基于迭代進化的腸出血性大腸桿菌噬菌體雞尾酒的抗菌效果評價

摘要：分離到一株抗菌能力較差的新型噬菌體vB_EcoM_CRP22，通過模擬噬菌體與細菌在自然環境中的相互作用，開發了迭代適應性進化的方法使噬菌體感染噬菌體抗性突變菌株，顯著提高了噬菌體對腸出血性大腸桿菌（EHEC）的抗菌效果，由噬菌體進化株組合成的雞尾酒制劑感染細菌后36 h 內能有效控制OD600 低于0.4。該實驗為噬菌體療法的發展提供了新思路。

關鍵詞：腸出血性大腸桿菌；噬菌體療法；適應性進化；噬菌體雞尾酒；抗菌效果

中圖分類號：Q939.9 文獻標志碼：A

腸出血性大腸桿菌（EHEC）是一種人類食源性病原菌，可引發多種嚴重的腸道疾病，包括腹瀉、出血性結腸炎（HC）和溶血性尿毒綜合征（HUC）等，對公共衛生安全造成極大挑戰[1-2]。抗生素常常被用來治療病原菌感染，然而隨著抗生素的廣泛使用，病原菌的抗生素耐藥性（AMR）問題日趨嚴重[3-4]。同時，喹諾酮類抗生素等藥物的使用可能會誘導大腸桿菌表達志賀毒素[5]。此外，長期使用抗生素容易造成腸道菌群紊亂，對使用者的健康產生持續影響[6]。因此，開發抗生素替代療法從而對EHEC感染進行預防和治療是目前需要解決的問題。

噬菌體是自然環境中存在的一種細菌病毒，能夠感染細菌并具有宿主特異性。噬菌體療法是利用噬菌體裂解細菌的特性從而治療感染性疾病的一種方法，在高效殺滅病原菌的同時降低對人體內有益菌群的影響[7-8]。然而，噬菌體療法也存在一系列挑戰，如雖然一些噬菌體能特異性感染病原菌，但是其抗菌能力還有待提高[9]。這些噬菌體無法長期抑制病原菌的生長，同時噬菌體抗性菌株的產生會影響治療效果[10]。使用噬菌體雞尾酒（Phage cocktail）進行治療是有效的應對策略，該方法將不同噬菌體株進行組合配伍從而可以延長抗菌時間，目前已被廣泛應用于對抗AMR 細菌[11-12]。噬菌體雞尾酒依賴于高度多樣性噬菌體株組成的噬菌體庫，然而從自然環境中分離噬菌體株需要投入大量的時間和人力，不利于臨床新型病原菌的快速治療[13]。因此，在使用噬菌體雞尾酒進行治療的過程中，需要尋找新的策略以快速獲得多樣性的噬菌體株。

在生態環境中，噬菌體與細菌的相互作用是一場“軍備競賽”，在持續的生存壓力下，細菌會不斷進化以抵抗噬菌體，而噬菌體也會不斷發生進化來對抗細菌[14-15]。已有研究表明，在實驗室條件下能夠實現噬菌體的適應性進化，并提高噬菌體抗菌能力和生長特性[16]。此外，還有研究表明與細菌共培養后的噬菌體發生了宿主范圍的改變，并延緩了噬菌體抗性菌的產生[17-18]。在體內的治療模型中，經過進化的噬菌體在治療銅綠假單胞菌感染的過程中表現出了更廣的宿主范圍和更好的治療效果[19]。由此可見，適應性進化是獲得不同噬菌體株的一個潛在策略。

本研究通過模擬噬菌體與細菌在自然環境中的相互作用，開發了迭代適應性進化的方法以獲得不同的噬菌體株，隨后將其組成噬菌體雞尾酒用于抑制EHEC 的生長。首先，從環境中分離到一株能感染EHEC 的大腸桿菌噬菌體， 然而其抗菌效果較弱。隨后，使用適應性進化的方法獲得5 株噬菌體抗性突變菌株和5 株對其有感染能力的噬菌體進化株。最后，將野生型噬菌體和5 株噬菌體進化株組合成雞尾酒并對其抑制EHEC 的體外抗菌效果進行評價。本研究開發的迭代適應性進化的方法能快速獲得多種噬菌體株，并增強噬菌體的抗菌能力，有望促進噬菌體療法的發展。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器和細菌培養

本研究使用的LB（Luria-Bertani）肉湯培養基購自海博生物技術有限公司，瓊脂、PEG8000 和甘油購自上海麥克林生化科技股份有限公司， 基因組DNA 抽提試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。PBS（磷酸鹽） 緩沖液的所有成分（化學純）購自國藥集團化學試劑有限公司，配制方式為稱取8.00 g NaCl、0.20 g KCl、3.58 g Na2HPO4·7H2O、0.27 gKH2PO4 溶于1 L 去離子水，滅菌并常溫保存。

用于細菌和噬菌體培養的多功能恒溫振蕩培養箱（Stab Mini 型）購自上海潤度生物科技有限公司，高速臺式冷凍離心機（H1750R 型）購自湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。用于抗菌效果評價的生長測定儀（Bioscreen C plate reader 型） 購自芬蘭OyGrowth Curves Ab Ltd，由華東理工大學生物反應器國家重點實驗室提供。用于噬菌體形態觀察的透射電鏡（TEM， JEM-1400Plus 型）購自日本JEOL 公司，由華東理工大學分析測試中心提供。

本研究使用的腸出血性大腸桿菌O157：H7 菌株EDL933 由上海交通大學姚玉峰教授贈予，本文中以EHEC 代指該大腸桿菌菌株。EHEC 和噬菌體抗性菌株均使用LB 肉湯和LB 瓊脂培養基進行培養。取細菌劃線于瓊脂質量濃度為15 g/L 的LB 瓊脂培養基， 37 ℃ 培養12 h，然后挑單菌落至LB 肉湯培養基，37 ℃、200 r/min 搖床培養12 h，可進行后續試驗。

1.2 噬菌體的分離純化與透射電鏡觀察

噬菌體的分離純化主要通過雙層平板實驗完成[20]。首先，從華東理工大學河水中取樣并以8 000 g條件離心5 min 以去除污水樣品中的雜質，隨后使用0.22 μm 濾膜過濾除菌。然后，向水樣中加入等體積LB 培養基，并按1% 接種量加入大腸桿菌菌液，37 ℃共培養12～24 h。使用0.22 μm 濾膜對共培養液過濾除菌，獲得噬菌體液。將100 μL 菌液與100 μL 噬菌體液混合， 37 ℃孵育10 min 后加入55～65 ℃ 的LB 軟瓊脂培養基（瓊脂質量濃度為7 g/L），混合均勻并迅速傾倒于提前配制好的LB 瓊脂培養基（瓊脂質量濃度為15 g/L）平皿上，靜置至完全凝固，37 ℃ 共培養12～24 h，觀察噬菌斑形成情況。若存在噬菌斑，使用移液器槍頭挑取噬菌體并轉移至PBS 溶液，4 ℃ 靜置2 h 以上，并對噬菌體溶解液進行3 輪雙層平板實驗，即可獲得純化的噬菌體株，于4 ℃ 保存在終質量濃度0.2 g/mL 甘油溶液中。

通過TEM 觀察單個噬菌體的形態。首先，向過濾除菌的噬菌體液中加入NaCl 至終質量濃度為1.0 mol/L， 加入PEG8000 至終質量濃度為100 g/L，4 ℃ 靜置過夜。于4 ℃、12 000 g 條件離心10 min，去除上清液并用PBS 溶解沉淀，最后使用0.22 μm 濾膜過濾除菌，即可獲得濃縮的噬菌體液。然后，將濃縮的噬菌體液滴至碳涂層銅柵，靜置5 min 后使用濾紙去除多余液體，滴加20 g/mL 磷鎢酸溶液染色30 s，隨后使用濾紙去除多余液體，靜置5 min 后即可進行TEM 觀察。

1.3 噬菌體基因組測序與生物信息學分析

使用基因組DNA 抽提試劑盒對噬菌體基因組進行抽提。噬菌體基因組測序委托上海派森諾生物科技股份有限公司完成。蛋白質編碼序列（CDS）的預測通過軟件GeneMarkS（http：//topaz.gatech.edu/GeneMark/）進行，并通過數據庫NCBI Nonredundant、VFDB（Virulence Factor Database） 和CARD（ComprehensiveAntibiotic Research Database） 進行比對和注釋。基因組圈圖的繪制通過軟件CGView Server（https：//stothardresearch.ca/cgview/）完成。基于NCBItBLASTx 比對結果，通過軟件Viptree server 4.0（https：//www.genome.jp/viptree/）繪制了噬菌體的矩形蛋白質組系統發育樹構建，并對相似噬菌體進行了基因組的可視化線性比對。

1.4 噬菌體抗性菌株的分離

按1% 的接種量將大腸桿菌與其噬菌體接種至LB 培養基，37 ℃ 培養12～36 h 直至共培養液渾濁。將共培養液以4 ℃ 、8 000 g 條件離心5 min， 并用PBS 緩沖液洗滌細菌沉淀3 次。將重懸的菌液在瓊脂質量濃度為15 g/L 的LB 瓊脂培養基上進行劃線，于37 ℃ 培養箱培養24 h。挑取單菌落接種至LB 液體培養基中擴增培養。取不同單菌落的培養液均勻涂布于LB 瓊脂培養基，然后在平板上滴加1 μL 噬菌體液，觀察抑菌圈的形成情況。若無抑菌圈產生，則說明該菌株為噬菌體抗性菌，于?80 ℃ 保存。

1.5 噬菌體的適應性進化

按1% 的接種量將目標噬菌體抗性菌株和待進化噬菌體的宿主接種至LB 培養基，并按10% 的接種量將待進化的噬菌體液接種至培養液，37 ℃ 共培養12～24 h，直至共培養液渾濁。使用0.22 μm 濾膜對共培養液過濾除菌，將其作為下一輪共培養的噬菌體液，按10% 的接種量接種至LB 培養基，并按1% 接種量接種目標噬菌體抗性菌株和待進化噬菌體的宿主， 進行下一輪共培養。重復上述操作， 并依照1.4 節的實驗方法，測定每一輪的噬菌體液對目標噬菌體抗性菌株的感染能力，若產生明顯抑菌圈，說明噬菌體發生了適應性進化，隨后通過雙層平板實驗分離出進化的噬菌體株。

1.6 噬菌體的成斑效率測定和宿主譜分析

依照Kutter 的實驗方法進行噬菌體成斑效率（EOP）的測定[21]。使用LB 培養基將噬菌體以10 倍濃度進行梯度稀釋，以EHEC 或EHEC 噬菌體抗性菌株作為宿主進行噬菌體效價的測定。每個效價測定設置3 個平行。以每株噬菌體的宿主菌作為標準菌株，噬菌體EOP 為以目標菌株為宿主菌測得的效價與以標準菌株為宿主菌測得的效價的比值。

根據EOP 數值水平對噬菌體的抗菌效果進行區分。以10?6 作為EOP 數值的檢測下限， EOP gt; 10?6則認為目標噬菌體對目標宿主具有感染能力，而EOP gt;10?3 則認為目標噬菌體對目標宿主具有較強感染能力。以噬菌體株為橫坐標，以細菌菌株為縱坐標，繪制出描述噬菌體抗菌效果的宿主譜。

1.7 噬菌體的抗菌效果評價

通過生長測定儀進行噬菌體抗菌數據的采集。首先，測定噬菌體效價和細菌活菌濃度并將它們的濃度分別稀釋至108 PFU/mL 和109 CFU/mL。然后，按照感染復數（MOI）為0.1 接種2 μL 噬菌體和2 μL細菌至檢測孔板，并補加LB 液體培養基至200 μL/孔，將孔板置于生長測定儀中以37 ℃ 振蕩培養36～48 h，生長測定儀每30 min 檢測OD600，每組設置3 個平行。使用軟件GraphPad Prism 7.0 進行曲線圖和散點圖的繪制。采用獨立的雙尾t 檢驗法（Unpairedtwo-tailed Student’s t-test） 確定統計學顯著性， *為Plt;0.05，**為Plt;0.01。

2 結果與討論

2.1 大腸桿菌噬菌體的分離與特性表征

本研究從環境水樣中分離到一株大腸桿菌噬菌體，通過雙層平板法進行培養，可觀察到噬菌體具有邊緣較清晰、透明的圓形噬菌斑，結果如圖1（a） 所示。TEM 觀察結果顯示該噬菌體具有直徑約80 nm 的頭部和長度約120 nm 的非柔性尾部（圖1（b） 所示）。該噬菌體被命名為vB_EcoM_CRP22（簡稱CRP22），基因組序列已上傳至NCBI（Accession： OQ708377），根據NCBI 生物分類數據庫（NCBI Taxonomy）[22]，噬菌體CRP22 屬于Caudoviricetes 綱Ounavirinae 亞科Felixounavirus 屬。

為了考察CRP22 抑制EHEC 的潛力，本研究進行了體外抗菌效果評價，結果如圖1（c） 所示。在感染0～8 h，CRP22 能抑制EHEC 的生長，顯示了較好的抑菌效果。然而在感染后8 h，噬菌體抗性突變株快速產生導致OD600 大幅度提升，其抗菌效果明顯降低。上述結果表明在噬菌體CRP22 感染后8 h 抗菌效果較差，無法對EHEC 實現長時間抑制。

2.2 噬菌體基因組的生物信息學分析

為了解噬菌體的基因組學特征，我們對CRP22噬菌體進行了全基因組測序和生物信息學分析，結果如圖2 所示。CRP22 的基因組為dsDNA，全長為87 193 bp，GC 含量約為38.85%。在其基因組中預測得到129 個蛋白質編碼序列（CDS），其中包含9 個噬菌體結構相關CDS 和31 個代謝相關CDS，結果如圖2（a） 所示。經過數據庫VFDB（Virulence FactorDatabase）和CARD（Comprehensive Antibiotic ResearchDatabase）比對，CRP22 基因組上未發現毒力基因或抗生素抗性基因。同時，CRP22 基因組未發現整合酶基因和CRISPR 相關基因元件。上述結果表明CRP22 具有一定的安全性，是適合用于噬菌體療法的候選噬菌體株。

為了進一步了解CRP22 噬菌體的系統進化關系，本文基于NCBI tBLASTx 比對結果構建了系統發育樹，如圖2（b） 所示。CRP22 的基因組與Escherichiaphage HY02、Salmonella phage BPS17L1、Escherichiatyping phage 1 和Escherichia coli O157 typing phage12 等多株噬菌體具有較高相似性，但它們的基因排列順序具有一定的差異，結果如圖2（c） 所示。

2.3 迭代共培養實現噬菌體的適應性進化

為了進一步發揮CRP22 噬菌體的治療潛力，本研究模擬了自然界中細菌與噬菌體相互作用的過程，設計了噬菌體迭代適應性進化的方法，結果如圖3所示。本研究旨在通過該方法使噬菌體對EHEC 噬菌體抗性菌（EHEC-RB）產生感染能力，并將進化的噬菌體組合成為噬菌體雞尾酒，來提前抑制噬菌體抗性菌（RB）的產生從而提高抑菌效果。本研究進行的CRP22 噬菌體的適應性進化實驗流程示意圖如圖3（a） 所示。首先，將CRP22和EHEC 共培養一段時間，分離出一系列EHEC-RB。接下來，將CRP22、EHEC 和EHEC-RB共培養一段時間，其中，EHEC 作為CRP22 擴增的宿主菌，EHEC-RB 作為噬菌體適應性進化的壓力。在共培養的過程中使CRP22 進化為能夠感染EHEC-RB，并將噬菌體進化株（CRP22-EP）進行分離。由于噬菌體進化是一個隨機過程，無法通過一輪共培養完成，因此，在每一輪共培養結束后，將共培養液進行過濾除菌以獲得噬菌體液，重復上述流程進行迭代共培養。每天測定噬菌體液對EHEC-RB 株的感染能力直至適應性進化的發生，隨后通過雙層平板實驗分離出進化株（EP）。為了進一步獲得不同的進化株，將CRP22-EP和對應宿主菌進行共培養以獲得新的EHEC-RB 株，并將新的EHEC-RB株、CRP22-EP 株及其宿主菌重復上述共培養過程，從而獲得更多不同的噬菌體進化株。

通過上述迭代適應性進化方法，本研究共獲得了5 株EHEC-RB 株（EHEC-RB1～EHEC-RB5）和5 株CRP22-EP 株（CRP22-EP1～CRP22-EP5），并進行了宿主譜分析，結果見圖3（b）。不同的噬菌體進化株除了能感染自身的宿主菌外，還能夠感染不同的噬菌體抗性突變株。每株噬菌體進化株都顯示出了不同的宿主范圍，表明它們是不同的噬菌體株并具有宿主特異性。CRP22 和5 株CRP22-EP 的宿主范圍組合在一起覆蓋了所有EHEC 和5 株EHEC-RB。這表明， 相較于單獨使用CRP22 對EHEC 進行抗菌，CRP22 和5 株CRP22-EP 的聯合使用可能對EHEC 具有更強的抗菌效果。

2.4 噬菌體進化株雞尾酒對腸出血性大腸桿菌的抗菌效果

為了評估噬菌體進化株雞尾酒的抗菌潛力，本研究將CRP22 和CRP22-EP1～CRP22-EP5 配制成噬菌體雞尾酒，通過體外抑菌實驗對其抗菌效果進行評價，噬菌體CRP22 進化株和噬菌體雞尾酒的抗菌生長曲線圖見圖4。從6 株噬菌體中任意選取2 株噬菌體株進行等比例混合配制成Cocktail， 稱為Cocktail 2， Cocktail 2～Cocktail 6 的配制方法以此類推。結果顯示，不同Cocktail 的抗菌效果之間存在顯著差異，所選擇的噬菌體株數量越多，Cocktail 的總體抗菌效果越好。Cocktail 2 無法有效抑制EHEC，18 h 后OD600 均增長至0.8 以上。Cocktail 3 在抑菌的過程中仍然發現有大量的噬菌體抗性突變株快速生長。Cocktail 4 與Cocktail 5 表現出更好的抗菌效果，部分Cocktail 4 與Cocktail 5 能較好地抑制EHEC，在18 h 后控制OD600lt;0.4，但仍然有一些噬菌體抗性突變株生長。Cocktail 6 能夠有效抑制EHEC 的生長且無明顯的噬菌體抗性菌生長。36 h 時間點的抗菌效果如圖5 所示，由圖可見，不同Cocktail 抗菌效果存在差異性， Cocktail 噬菌體種類越多抗菌效果越好。綜上所述，噬菌體進化株的加入能夠有效提高噬菌體雞尾酒的抗菌能力和延緩噬菌體抗性突變株的生長，其中Cocktail 6 能有效控制EHEC，具有很強的抗菌效果。

3 結 論

本研究分離到一株大腸桿菌噬菌體CRP22，基因組與多株已知噬菌體存在相似性， 但是其對EHEC 的抗菌效果較弱；為了發揮CRP22 噬菌體對EHEC 的抗菌潛力，本研究開發了一種迭代適應性進化的方式，獲得了一系列能感染EHEC 抗性菌株的噬菌體進化株；將CRP22 與5 株噬菌體進化株組合成雞尾酒（Cocktail 6），其在感染后36 h 能夠有效抑制EHEC 的生長，顯著提高了CRP22 的抗菌能力。

參考文獻：

[ 1 ]JIANG L， YANG W， JIANG X， et al. Virulence-related Oislands in enterohemorrhagic Escherichia coli O157： H7[J].Gut Microbes， 2021， 13（1）： 1992237.

[ 2 ]REILLY A. Prevention and control of enterohaemorrhagicEscherichia coli （EHEC） infections： Memorandum from aWHO meeting. WHO consultation on prevention and controlof Enterohaemorrhagic Escherichia coli （EHEC） infections[J]. Bulletin of the World Health Organization， 1998，76（3）： 245-55.

[ 3 ]HAMILTON-MILLER J M. The emergence of antibioticresistance： Myths and facts in clinical practice[J]. IntensiveCare Medicine， 1990， 16（Suppl 3）： S206-S216.

[ 4 ]石竹， 劉琴， 張智慧， 等. 基于斑馬魚模型的鰻弧菌減毒活疫苗的生物安全性評價[J]. 華東理工大學學報（自然科學版）， 2011， 37（6）： 722-726.

[ 5 ]KIMMITT P T， HARWOOD C R， BARER M R. Toxingene expression by shiga toxin-producing Escherichia coli：The role of antibiotics and the bacterial SOS response[J].Emerging Infectious Diseases， 2000， 6（5）： 458-465.

[ 6 ]HAO W Z， LI X J， ZHANG P W， et al. A reviewof antibiotics， depression， and the gut microbiome[J].Psychiatry Research， 2020， 284： 112691.

[ 7 ]ANYAEGBUNAM N J， ANEKPO C C， ANYAEGBUNAMZ K G， et al. The resurgence of phage-basedtherapy in the era of increasing antibiotic resistance： Fromresearch progress to challenges and prospects[J]. MicrobiologicalResearch， 2022， 264： 127155.

[ 8 ]CHANG R Y K， NANG S C， CHAN H K， et al. Novelantimicrobial agents for combating antibiotic-resistant bacteria[J]. Advanced Drug Delivery Reviews， 2022， 187：114378.

[ 9 ]VAN NIEUWENHUYSE B， VAN DER LINDEN D，CHATZIS O， et al. Bacteriophage-antibiotic combinationtherapy against extensively drug-resistant Pseudomonasaeruginosa infection to allow liver transplantation in a toddler[J]. Nature Communication， 2022， 13（1）： 5725.

[10]BERRYHILL B A， HUSEBY D L， MCCALL I C， et al.Evaluating the potential efficacy and limitations of a phagefor joint antibiotic and phage therapy of Staphylococcusaureus infections[J]. Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America， 2021， 118（10）：e2008007118.

[11]MARTINS W， LI M， SANDS K， et al. Effectivephage cocktail to combat the rising incidence of extensivelydrug-resistant Klebsiella pneumoniae sequence type 16[J].Emerging Microbes amp; Infections， 2022， 11（1）： 1015-1023.

[12]LIU N， LEWIS C， ZHENG W， et al. Phage cocktailtherapy： Multiple ways to suppress pathogenicity[J]. Trendsin Plant Science， 2020， 25（4）： 315-317.

[13]HANAUER D I， GRAHAM M J， SEA P， et al. Aninclusive research education community （iREC）： Impactof the SEA-PHAGES program on research outcomes andstudent learning[J]. Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America， 2017，114（51）： 13531-13536.

[14]PIEL D， BRUTO M， LABREUCHE Y， et al. Phage-hostcoevolution in natural populations[J]. Nature Microbiology，2022， 7（7）： 1075-1086.

[15]HAMPTON H G， WATSON B N J， FINERAN P C. Thearms race between bacteria and their phage foes[J]. Nature，2020， 577（7790）： 327-336.

[16]KOSKELLA B， HERNANDEZ C A， WHEATLEY R M.Understanding the impacts of bacteriophage viruses： Fromlaboratory evolution to natural ecosystems[J]. Annual Reviewof Virology， 2022， 9（1）： 57-78.

[17]BORIN J M， AVRANI S， BARRICK J E， et al. Coevolutionaryphage training leads to greater bacterial suppressionand delays the evolution of phage resistance[J]. Proceedingsof the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America， 2021， 118（23）： e2104592118.

[18] ZHANG Q G， CHU X L， BUCKLING A. Overcoming the growth-infectivity trade-off in a bacteriophage slows bacterialresistance evolution[J]. Evolutionary Applications，2021， 14（8）： 2055-2063.

[19]XU Z， DING Z， SHI L， et al. Design combinations ofevolved phage and antibiotic for antibacterial guided byanalyzing the phage resistance of poorly antimicrobialphage[J]. Microbiology Spectrum， 2023， 11（5）： e0095823.

[20] ECHEVERRIA-VEGA A， MORALES-VICENCIO P，SAEZ-SAAVEDRA C， et al. A rapid and simple protocolfor the isolation of bacteriophages from coastalorganisms[J]. MethodsX， 2019， 6： 2614-2619.

[21]KUTTER E. Phage host range and efficiency of plating[J].Methods in Molecular Biology， 2009， 501： 141-149.

[22]SCHOCH C L， CIUFO S， DOMRACHEV M， et al. NCBITaxonomy： A comprehensive update on curation， resourcesand tools[J]. Database （Oxford）， 2020， 2020： baaa062.

（責任編輯：王曉麗）

基金項目： 國家杰出青年科學基金（32025038）；中央高校基本科研業務費專項資金（222201231540）