非洲馬瘟病毒VP7蛋白原核表達及間接ELISA抗體檢測方法的建立

張桂銘,張 敏,張 兵,王 磊,郭思凡,楊承槐

(中國獸醫藥品監察所,北京 100081)

非洲馬瘟(African horse sickness, AHS)是由非洲馬瘟病毒(African horse sickness virus, AHSV)感染引起馬、騾、驢等馬科動物出現發熱、皮下水腫及臟器出血等臨床特征的急性或亞急性傳染病,主要通過蚊、庫蜢等昆蟲傳播,感染馬匹后致死率可高達90%,對馬業的經濟損害巨大[1]。因此,該病被世界動物衛生組織(Word Organization of Animal Health,WOAH)列為法定必須報告的動物疫病。該病呈季節性地方性流行,主要在非洲撒哈拉以南地區,中東地區偶有發生。我國是WOAH認可的非洲馬瘟無疫國。近年來,在離我國邊境地區較近的東南亞地區發生多起非洲馬瘟疫情,2020年,泰國呵叻府一農場爆發了非洲馬瘟的疫情,農業農村部、海關總署發出48號公告禁止從泰國直接或間接輸入馬屬動物及相關產品等,此外,近些年我國馬匹數量的增加和國際貿易活動的增加,給我國非洲馬瘟防控增加了壓力。因此有必要針對非洲馬瘟的檢測方法做技術儲備。

AHSV屬于呼腸孤病毒科環狀病毒屬,核酸部分由10條線性雙股RNA組成,目前已發現其至少編碼了7種結構蛋白(VP1～VP7)和5種非結構蛋白(NS1、NS2、NS3、NS3a和NS4)。病毒粒子的最外層是由VP2蛋白和VP5蛋白構成的外衣殼,它們是該病毒最主要的分型抗原,決定了病毒的9種血清型。病毒粒子的主要內衣殼蛋白由位于病毒核心顆粒外表面的VP7蛋白和內表面的VP3蛋白構成,次要內衣殼蛋白由VP1,VP4和VP6構成,三個次要內衣殼蛋白構成病毒的轉錄復合體。其中,VP7蛋白在不同血清型之中高度保守,不同血清型之間VP7蛋白的氨基酸同源性高達98%[2],是AHSV血清群特異性檢測的常用靶點之一。因此本研究針對VP7蛋白構建了原核表達載體,通過原核誘導表達出VP7蛋白,純化后作為包被抗原,建立血清抗體檢測的間接ELISA方法,用以針對非洲馬瘟血清抗體檢測。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與主要試劑 AHSV 1-9型陽性血清從英國Pirbright研究所WOAH AHS參考實驗室引進;pET-28a-VP7質粒和pET-32a質粒、Vero細胞均為本實驗室保存;馬流感病毒(EIV)、馬動脈炎病毒(EAV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)、馬鏈球菌、馬沙門氏菌的陽性血清由哈爾濱獸醫研究所馬病團隊惠贈;AHSV-1細胞毒由中國獸醫藥品監察所ABSL-3實驗室保存。DH5ɑ和BL21(DE3)感受態細胞、ELISA包被液、PBST洗滌液、TMB單組份染色液、ELISA終止液均購自索萊寶公司; DNA聚合酶購自Takara;XhoⅠ和Hind Ⅲ限制性內切酶、T4 DNA連接酶購自NEB公司,DNA Marker購自Takara公司;膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自天根公司;考馬斯亮藍染色液購自蘇州博特龍生物科技有限公司;Ni-NTA預裝重力柱購自生工生物;BCA試劑盒購自賽默飛世爾科技公司;AHSV cELISA試劑盒購自青島瑞爾唯特生物技術有限公司。

1.2 重組質粒構建 通過XhoⅠ和Hind Ⅲ兩個酶切位點,分別對pET-28a-VP7和pET-32a進行雙酶切,通過1%的瓊脂糖凝膠電泳對酶切體系跑膠分析,將大小正確的VP7目的條帶和pET-32a載體通過膠回收試劑盒回收。最后將兩種酶切回收片段以目的基因和載體片段約3∶1的摩爾比例用T4 DNA Ligase進行連接,反應溫度為16 ℃,作用時間為12 h,將連接產物轉化到感受態DH5ɑ大腸桿菌中,涂布含有Amp的LB瓊脂平板,37 ℃培養過夜,挑取平板上的單克隆菌落,37 ℃搖床培養12～14 h后,提取質粒進行雙酶切驗證,最后對提取的質粒送華大基因公司測序并凍存甘油菌。

1.3 VP7蛋白的表達與鑒定 將構建成功的重組質粒pET-32a-VP7和空載的pET-32a質粒轉化蛋白表達菌株大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中進行誘導表達。取BL21(pET-32a-VP7)接種到含50 μg/mL Amp的LB培養基中,置于搖床上,37 ℃、220 r/min過夜活化,后以1∶100比例轉接于Amp的LB培養基置于37 ℃搖床,以220 r/min培養3 h,取1 mL菌液測OD600nm值,達到0.6～0.8即可加入終濃度為0.4 mmol/L誘導劑IPTG,在37 ℃下繼續誘導培養12 h,誘導結束后收集菌泥沉淀重懸,超聲破碎至溶液變得清亮不粘稠,8000 r/min離心分離包涵體沉淀和可溶性上清進行SDS-PAGE檢測,鑒定重組VP7蛋白的可溶性。使用抗His標簽的單克隆抗體和AHSV-1陽性血清對重組VP7蛋白進行Western Blot驗證,并以空載誘導的BL21(pET-32a)作為對照,驗證重組VP7的反應原性。

1.4 VP7蛋白的純化 大量誘導表達AHSV的VP7蛋白,使用Ni-NTA重力柱純化重組蛋白,目的蛋白能與鎳離子結合,其他雜蛋白通過洗滌液與目的蛋白分離,去除雜蛋白,最后通過含有咪唑洗脫液,將目的蛋白從鎳離子柱洗脫下來,得到純化后的VP7蛋白,按照BCA試劑盒說明書對得到的重組蛋白測定。

1.5 間接ELISA方法的建立 本試驗用間接ELISA方法檢測馬血清中所含的VP7抗體,將定量后的VP7蛋白作為抗原包被于固相載體上,馬的AHSV陽性血清與抗原結合。通過PBST去除未結合物,再加入HRP標記的兔抗馬的酶標抗體,最后通過加入能與酶反應的底物顯色,通過讀取OD450nm值進行判斷。操作步驟按照常規ELISA方法進行。

1.5.1 抗原最佳包被濃度和血清稀釋度的確定 應用棋盤滴定法,將純化后的VP7蛋白抗原使用ELISA包被緩沖液倍比稀釋至10、5、2.5、0.5、0.25、0.125 μg/mL共6個梯度,每孔100 μL,將陽性血清和陰性血清分別按1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200進行倍比稀釋,每孔100 μL,取陽性血清和陰性血清之比(P/N)最大時對應的包被濃度和血清稀釋度作為最佳條件。

1.5.2 抗原包被條件的確定 以確定的抗原包被濃度分別在4 ℃ 12 h、37 ℃ 1 h、37 ℃ 2 h三個條件下進行抗原包被,每種包被條件做3個重復確定最佳包被條件。

1.5.3 封閉液和封閉條件的確定 使用1% BSA溶液和5%脫脂奶粉分別在4 ℃ 12 h、37 ℃ 30 min、37 ℃ 1 h、37 ℃ 2 h條件下對酶標板的封閉確定最佳條件。

1.5.4 血清孵育時間的確定 在37 ℃下孵育0.5 h、1 h、1.5 h、2 h篩選最佳作用時間。

1.5.5 HRP二抗稀釋度與作用時間的確定 將兔抗馬-HRP抗體分別以1∶500、1∶1000、1∶2500、1∶5000倍稀釋,分別在37 ℃下孵育0.5 h、1 h、1.5 h、2 h,每個組做3個重復,確定最佳二抗作用條件。

1.5.6 底物顯色時間優化 使用TMB底物37 ℃分別避光顯色5、10、15、20 min,根據間接ELISA結果確定最佳顯色時間

1.5.7 判定標準 根據確定的AHSV VP7抗體檢測間接ELISA方法的試驗條件,取無AHSV免疫史和感染史的26份健康馬血清,用已建立的ELISA方法進行試驗,讀取OD450nm值,計算出26份陰性血清的OD450nm的平均值和標準差,計算出臨界值(陰性陽性臨界值=平均值+3倍標準差)。當樣品血清的OD450nm大于臨界值,判定為陽性;反之則判定為陰性。

1.6 敏感性、特異性和重復性試驗

1.6.1 敏感性 使用2份AHSV陽性血清以200倍開始作倍比稀釋,使用建立的AHSV VP7間接ELISA方法進行檢測,每個樣品作3個重復,根據臨界值判定該間接ELISA方法的最低檢測限。

1.6.2 特異性 使用建立的ELISA方法對幾種常見的馬病陽性血清(馬流產沙門氏菌、馬傳染性貧血病毒、馬流感病毒、馬動脈炎病毒、馬鏈球菌)和AHSV的9型陽性血清進行檢測,判斷該間接ELISA方法的特異性。

1.6.3 重復性 取同一批次包被的不同品牌ELISA板,根據建立的ELISA方法,對4份陽性血清和4份陰性血清進檢測,每個樣品作4個重復,計算平均值和標準差,變異系數=標準差/平均值。

1.7 間接ELISA的應用 采用本研究中建立的間接ELISA方法和購買的競爭ELISA試劑盒同時對云南邊境采集的56份馬血清進行檢測,對比判斷兩種方法的符合率。

2 結果與分析

2.1 重組pET-32a-VP7質粒的驗證 將構建成功的pET-32a-VP7使用XhoⅠ和Hind Ⅲ進行雙酶切鑒定,結果表明獲得與預期大小相符的目的片段(圖1),最后送公司測序表明目的片段正確并未發生突變。

M. DL15000 DNA Marker;1. pET-32a-VP7質粒

2.2 重組VP7蛋白的可溶性分析及驗證 將收集到的包涵體沉淀和裂解上清,經過SDS-PAGE和Western Blot分析,結果顯示上清和包涵體在約56 kD處均有清晰的目的條帶(圖2),重組VP7蛋白部分可溶,后續使用可溶性上清液純化重組VP7蛋白。使用抗his標簽的單克隆抗體對重組VP7蛋白進行Western Blot驗證(圖3),確認為VP7目的蛋白,同時使用AHSV-1陽性血清驗證重組VP7的反應原性,表明該重組VP7蛋白的反應原性良好(圖4)。

M.蛋白分子質量標準;1.BL21(pET-32a-VP7)超聲破碎后沉淀;2.BL21(pET-32a-VP7)超聲破碎后上清

2.3 VP7蛋白的純化 通過SDS-PAGE凝膠電泳結果可知,目的蛋白VP7以可溶性的形式存在于上清中,通過Ni重力柱對上清中的可溶性VP7蛋白進行純化。對純化后的蛋白使用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行濃度的定量測定。結果顯示純化后的蛋白無明顯雜蛋白,獲得清晰的目的條帶(圖5)。

1. 原液;2. 上樣流穿液;3-7. Wash Buffer洗滌雜蛋白;8-12. Elusion Buffer洗脫目的蛋白VP7

2.4 間接ELISA方法的建立 根據AHSV VP7抗體檢測間接ELISA條件優化結果,確定該方法的ELISA優化條件如表1,使用建立的ELISA方法對實驗室保存的26份陰性馬血清進行檢測,每個樣品作3個重復,結果如表2所示,計算他們的平均值及標準差分別為0.35和0.1129,根據統計學原理,以小于陰性樣本平均OD450nm值加3倍標準差作為臨界值時,可在99.9%水平上判定樣本為陰性,計算該ELISA方法的臨界值為0.689,大于等于該數值判定為陽性,小于該數值判定為陰性。

表1 AHSV VP7間接ELISA的條件優化結果

表2 26份陰性馬血清樣品的檢測結果

2.5 敏感性、特異型和重復性試驗 使用該間接ELISA方法對AHSV-1和AHSV-3倍比稀釋的陽性血清進行檢測,結果見表3,AHSV VP7間接ELISA方法的最大檢測稀釋倍數為6400倍和12800倍。使用5種常見的馬病陽性血清和9種AHSV陽性血清型對該ELISA方法進行特異型檢驗,表明該間接ELISA方法的特異型良好(表4)。使用該方法對AHSV的4份陽性血清和4份陰性血清進行檢測,驗證該方法的重復性,其血清的變異系數為0.8%～7.2%、2%～5.8%,均小于10%,變異程度較小,具有良好的重復性和穩定性(表5)。

表3 AHSV VP7間接ELISA的敏感性試驗

表4 AHSV VP7間接ELISA的特異性試驗

表5 AHSV VP7間接ELISA的重復性試驗

2.6 間接ELISA應用結果 使用本研究建立的間接ELISA方法和使用購買的競爭ELISA試劑盒對云南邊境馬血清樣本進行檢測,陽性對照成立,樣本檢測均為陰性,符合率為100%。

3 結論與討論

當前并無安全有效的疫苗防控非洲馬瘟,在非洲疫區主要采用多價弱毒活疫苗[3-4],但該疫苗存在基因重組導致毒力返強的風險[5-6],針對VP7的血清抗體檢測方法無法區分疫苗株和野毒感染,該疫苗在非洲疫區以外的國家均未被批準使用。

我國是WOAH認可的非洲馬瘟無疫國,檢測是防范非洲馬瘟進入我國的主要手段。國內外研究學者針對AHSV的血清學通用檢測靶點VP7建立了ELISA檢測方法,主要包括間接ELISA和競爭ELISA[7-9]。這些方法中使用的重組VP7包被蛋白主要采用大腸桿菌表達系統、桿狀病毒表達,也有研究采用植物表達系統制備重組VP7蛋白[10]。當前國際上唯一的商品化的AHSV血清抗體檢測試劑盒為西班牙英吉納公司研制的阻斷ELISA試劑盒,通過使用桿狀病毒表達的VP7蛋白和VP7特異型單克隆抗體檢測。此外,也有研究人員使用免疫微球分析法檢測血清抗體,對于臨床樣本的檢測具有更高的敏感性[11-12]。

針對VP7蛋白建立的競爭ELISA方法具有低背景和特異性的優勢,該方法依賴于特異型良好的VP7單克隆抗體[13-15]。依賴于原核表達的重組VP7蛋白建立的間接ELISA與競爭ELISA的檢測結果具有一致性,該方法更為簡單、成本更低,更適用于流行病學監測[16-18]。

當前建立的間接ELISA方法仍有一些不足,原核表達外源基因往往會在胞內聚集產生包涵體[19-21],本研究中盡管存在部分可溶性VP7重組蛋白,但仍產生了大量的包涵體蛋白,包涵體蛋白可以防止目的蛋白的降解,但包涵體純化過程需增加變性和復性步驟,因此本研究中僅使用可溶性的上清部分進行純化并使用。后續可優化調整原核表達系統,提高可溶性上清的蛋白比例。另一方面,原核表達生產的重組VP7蛋白中存在大腸桿菌源性的雜蛋白,導致其陰性的OD450nm值較高,菌體蛋白的存在可能導致檢測樣品的假陽性,該方法仍需進一步優化,同時還需大量的臨床樣本進一步驗證。

我國尚無商品化試劑盒,檢測試劑依賴進口,價格昂貴。為了防范非洲馬瘟傳入我國,有必要建立非洲馬瘟檢測技術儲備。本研究通過原核表達系統表達了保守性較高的VP7重組蛋白,利用其作為包被抗原,使用引進的WOAH非洲馬瘟參考實驗室的陽性血清建立了檢測馬血清抗體的間接ELISA方法,并對該方法進行了初步驗證,敏感性、特異型和重復性良好,使用該方法與購買的競爭ELISA試劑盒對比檢測了一批云南邊境采集的馬血清,顯示該方法具有較好的一致性,具備商品化診斷試劑盒研發潛力。

本研究建立的檢測VP7血清抗體的間接ELISA方法具有快速、靈敏、特異等特點,為非洲馬瘟的血清抗體檢測、流行病學調查提供了技術儲備。