、西藏、內蒙古等牧區，包蟲病流行較為嚴重，綿羊感染率在50%以上［4］。

3.2 細粒棘球蚴基因型及感染情況 根據遺傳學特征，細粒棘球蚴的致病原由4 個棘球絳蟲復合種構成，分別是狹義細粒棘球絳蟲、馬棘球絳蟲、奧氏棘球絳蟲和加拿大棘球絳蟲［5-6］。其中，狹義細粒棘球絳蟲根據基因序列分析對應為G1型、G2型和G3型，三者因DNA序列差異小、遺傳距離近、寄生宿主種類與地理分布相似，被視為一個單獨的進化種。山羊與綿羊均可成為狹義細粒棘球絳蟲的中間宿主，并且是G1～G3 型的主要易感動物。G1型細粒棘球絳蟲呈全球分布，是目前引起全球人和動物患包蟲病最多的第一大常見基因型。G2、G3型主要在亞洲、非洲與南美洲流行，雖然可以感染人，但分布范圍小，僅在個別地區被報道。馬棘球絳蟲最初因主要寄生于馬而被命名為細粒棘球絳蟲馬亞種，后修訂為馬株，對應G4 型［7］。G4 型具有高度的宿主特異性，目前只有馬、驢、騾子、斑馬、獼猴為中間宿主［8-11］。奧氏棘球絳蟲對應G5 型，G5 型的中間宿主主要為牛，綿羊與山羊也可被寄生。加拿大棘球絳蟲種一直備受爭論，目前對應G6、G7、G8、G10 型［12］。根據現階段報道，加拿大棘球絳蟲只有G6型和G7型可寄生于綿羊與山羊，G8型和G10 型主要寄生于馬鹿、駝鹿等，且流行局限于北半球。我國曾報道過有G6、G7、G8和G10型感染的情況，其中G6型更為多見［13］。

3.3 新疆地區羊細粒棘球蚴不同基因型的感染情況 新疆牧區是棘球絳蟲的流行區，存在細粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲、石渠棘球絳蟲三種蟲體，其中細粒棘球絳蟲最為廣泛，有G1、G3 與G6基因型的分布。丁繁萍等［14］對新疆南疆地區某羊場的患病羊只進行研究，確定該羊場患病羊只為細粒棘球蚴G1基因型和細頸囊尾蚴的混合感染；郭璐等［15］對新疆7個縣（市）的牛、羊細粒棘球蚴包囊提取DNA，經PCR擴增、測序，發現感染的細粒棘球蚴基因型為G1、G3型，且感染率存在明顯差異，G1型為99.2%，G3型為0.8%；張亞樓等［16］對新疆家犬體內蟲體的CO1基因序列進行PCR檢測，結果顯示其中1條家犬的體內存在細粒棘球絳蟲G1 型和G6 型混合感染，其余所有感染犬體內成蟲的基因型均為G1 型。綜上可知，目前新疆地區存在G1、G3 和G6 型細粒棘球蚴感染的情況，且G1型為主要感染亞型。

本研究中，肝臟上的細粒棘球蚴Gxjy與肺臟上的細粒棘球蚴Fxjy 同為細粒棘球絳蟲G1（羊）株，且Gxjy 與參考株——法國JN604111.1（狼）、阿爾及利亞DQ341530.1（綿羊）、中國JQ317989.1（羊）、阿根廷KC579443.1（羊）、突尼斯KU169241.1（狗）、伊朗KF731935.1（山羊）、德國GQ358013.1（馬）均位于同一進化分支上，與參考株GQ358013.1 的核苷酸同源性高達100%，與其他核苷酸的同源性也較高（98.1%～99.3%），說明群體間遺傳分化很小。

3.4 疫苗對羊細粒棘球蚴防控的影響 目前，包蟲病疫苗對羊的棘球蚴感染具有很好的免疫保護效果。王進香等［17］應用Eg95 疫苗在寧夏部分規模養殖場進行羊棘球蚴病的免疫評估試驗，結果顯示：免疫前抗體陽性率為36.0%，二免后抗體陽性率達到82.06%；范才良等［18］用Eg95疫苗對試驗羊進行免疫評價，結果表明羊包蟲病基因工程亞單位疫苗（Eg95）對羊源棘球蚴病具有良好的預防作用，且羊免疫接種后未出現明顯的不良反應。因此，注射羊包蟲病基因工程亞單位疫苗（Eg95）對羊包蟲病的有效防控具有重要作用。