卡巴匹林鈣水分測(cè)定法的改進(jìn)

于曉輝,王 雷,楊 星,馬秋冉

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081)

卡巴匹林鈣收載于《中國(guó)獸藥典》2020年版一部[1],其中的【水分】項(xiàng)測(cè)定方法為:取本品1.0 g,加無(wú)水甲醇與二甲基甲酰胺各15 mL,照水分測(cè)定法(附錄0832第一法A)測(cè)定。按照該方法進(jìn)行測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn),結(jié)果平行性差、無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)價(jià)產(chǎn)品中的水分含量,具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法的測(cè)定結(jié)果

從表1中的結(jié)果得知,采用現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的水分測(cè)定方法,對(duì)同一批卡巴匹林鈣樣品進(jìn)行測(cè)定時(shí),數(shù)據(jù)的平行性、重復(fù)性很差。第一次測(cè)定結(jié)果中的最大值和最小值的相對(duì)偏差高達(dá)82%;第二次測(cè)定結(jié)果中,第三份樣品的儀器測(cè)定結(jié)果為0.00%,但在實(shí)際測(cè)定過(guò)程中明確觀察到樣品消耗了滴定液,出現(xiàn)0.00%的結(jié)果,表明水分測(cè)定儀的終點(diǎn)判斷出現(xiàn)了誤差。

水分是卡巴匹林鈣質(zhì)量控制的重要項(xiàng)目,當(dāng)其中的水分值超過(guò)限度0.2%時(shí),即會(huì)造成卡巴匹林鈣加速降解,生成水楊酸等一系列降解雜質(zhì),嚴(yán)重影響產(chǎn)品的質(zhì)量[2,3]。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的方法無(wú)法真實(shí)反映卡巴匹林鈣中的水分情況,無(wú)法保證卡巴匹林鈣質(zhì)量可控。

為了更好的控制卡巴匹林鈣的質(zhì)量,我們對(duì)現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的水分測(cè)定法進(jìn)行了改進(jìn)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 701KF卡氏水分滴定儀,瑞士萬(wàn)通公司;費(fèi)休氏試液(滴定度1 mg/mL),Honeywell公司;二甲基甲酰胺,Alfa Aesar公司;無(wú)水甲醇:Honeywell公司。

1.2 試藥 供試品:共4家企業(yè)生產(chǎn)的4批卡巴匹林鈣。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 向滴定杯中分別加入二甲基甲酰胺20 mL、無(wú)水甲醇20 mL,取供試品0.1 g,精密稱(chēng)定,置于滴定杯中,攪拌5分鐘,照水分測(cè)定法(附錄0832第一法A)測(cè)定。注:連續(xù)測(cè)定4份樣品后,需更換滴定杯中的溶劑。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑中二甲基甲酰胺與無(wú)水甲醇比例的篩選通過(guò)前期的實(shí)驗(yàn)研究得知,二甲基甲酰胺-無(wú)水甲醇適合作為卡巴匹林鈣水分測(cè)定的溶劑。其中,二甲基甲酰胺作為分散劑,起到分散樣品、“釋放”水分的作用,無(wú)水甲醇參與滴定反應(yīng),起到促進(jìn)反應(yīng)順利進(jìn)行的作用。二者“各司其職”,在一定比例范圍內(nèi)協(xié)同作用,才能得到準(zhǔn)確可靠的測(cè)定結(jié)果。

因此,本研究對(duì)二甲基甲酰胺和無(wú)水甲醇的比例進(jìn)行了比較研究,按照1.3中的方法,考察在不同比例的溶劑中,分別攪拌5 min和攪拌10 min測(cè)定結(jié)果的異同。為保證研究充分、結(jié)果可靠,我們將上述過(guò)程重復(fù)測(cè)定,即,每種混合溶劑中,連續(xù)測(cè)定樣品4份,第一份攪拌5 min、第二份攪拌10 min、第三份攪拌5 min、第四份攪拌10 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 二甲基甲酰胺-甲醇不同比例時(shí)的測(cè)定結(jié)果

溶劑1:二甲基甲酰胺20 mL、無(wú)水甲醇20 mL(1∶1)

溶劑2:二甲基甲酰胺13 mL、無(wú)水甲醇27 mL(1∶2)

溶劑3:二甲基甲酰胺27 mL、無(wú)水甲醇13 mL(2∶1)

從表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知,當(dāng)以溶劑2為溶劑時(shí),攪拌5 min后的測(cè)定結(jié)果與攪拌10 min后的測(cè)定結(jié)果存在差異,攪拌10 min后的測(cè)定結(jié)果高于攪拌5 min后的。這可能是由于該混合溶劑中,二甲基甲酰胺的量較少、分散能力較弱,攪拌5 min不足以充分“釋放”卡巴匹林鈣中的水分。

當(dāng)以溶劑3為溶劑時(shí),前兩份樣品,即分別攪拌5 min和10 min的測(cè)定結(jié)果一致;但此后,攪拌5 min和攪拌10 min的測(cè)定結(jié)果出現(xiàn)差異,并且第三、第四份樣品的測(cè)定結(jié)果低于第一、第二份樣品的結(jié)果。這可能是由于溶劑3中,甲醇量較少,隨著樣品量的增加,參與滴定反應(yīng)的溶劑量減少,滴定反應(yīng)無(wú)法充分徹底進(jìn)行,以至于測(cè)定兩份樣品后,后續(xù)樣品中的水分無(wú)法被充分滴定,測(cè)定結(jié)果偏低。

當(dāng)以溶劑1,即二甲基甲酰胺-甲醇(1∶1)為溶劑時(shí),實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定,平行性良好,攪拌5 min和攪拌10 min的測(cè)定結(jié)果基本一致,重復(fù)測(cè)定4份樣品的結(jié)果也一致。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,改進(jìn)后的方法中,二甲基甲酰胺和無(wú)水甲醇的比例應(yīng)為1∶1。

2.2 加入樣品后攪拌時(shí)間的選擇 卡巴匹林鈣在二甲基甲酰胺-無(wú)水甲醇中的溶解性較差,為保證其在上述溶劑中被充分分散、樣品中的水分被充分“釋放”出來(lái),加入樣品后、開(kāi)始滴定前應(yīng)對(duì)溶劑杯中的樣品充分?jǐn)嚢琛?/p>

本研究按照1.3中的方法,對(duì)樣品加入滴定杯后的攪拌時(shí)間進(jìn)行了比較研究,結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同攪拌時(shí)間的測(cè)定結(jié)果

從表3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知,加入樣品后立即滴定(0 min)的水分值明顯低于攪拌一定時(shí)間后再滴定的結(jié)果;攪拌5 min后再滴定的結(jié)果與攪拌10 min、15 min、20 min的結(jié)果一致,實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,攪拌5 min即能將卡巴匹林鈣樣品中的水分充分“釋放”出來(lái)。所以,本研究最終選擇加入樣品后攪拌5 min再進(jìn)行滴定。

2.3 取樣量的選擇 經(jīng)過(guò)前期實(shí)驗(yàn)研究得知,將取樣量降低至0.1 g并以二甲基甲酰胺+無(wú)水甲醇為溶劑時(shí),測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定、平行性良好。為了更好的確定卡巴匹林鈣的取樣量,我們按照1.3中的方法,比較研究了0.05 g、0.1 g和0.2 g三種取樣量,結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同取樣量時(shí)的測(cè)定結(jié)果

從表4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知,當(dāng)取樣量為0.05 g時(shí),數(shù)據(jù)的平行性較差,最大值和最小值的相對(duì)偏差約為35%。所以,0.05 g不適合作為該方法的取樣量。

當(dāng)取樣量為0.2 g時(shí),數(shù)據(jù)的平行性良好,最大值與最小值的相對(duì)偏差約為6%。但是,0.2 g取樣量時(shí),一份樣品測(cè)定完成后,儀器約需5 min才能達(dá)到平衡狀態(tài)(condition),這可能是由于取樣量較大,樣品中的水分未能在短時(shí)間內(nèi)被完全滴定,從而造成滴定延遲。

當(dāng)取樣量為0.1 g時(shí),測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定,數(shù)據(jù)平行性良好,最大值與最小值的相對(duì)偏差約為4%;一份樣品測(cè)定完成后,僅需約1 min,儀器即達(dá)到平衡狀態(tài)(condition)。所以,本研究最終選擇0.1 g作為改進(jìn)方法的取樣量。

2.4 連續(xù)測(cè)定樣品份數(shù)驗(yàn)證 通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),隨著滴定杯中樣品量的逐漸增加,連續(xù)測(cè)定多份樣品時(shí),結(jié)果的平行性和準(zhǔn)確性有變差的趨勢(shì)。為保證連續(xù)測(cè)定時(shí)結(jié)果準(zhǔn)確,我們按照1.3中的方法,對(duì)連續(xù)測(cè)定樣品的份數(shù)進(jìn)行了考察,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 連續(xù)測(cè)定6份樣品時(shí)的測(cè)定結(jié)果

從表5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知,在40 mL溶劑中,連續(xù)測(cè)定6份樣品時(shí),前5份結(jié)果的平行性良好,最大值和最小值的相對(duì)偏差約為5%;第6份結(jié)果的準(zhǔn)確性出現(xiàn)變差趨勢(shì),這可能是由于加入的樣品量較大,超出了40 mL溶劑的分散能力和反應(yīng)能力,此時(shí)需要更換滴定杯中的溶液,重新加入溶劑后再進(jìn)行測(cè)定。

為保證連續(xù)測(cè)定結(jié)果的可靠性,改進(jìn)后的方法規(guī)定“連續(xù)測(cè)定4份樣品后,需更換滴定杯中的溶劑。”

2.5 滴定杯中溶劑量的選擇 通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)得知,溶劑量越大,可以測(cè)定的樣品份數(shù)越多、越容易得到平行性良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

常見(jiàn)滴定杯的容量約為100 mL,如果向其中加入的溶劑量超過(guò)50 mL,隨著費(fèi)休氏試液標(biāo)定和樣品測(cè)定實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行,容易出現(xiàn)杯中溶劑量過(guò)多、杯中溶液倒吸等現(xiàn)象。

綜合考慮,本研究最終選擇40 mL溶劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.6 樣品測(cè)定 按照1.3中的方法對(duì)四批樣品進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 應(yīng)用改進(jìn)后方法的測(cè)定結(jié)果

從表6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知,應(yīng)用改進(jìn)后的水分測(cè)定法對(duì)四批樣品進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果穩(wěn)定,數(shù)據(jù)平行性良好,表明改進(jìn)后的方法徹底解決了現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中卡巴匹林鈣水分測(cè)定法存在的數(shù)據(jù)平行性差、結(jié)果混亂異常的問(wèn)題。

2.7 與其他水分測(cè)定法的比較 為了進(jìn)一步驗(yàn)證改進(jìn)后方法的準(zhǔn)確性,我們分別采用60 ℃減壓干燥失重法和氣相色譜法(《中國(guó)獸藥典》附錄0832 第三法)對(duì)四批卡巴匹林鈣樣品中的水分進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表7和表8。

表7 減壓干燥失重法水分測(cè)定結(jié)果

表8 氣相色譜法水分測(cè)定結(jié)果

卡巴匹林鈣對(duì)溫度敏感,在高溫下易產(chǎn)生降解,生產(chǎn)企業(yè)通常采用80 ℃的溫度對(duì)生產(chǎn)得到的原料進(jìn)行干燥。為保證測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確,本研究采用60 ℃減壓干燥的方式對(duì)4批卡巴匹林鈣樣品進(jìn)行干燥失重測(cè)定。

從表7的實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知,采用60 ℃減壓干燥失重法測(cè)定時(shí),前三批產(chǎn)品的測(cè)定結(jié)果與改進(jìn)后方法的測(cè)定結(jié)果一致,均為0.1%;樣品4的測(cè)定結(jié)果(0.8%～1.5%)與改進(jìn)后方法的測(cè)定結(jié)果(0.6%)差異明顯。

之所以出現(xiàn)上述差異,是由于被測(cè)樣品的降解程度不同造成的。通過(guò)HPLC實(shí)驗(yàn)結(jié)果[1,4]得知,前三批樣品中雜質(zhì)含量很少,主要雜質(zhì)-水楊酸的含量約為0.2%～0.4%;而樣品4中雜質(zhì)含量多,主要雜質(zhì)-水楊酸的含量約為20%。水楊酸在70 ℃的條件下即會(huì)發(fā)生升華,在60 ℃減壓干燥條件下,樣品4中的水楊酸不斷升華,從而造成其干燥失重結(jié)果高于改進(jìn)后方法的測(cè)定結(jié)果,并且其干燥8小時(shí)后仍未達(dá)到恒重。前三批樣品測(cè)定過(guò)程中,受到雜質(zhì)干擾少,所以,這三批樣品的干燥失重結(jié)果與改進(jìn)后方法的測(cè)定結(jié)果一致。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)卡巴匹林鈣樣品合格、雜質(zhì)水楊酸的量較少時(shí),60 ℃減壓干燥的方式可以準(zhǔn)確測(cè)定樣品中的水分值。但當(dāng)樣品降解嚴(yán)重、雜質(zhì)水楊酸的量較多時(shí),60 ℃減壓干燥的方法不能準(zhǔn)確測(cè)定其中的水分。

所以,60 ℃減壓干燥失重法用作卡巴匹林鈣的水分測(cè)定時(shí),適用范圍較窄。

從表8的實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知,采用氣相色譜法測(cè)得的卡巴匹林鈣樣品中的水分值明顯低于改進(jìn)后方法的測(cè)定結(jié)果,這是由于熱導(dǎo)檢測(cè)器的靈敏度較低造成的。所以,附錄0832第三法 氣相色譜法不適合作為水分限度值較低的卡巴匹林鈣水分測(cè)定方法。

3 討 論

為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可靠,我們進(jìn)行了如下三方面的工作:為了排除樣品不均勻?qū)y(cè)定結(jié)果造成影響,實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,我們將樣品充分混勻;為了排除溶劑“不新鮮”而對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響,每次實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,我們均更換滴定杯中的溶劑;為了排除儀器不穩(wěn)定對(duì)測(cè)定結(jié)果造成影響,每次測(cè)定樣品前,我們均應(yīng)用該儀器對(duì)費(fèi)休氏試液進(jìn)行標(biāo)定,當(dāng)連續(xù)三次標(biāo)定結(jié)果相對(duì)偏差≤1.0%時(shí),才開(kāi)始樣品測(cè)定。

卡爾費(fèi)休氏滴定反應(yīng)受pH值影響,5～7.5是理想的pH值范圍。我們?cè)詾榭ò推チ肘}偏酸性是造成測(cè)定結(jié)果平行性差的原因,但是,當(dāng)我們向溶劑中添加了20%～30%的咪唑緩沖鹽后,實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍然不理想,最大值和最小值的相對(duì)偏差在20%～30%的范圍內(nèi)。驗(yàn)證結(jié)果表明,卡巴匹林鈣偏酸性不是現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定結(jié)果平行性差的主要原因。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得知,現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定結(jié)果平行性差的主要原因是卡巴匹林鈣中的Ca2+與費(fèi)休氏試液滴定過(guò)程中產(chǎn)生的SO42-結(jié)合形成CaSO4沉淀, CaSO4沉淀顆粒細(xì)小、附著力強(qiáng),當(dāng)卡巴匹林鈣樣品量大(1.0 g)時(shí),生成的CaSO4沉淀量亦較大,滴定杯中的溶劑無(wú)法充分分散生成的沉淀,以致沉淀覆蓋電極表面,造成電極靈敏度變差、無(wú)法正常指示滴定終點(diǎn),從而導(dǎo)致滴定結(jié)果異常。

甲酰胺是費(fèi)休氏水分測(cè)定法中最推薦使用的強(qiáng)分散劑,但是,我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究證明,甲酰胺不適于用作卡巴匹林鈣水分測(cè)定時(shí)的分散劑。

采用水分測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定時(shí),當(dāng)?shù)味w積占滴定管總體積的10%～90%,即可保證滴定結(jié)果的準(zhǔn)確性。目前,水分測(cè)定儀滴定管的最小體積為1 mL,所以,當(dāng)?shù)味w積大于0.1 mL即可滿(mǎn)足方法準(zhǔn)確性的要求。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推算得知,當(dāng)水分測(cè)定值為0.2%時(shí),0.1 g取樣量消耗的滴定液(滴定度1 mg/mL)體積約為0.2 mL,滿(mǎn)足方法準(zhǔn)確性的要求。

溶劑二甲基甲酰胺、無(wú)水甲醇應(yīng)于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前分別加入滴定杯中,不可將二者提前混合在一起,因?yàn)榧柞０奉?lèi)化合物易與醇類(lèi)化合物發(fā)生副反應(yīng),尤其在光照條件下,二者的副反應(yīng)會(huì)加速發(fā)生,以致滴定杯中的溶液呈現(xiàn)“果凍狀”,嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。

雖然溶劑中采用二甲基甲酰胺作為分散劑,以減少滴定反應(yīng)過(guò)程中生成的CaSO4沉淀對(duì)電極的覆蓋,但是,為了更好的去除電極表面可能覆蓋的沉淀,建議實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,用粗糙的濾紙等擦拭電極鉑片,以保持電極的靈敏度。

本研究未采用卡式爐升溫的方式提取樣品中的水分。因?yàn)榭ò推チ肘}高溫下易降解,主要降解產(chǎn)物是水楊酸,水楊酸在70 ℃發(fā)生升華。如果采用卡式爐升溫加熱的方式對(duì)卡巴匹林鈣中的水分進(jìn)行提取,會(huì)造成降解產(chǎn)物水楊酸進(jìn)入水分測(cè)定系統(tǒng)中,從而對(duì)水分測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生明顯干擾。

本研究采用容量法對(duì)卡巴匹林鈣中的水分進(jìn)行測(cè)定,而未采用庫(kù)倫法,主要原因有以下兩方面:①經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,容量法的測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠,滿(mǎn)足卡巴匹林鈣質(zhì)量控制的要求;②相比于庫(kù)倫法水分測(cè)定儀,容量法水分測(cè)定儀造價(jià)低廉,普及率廣,尤其在各企業(yè)實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用廣泛。為節(jié)約企業(yè)生產(chǎn)成本,最終改進(jìn)后的方法采用了容量法。

采用雜質(zhì)含量較多的樣品4進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。卡巴匹林鈣易降解生成水楊酸,而水楊酸對(duì)水分測(cè)定結(jié)果干擾明顯。為保證改進(jìn)后的方法具有良好的耐用性,本研究采用雜質(zhì)含量較多、尤其水楊酸含量較多的樣品4進(jìn)行方法開(kāi)發(fā)和方法驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

研究改進(jìn)了卡巴匹林鈣水分測(cè)定法,解決了現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法數(shù)據(jù)平行性差、無(wú)法反映產(chǎn)品中水分的真實(shí)情況等問(wèn)題。

相比于減壓干燥失重法和氣相色譜法,改進(jìn)后的方法適用范圍廣、靈敏度高、易于推廣普及,適用于卡巴匹林鈣中的水分測(cè)定。