高坡豬PRKAA1基因多態性對肉質性狀的影響

易恒潔， 李 輝， 趙忠海， 楊華婷， 石 璇， 王成棟，3

(1.貴州大學動物科學學院/高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州省正安縣畜牧產業發展辦公室，貴州遵義 563400； 3.貴州省畢節市農業產業辦公室，貴州畢節 551700)

單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)具有感受細胞能量代謝變化的功能，其α亞基存在磷酸激酶活性調控區，參與某些糖的磷酸化過程，能夠調節機體細胞單糖、揮發性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)等供能物質的代謝過程[1-3]。在真核細胞動物中，AMPK家族基因包含了不同的亞基基因，它包括PRKAA1、PRKAA2、PRKB1、PRKAB2、PRKAG1、PRKAG2和PRKAG3等7個基因。Lee等研究表明，AMPK信號通路的基因已被證實能夠改變細胞的代謝并在惡性腫瘤發生過程中起著重要的作用[4]，因此，PRKAA1基因可作為大腸癌患者手術切除后的預后標志。Yuan等研究顯示，PRKAA1基因在免疫調節和炎癥反應方面發揮關鍵作用，人的該基因多態性可能使其更易感染慢性乙型肝炎病毒[5]。研究表明，PRKAA1基因屬于編碼蛋白基因，能夠在骨骼肌細胞、心肌細胞、肝臟細胞中表達。孫成娟等報道，PRKAA1基因在貴州香豬肺臟纖維細胞中的表達量極顯著高于其他細胞，而在背最長肌中的表達量最低[6]。Kim等對477例韓國人群PRKAA1基因5個異突變位點進行假設分析，結果發現PRKAA1基因的單核苷酸多態性(SNP)與患胃癌風險呈正相關[7]。目前，對于PRKAA1基因的研究主要集中于人類疾病以及一些模式生物上，對于畜禽的研究報道較為鮮見，高坡豬是貴州優良地方品種，具有肉品質好、抗逆性強、耐粗飼等特點[8]，但由于近年來外來品種的引進，加之農戶采用粗放型飼養方式養殖，人為因素過強地干預選育，高坡豬品種資源岌岌可危，本研究以高坡豬為研究對象，以期尋找有效的分子遺傳標記，為該品種進一步的開發利用、保種等提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗以高坡豬為研究對象，試驗用動物由貴州自然之園生態農業發展股份有限公司高坡豬養殖場提供，隨機抽取10月齡的50頭高坡豬進行屠宰，采集背最長肌置于冰盒帶回實驗室，-20 ℃冰箱保存備用。

1.2 基因組DNA提取

試驗采用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，分別對50頭高坡豬背最長肌中基因組DNA抽提，并用微量紫外分光光度計對所獲得的DNA進行濃度和純度測定，1.0%瓊脂糖凝膠檢測其完整性。

1.3 引物設計及PCR擴增

根據GenBank發布家豬PRKAA1基因序列，利用引物設計軟件Primer 5.0對豬PRKAA1基因設計8對特異性引物進行全部外顯子擴增，引物由上海英駿科技有限公司合成。PCR擴增反應采用30 μL體系，具體操作如下：上游引物 2 μL，下游引物2 μL，DNA模板3 μL，2×TaqPCR Master Mix(北京天根生化科技有限公司)14 μL，雙蒸水9 μL；95 ℃預變性5 min，95 ℃變性40 s，退火35 s，72 ℃延伸40 s，72 ℃終延伸10 min，32循環。基因擴增引物詳細信息見表1。

1.4 肉質測定

參照GB/T 5009.3—2003《食品中水分的測定》，用直接干燥法測定肌肉水分含量；參照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質的測定》，用微量凱氏定氮法測定粗蛋白質含量；參照GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》，用索氏抽提法測定粗脂肪含量；參照GB/T 5009.4—2003《食品中灰分的測定》，用灼燒稱質量法測定粗灰分含量。

表1 高坡豬PRKAA1基因擴增引物詳細信息

1.5 數據處理

利用Excel 2007對數據進行分類統計，DNAstar進行序列分析、比對，調用SPSS 18.0中的GLM模型對不同基因型與肉質性狀間的關聯性進行相關分析，結果以均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 PCR產物檢測

以高坡豬基因組DNA為模板，分別對8對引物進行PCR擴增，產物用1.2%瓊脂糖凝膠檢測，結果發現目的條帶與預期結果一致，且引物特異性良好，PCR產物無需純化可直接用于測序(圖1)。

2.2 PCR產物測序及序列分析

根據目的片段擴增結果，將PCR產物全部送往北京諾賽基因組研究中心有限公司進行雙向測序。測序結果經DNAstar拼接并與GenBank發布的豬PRKAA1基因序列進行校正、比對，結果在試驗群體的PRKAA1基因中發現存在3個SNPs(圖2)，分別為g.12988 T

2.3 高坡豬PRKAA1基因遺傳特性分析

測序結果經序列對比發現，在試驗群體的PRKAA1基因中找到了3個SNPs，根據3個SNPs對應的突變位置將它們分別對應的純合子和雜合子命名為TT、TC，AA、AG、GG和AA、AG、GG基因型。根據表2統計的結果，g.12988 T0.05)；除了g.12988 T

表2 高坡豬PRKAA1基因多態位點基因型頻率及等位基因頻率

2.4 PRKAA1基因與肉質性狀關聯分析

根據SNPs分型的結果，對不同基因型與肉質間的關聯性進行分析，由于g.12988 T

表3 PRKAA1基因多態位點與肉質性狀關聯分析

注：同行數據后標有不同小寫、大寫字母分別表示基因型差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。

3 討論與結論

對于養殖戶或者育種家來說，在追求動物快速增長的同時更加注重肉品質的質量。目前從人們的消費習慣來看，消費者更加注重肉質的風味，而影響肉質風味的重要指標之一則是肌內脂肪的沉積程度。有研究結果表明，PRKAA1基因對肌內脂肪的沉積起到一定的調控作用[9]，與骨骼肌的形成和肌纖維的類型也有著密切的聯系[10]。Zhong等研究結果表明，PRKKA1和PRKAA2基因可介導磷酸化乙酰輔酶A的活性，從而使機體適應高應激環境，當動物處于環境壓力較高、體內酶活性降低的時候，PRKK1和PRKAA2基因可同時介導使胚胎干細胞分化增加，彌補干細胞的數量不足，以提高動物的繁殖能力[11]。Kim等認為，PRKAA1基因的5個SNPs位點與胃癌的發生相關[7]。目前，關于PRKKA1基因的相關研究報道較少，在豬上的研究更少，孫成娟等對貴州從江香豬PRKAA1基因mRNA表達在組織中的表達情況進行探究，結果發現在其試驗所涉及的組織中均能檢測到表達，說明該基因屬于廣譜表達基因[6]。田萬強研究指出，PRKAA1基因第7外顯子上的213T/A多態位點與秦川牛肌內脂肪含量極顯著關聯(P<0.01)[12]。本研究以高坡豬PRKAA1基因為研究對象，對該基因進行PCR擴增，序列對比發現在g.12988 T

參考文獻：

[1]Huang F Y，Chiu P M，Tam K F，et al. Semi-quantitative fluorescent PCR analysis identifiesPRKAA1 on chromosome 5 as a potential candidate cancer gene of cervical Cancer[J]. Gynecologic Oncology，2006，103(1)：219-225.

[2]Loverso F，Carnio S，Vainshtein A，et al. Autophagy is not required to sustain exercise and PRKAA1/AMPK activity but is important to prevent mitochondrial damage during physical activity[J]. Autophagy，2014，10(11)：1883-1894.

[3]耿鳳豪，張 鵬，董 玲，等. AMPK-能量代謝感受器與可激活AMPK相關的藥物研究進展[J]. 心臟雜志，2014，26(1)：97-100.

[4]LeeSJ，KangB W，Chae Y S，et al. Genetic variations inSTK11，PRKAA1，andTSC1 associated with prognosis for patients with

colorectal cancer[J]. Annals of Surgical Oncology，2014，21(S4)：634-639.

[5]Yuan J，Zhang Y，Yan F T，et al. Association ofPRKAA1 gene polymorphisms with chronic hepatitis B virus infection in Chinese Han population[J]. Brazilian Journal of Infectious Diseases，2016，20(6)：564-568.

[6]孫成娟，許厚強，陳 偉，等. 貴州從江香豬FoxO4、PRKAA1基因在不同組織中的表達分析[J]. 基因組學與應用生物學，2017，35(3)：841-846.

[7]Kim Y D，Yim D H，Eom S Y，et al. Risk of gastric cancer is associated withPRKAA1 gene polymorphisms in Koreans[J]. World Journal of Gastroenterology，2014，20(26)：8592-8598.

[8]張依裕，胡 尚，周訓軍. 高坡豬種質資源特性初步研究[J]. 貴州農業科學，2008，36(5)：115-117.

[9]Tong J，Zhu M J，Underwood K R，et al. AMP-activated protein kinase and adipogenesis in sheep fetal skeletal muscle and 3T3-L1 cells[J]. Journal of Animal Science，2008，86(6)：1296-1305.

[10]任 陽. 飽和與不飽和脂肪酸對豬肌纖維組成的影響及其AMPK途徑研究[D]. 杭州：浙江大學，2014：19-40.

[11]Zhong W，Xie Y，Abdallah M，et al. Cellular stress causes reversible，PRKAA1/2-，and proteasome-dependent ID2 protein loss in trophoblast stem cells[J]. Reproduction，2010，140(6)：921-930.

[12]田萬強. 牛AMPK家族7個基因SNP檢測及其與生長和肉質性狀的關聯分析[D]. 楊凌：西北農林科技大學，2013：20-45.

[13]宋 嬌，付睿琦，李穎穎，等. 肉雞PRKAA基因表達與MyHC基因表達和肌內脂肪沉積關系的研究[J]. 中國畜牧雜志，2012，48(23)：10-13.