血小板應答蛋白1在雙側卵巢切除大鼠陰道壁中的表達

朱芳誼，洪莉，陳茂，肖雅，黃筱雨，陳麗穎

武漢大學人民醫院婦產科，湖北武漢 430060

盆腔臟器脫垂（pelvic organ prolapse，POP）是指由于盆底支持結構薄弱進而導致盆腔器官移位及功能異常的盆腔功能障礙性疾病，陰道前壁是臨床上最常見的脫垂部位。POP患者可能伴有不同程度的盆腔疼痛、排尿異常、大便失禁或排便障礙等不適癥狀，造成生活質量嚴重下降[1]；且其較高的手術率也給公共衛生系統帶來沉重的經濟負擔。據統計，女性終身接受POP手術的風險為12%～19%，陰道脫垂已成為絕經后女性接受子宮切除術最常見的手術指征之一[2]。然而POP的發病機制仍未得到充分解釋，這給相關診療方案的制定帶來重大困難。研究顯示POP是一種多因素的結締組織疾病，絕經是其主要危險因素之一，絕經后女性的雌激素水平急劇下降，造成陰道壁萎縮及炎癥，并通過影響膠原纖維的代謝導致盆腔結締組織支持功能障礙，進而誘發POP[3]。血小板應答蛋白1（thrombospondin-1，THBS1）是血小板凝血酶蛋白家族中一種可由成纖維細胞、平滑肌細胞等多種細胞分泌的鈣結合性糖蛋白，在子宮內膜、陰道壁等多種人體組織中廣泛表達[4]。作為一種具有三聚體復合結構的基質細胞蛋白，THBS1可通過結合細胞外基質中的受體和特定蛋白質，參與調控細胞骨架、細胞遷移、細胞凋亡、止血和血管生成等多項生理活動。研究顯示THBS1在生理狀態下表達較少，但在組織受損時表達上調，并在慢性纖維化疾病中持續存在，參與纖維化和炎癥相關的多個分子通路的激活[5-6]。體外實驗證實雌激素處理可使人體子宮來源的成纖維細胞中的THBS1表達下調[7]。本研究通過切除大鼠雙側卵巢模擬絕經后低雌激素環境，構建大鼠雌激素缺乏模型；觀察其陰道壁的形態結構及THBS1的表達變化，初步探討雌激素缺乏是否通過上調THBS1表達影響陰道壁中膠原纖維代謝，參與POP的發病進程，為未來POP發病機制的相關研究提供思路及研究靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選用無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級健康的3月齡未生產過的SD大鼠24只，體質量332～367g，平均（350.0±17.2）g，由武漢大學人民醫院動物實驗中心提供，對動物的處置符合動物倫理學要求[實驗動物許可證號：TY20220087；倫理審批號：WDRM動（福）第20200805號]。24只大鼠隨機分為假手術組和實驗組，每組各12只。

1.1.2 主要試劑和儀器 抗THBS1抗體（Santa Cruz Biotechnology生物公司）；17-β-雌二醇酶聯免疫吸附測定試劑盒（Abcam，ab108667）；免疫組織化學試劑盒、組織固定液（武漢賽維爾生物科技有限公司）；蛋白上樣緩沖液（谷歌生物技術有限公司）；正置熒光顯微鏡（日本，Olympus）；ChemiDocTMTouch化學發光儀（美國，BIO-RAD）；EnSight酶標儀（美國，Perkin Elme）；BSA124S-CW分析天平（德國，Sartorius）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 將大鼠放入麻醉誘導盒（4%異氟烷），待大鼠麻醉后將其取出固定在手術臺上，利用麻醉呼吸面罩維持麻醉（2%異氟烷），使其保持深度麻醉。除去腰背部毛發，消毒皮膚，無菌條件下經腰背部正中縱行切口進入腹腔背側，實驗組大鼠切除雙側卵巢；假手術組大鼠切除雙側卵巢下方與卵巢相同重量的脂肪組織。術后給予青霉素預防感染1周，每周監測大鼠體質量。常規飼養至12周后處死大鼠，取子宮、陰道壁組織及靜脈血進行分析。

1.2.2 取材方法 處死前從大鼠尾靜脈取血，抗凝靜置10min后，4°C下1500×g離心10min，收集血清并轉移至–80℃冰箱備用。采用斷椎法處死大鼠，打開盆腔，暴露盆底，分離筋膜與脂肪組織，取子宮及陰道壁組織，并將陰道壁沿中線分成兩塊，約0.5cm×0.5cm×0.5cm，生理鹽水反復沖洗，一塊放入–80℃冰箱中低溫保存；另一塊采用組織固定液固定，常規石蠟包埋、切片。

1.2.3 酶聯免疫吸附測定 按照酶聯免疫吸附測定試劑盒說明進行相關操作，將25μl血清樣品、對照組及標準組溶液分別加入酶標板，37℃孵育2h。用洗滌液漂洗3遍，加入100μl TMB底物，室溫避光孵育30min，加入終止液并輕搖，30min內在酶標儀上讀取各孔在450nm處的吸光度。制作標準曲線，計算血清樣品內雌二醇含量。

1.2.4 免疫組織化學染色 染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（streptavidin-perosidase，SP）法，按試劑盒說明進行相關操作。切片在60℃抗原修復液中加熱30min，用分級醇系脫蠟再水化，一抗按1∶100稀釋。光鏡下觀察，細胞質或細胞膜中有棕色顆粒為陽性表達。免疫活性用積分光密度（integral optical density，IOD）值量化，使用Image J 6.0軟件通過高分辨攝取圖像信號測定灰度值，用平均灰度值表示THBS1蛋白的表達，平均密度=IOD/面積。

1.2.5 Masson染色 切片脫蠟，鐵蘇木素染色7min，水洗，酸性乙醇分化液分化，水洗，麗春紅酸性品紅液染色8min，水洗，1%磷鉬酸水溶液處理約5min，苯胺藍復染5min，0.2%冰醋酸處理1min，脫水后中性樹膠封固。顯微鏡下觀察膠原纖維呈藍色，胞質、肌纖維和紅細胞呈紅色，胞核黑色。

1.2.6 蛋白質印跡檢測 取大鼠陰道壁組織液氮研磨后加入蛋白裂解液，充分混勻后4℃、12 000轉/min離心5min，取上清液，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測樣品的蛋白濃度，加入適量5×蛋白上樣緩沖液后煮沸8min使蛋白變性，使用8% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白樣本，轉膜，5%牛血清白蛋白封閉液室溫封閉1h，加入一抗THBS1抗體（1∶3000）4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液漂洗3遍，二抗室溫孵育1h，再次用磷酸鹽緩沖液漂洗3遍，使用ChemiDocTMTouch化學發光儀掃膜并分析條帶。

1.3 統計學方法

應用GraphPad Prism 8.0和Image J 6.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，并經Levene方差齊性檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠的造模情況

造模12周后，實驗組大鼠子宮萎縮明顯，體質量增加顯著高于假手術組，雌二醇水平顯著低于假手術組（P<0.01），見圖1、表1。

表1 造模12周后兩組大鼠的各項指標比較（±s）

表1 造模12周后兩組大鼠的各項指標比較（±s）

組別 子宮重量（g）體質量增加（g）雌二醇（pg/ml）假手術組（n=12） 0.87±0.02 15.82±0.89 82.75±1.33實驗組（n=12） 0.10±0.02 45.32±0.74 40.60±0.67 t 30.22 25.58 28.32 P <0.01 <0.01 <0.01

圖1 兩組大鼠的子宮對比

2.2 Masson染色結果

與假手術組比較，實驗組大鼠的陰道壁上皮層明顯萎縮，平滑肌束變薄，肌束間隙變寬，固有層和肌層中膠原纖維沉積增加，且排列分布雜亂、碎片化，見圖2。

圖2 兩組大鼠的陰道壁膠原纖維形態結構（Masson染色，×200）

2.3 免疫組織化學染色結果

兩組大鼠的陰道壁全層THBS1均有表達，以陰道壁固有層為主。與假手術組比較，實驗組的棕黃色顆粒更粗大，含量更多，且分布更密集，彼此形成細密的網絡結構，見圖3。實驗組大鼠陰道壁中THBS1表達顯著高于假手術組（P<0.05），見圖4。

圖3 兩組大鼠陰道壁中的THBS1表達（免疫組織化學染色，×200）

圖4 兩組大鼠陰道壁中的THBS1蛋白表達

3 討論

隨著預期壽命的延長及人口老齡化的進程，預計到2050年有臨床癥狀的POP患病率將增加約50%[8]。由于對POP的具體發病機制了解有限，目前以手術為主的治療方案側重于恢復盆腔器官的正常解剖結構，忽視對盆底支持組織功能方面的治療，可能導致患者出現排尿障礙等術后并發癥，且術后復發率仍然很高，二次手術發生率高達19%[9-10]。為恢復患者盆底支持結構的生理功能，從根本上治愈患者及提供更精準的預防手段，對POP相關潛在靶點的深入研究具有重要臨床意義。

陰道壁包括上皮層、富含膠原纖維的固有層、平滑肌束組成的肌層和外膜層，其中固有層和肌層在維持陰道壁的生物力學特性中發揮重大作用[11]。研究證實，絕經與POP患病風險增加存在直接關聯。絕經后，血清雌激素水平及盆腔結締組織中雌激素受體濃度顯著降低，這種低水平雌激素的環境改變促使盆腔結締組織中膠原纖維雜亂無序的沉積，進而導致支持功能下降[12-13]。

研究證實，在人體來源的子宮內膜基質細胞、垂體內皮細胞中雌激素治療可抑制THBS1的表達[7,14]。在多囊卵巢綜合征大鼠模型中也發現血清THBS1表達下降，這可能與雌激素水平升高有關[15]。此外，雌激素還可通過下調THBS1受體CD36，進而抑制THBS1與CD36結合后所激活的下游通路[16]。相反，在雙側卵巢切除術后大鼠的比目魚肌中THBS1表達增加[17]。上述研究結果提示雌激素水平與THBS1表達呈負相關，本研究也發現雙側卵巢切除術后大鼠的血清雌激素水平明顯下降，且陰道壁中THBS1表達上調，與預期結果一致。THBS1可激活轉化生長因子β1，而轉化生長因子β1的激活不僅加速成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，且誘導促纖維化基因轉錄增加，還會加劇炎癥反應，最終導致組織廣泛纖維化[18]。THBS1還可通過直接結合或間接作用來調控基質金屬蛋白酶的活性，進而加劇細胞外基質的膠原沉積[19]。Lu等[20]研究發現THBS1是治療糖尿病腎臟并發癥的有效治療靶點，在糖尿病小鼠模型中給予THBS1阻滯劑可選擇性抑制腎臟中過量激活的轉化生長因子β活性，進而緩解腎臟纖維化改變。Bao等[21]也證實THBS1介導的間歇性缺氧可誘導心肌成纖維細胞活化和心肌纖維化。因此，作為膠原纖維代謝的重要調節劑，THBS1有助于膠原纖維在細胞外基質中沉積。

本研究通過切除大鼠的雙側卵巢構建大鼠雌激素缺乏模型，12周后實驗組大鼠的陰道壁中發生膠原纖維代謝異常的病理改變，陰道壁上皮層萎縮，排列紊亂且碎片化的膠原纖維沉積在黏膜層和肌層，導致陰道僵硬度增加，與POP患者陰道壁的病理學觀察相一致[22]。推測實驗組大鼠體內低雌激素環境使得陰道壁中THBS1表達增加，后者通過擾亂結締組織中正常的膠原纖維代謝引起陰道壁過度纖維化，進而損害陰道壁的生物力學性質，導致其對POP的易感性增加。

綜上，THBS1可能參與雌激素缺乏所誘導的陰道壁過度纖維化，從而導致盆底支持組織的強度及韌性受損，參與POP的發生發展。