吳屯楊PwHB7基因的克隆及生物信息學分析

摘" " 要：為探究吳屯楊PwHB7基因的生物學特征及功能，以吳屯楊為材料，利用RT-PCR技術(shù)克隆吳屯楊PwHB7基因的cDNA全長序列，并通過生物信息學方法分析PwHB7全長序列的特征。結(jié)果表明：吳屯楊PwHB7基因開放閱讀框（open reading frame， ORF）長度為717 bp，編碼238 個氨基酸。二級結(jié)構(gòu)預測表明：PwHB7蛋白主要由α螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角組成。理化性質(zhì)分析表明：該蛋白由C、H、O、N、S組成，理論等電點為4.93，脂肪指數(shù)為60.67?？缒^(qū)分析表明：該蛋白為非跨膜蛋白。磷酸化位點分析表明：絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸可能成為磷酸化位點。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明：PwHB7基因與毛果楊PtHB7基因的親緣關(guān)系最近。該結(jié)果為解析PwHB7基因響應干旱脅迫的分子機制奠定了基礎，為吳屯楊抗旱育種提供新思路。

關(guān)鍵詞：吳屯楊；PwHB7基因；克隆；序列分析

中圖分類號：S792.11" " " " 文獻標識碼：A" " " " DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2024.06.001

Cloning and Bioinformatics Analysis of PwHB7 Gene in Populus wutunensis

ZHANG Ke， SUN Jingliang， LI Guojiao， JIN Bozhong， HU Yurui， XING Xiaoyu

（College of Environment and Resources， Dalian Minzu University， Dalian， Liaoning 116600， China）

Abstract：To explore the biological characteristics and functions of the PwHB7 gene in Populus wutunensis， this study used Populus wutunensis as the material， cloned the cDNA full-length sequence of the PwHB7 gene using RT-PCR technology， and analyzed the characteristics of the PwHB7 full-length sequence through bioinformatics methods. The results showed that the open reading frame （ORF） length of the PwHB7 gene in Populus wutunensis was 717 bp， encoding 238 amino acids. Secondary structure prediction indicates that PwHB7 protein was mainly composed of α-helix， irregular coil， extended chain， and β-turn. Physical and chemical analysis showed that the protein was composed of C， H， O， N， and S components， with a theoretical isoelectric point of 4.93 and a fat index of 60.67. Transmembrane analysis indicated that the protein was a non transmembrane protein. Phosphorylation site analysis suggested that serine， threonine， and tyrosine mighot become phosphorylation sites. Phylogenetic tree analysis showed that the PwHB7 gene had the closest genetic relationship with Populus trichocarpa PtHB7. This result lays the foundation for analyzing the molecular mechanism of PwHB7 gene's response to drought stress and provided new ideas for drought resistant breeding of Populus wutunensis.

Key words： Populus wutunensis; PwHB7 gene; cloning; sequence analysis

同源異型域-亮氨酸拉鏈蛋白（Homeodomain-leucine Zipper，HD-Zip）是一類HD轉(zhuǎn)錄因子，也是一類高等植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子，其特征為包含一個同源異型域（Homeodomain，HD）和一個亮氨酸拉鏈（Leucine Zipper，LZ）。根據(jù)氨基酸序列同源性的差異，植物中 HD-Zip 轉(zhuǎn)錄因子可分為四大類亞家族，分別是 HD-Zip I、HD-Zip II、HD-Zip III 和 HD-Zip IV[1]，其中第Ⅰ類和第Ⅱ類的轉(zhuǎn)錄因子較多。HD-Zip Ⅰ亞家族的蛋白相對其他家族更簡單，該類家族C端存在的AHA保守序列使其形成雙親螺旋結(jié)構(gòu)，并且?guī)в须姾?，使C端具有激活轉(zhuǎn)錄功能，與非生物脅迫、脫落酸（abscisic acid，ABA）應答、胚胎發(fā)生等有緊密的關(guān)聯(lián)[2]。HD-Zip Ⅱ亞家族蛋白N末端存在保守的L×L×L結(jié)構(gòu)域（Leu×Leu×Leu）和ZIBEL（zinc finger BEL1-like homeodomain）結(jié)構(gòu)域[3]，使其與光形態(tài)建成和生長素應答等有關(guān)聯(lián)。而HD-Zip Ⅲ與HD-Zip Ⅳ亞家族都有START（steroidogenic acute regulatory protein-related lipid transfer）和HD-SAD（START-adjacent domain）結(jié)構(gòu)域[4-5]，主要控制葉的發(fā)育、胚胎和植物分生組織的發(fā)育，參與花青素的積累、根的生長等[6]。

研究表明，HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子主要調(diào)控植物的發(fā)育過程，并參與調(diào)控外界信號來調(diào)節(jié)植物生長[6]。在植物中，HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因在植物的根、莖、葉、花和各種生長發(fā)育階段中表達，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）在營養(yǎng)生長階段和生殖生長階段，ATHB2、ATHB7基因的表達量較高，ATHB5、ATHB6在葉、根和花中調(diào)控植物的生長，并在其成熟階段表達[6]。在調(diào)控植物抗病性、影響植物微管和胚的發(fā)育方面，HD-Zip也具有一定的作用[5]。一些同源異型域-亮氨酸拉鏈蛋白可以與脫落酸受體結(jié)合，參與ABA信號轉(zhuǎn)導途徑，從而影響植物對干旱、鹽脅迫等逆境的響應。例如，擬南芥在干旱脅迫或ABA處理下，ATHB6基因的表達有明顯的上調(diào)趨勢[7]，HD-Zip I亞家族中的擬南芥ATHB7和ATHB12基因能與植物信號轉(zhuǎn)導聯(lián)系，并在干旱脅迫中起重要作用[5-8]。HD-Zip I轉(zhuǎn)錄因子在植物抵御非生物脅迫中存在正調(diào)控和負調(diào)控作用。有研究證實，在水稻（Oryza sativa）和擬南芥中，對玉米Zmhdz10 基因進行過表達，會增加植株的抗鹽和抗旱能力，玉米Zmhdz10 基因在此過程中起正調(diào)控作用[9]，而在NaCl和ABA脅迫下，過表達紫花苜蓿MsHB2基因的擬南芥植株生長被抑制，MsHB2起負調(diào)控作用[10]。

楊樹（Populus L.）是楊柳科楊屬植物，以根系發(fā)達、枝干挺拔、樹葉繁茂、生命力頑強而聞名，具有較強的抗逆性，使其能夠在極端環(huán)境下維持生存和繁衍。作為我國的重要樹種之一，楊樹可以作為保護農(nóng)田的防護林、造物發(fā)電的用材林、防風固沙的水土保持林、街道的四旁綠化。如今防風固沙、綠化造林等維持生態(tài)可持續(xù)發(fā)展的任務仍迫在眉睫，所以培育出適宜在惡劣條件下保持較快生長和繁殖、抗性強的楊樹新品種，并利用其肥沃土壤、綠化環(huán)境、植樹造林，對于我國較為干旱，甚至極度干旱條件下的東北、華北、西北一類民族地區(qū)來說，具有非常重要的意義[11]。吳屯楊（Populus wutunensis）是2008年通過遼寧省林木新品種鑒定出的小鉆類楊樹品種，它的生長速度較快、樹干筆直、木質(zhì)良好、產(chǎn)量高，還具有抗干旱、耐鹽堿等特征，即便是在缺乏營養(yǎng)的貧瘠的土地上，也可以茁壯成長[11-13]。吳屯楊在營造防護林方面也是極具發(fā)展?jié)摿Φ臉浞N之一[11]。為了探究吳屯楊抗旱的分子機制，前期對吳屯楊幼苗干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行了分析，篩選到受干旱脅迫表達量上調(diào)的吳屯楊同源異型域-亮氨酸拉鏈蛋白基因PwHB7，本研究克隆PwHB7基因，利用生物信息學方法分析其蛋白的結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)，給解析吳屯楊抗旱的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究供試材料是吳屯楊幼苗，由大連民族大學實驗基地種植。

1.2 吳屯楊總RNA提取及cDNA第一條鏈合成

吳屯楊葉片總RNA提取使用天根RNA prep Pure植物總RNA提取試劑盒DP432，cDNA第一條鏈合成使用艾科瑞生物Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒，cDNA于-20 ℃條件下保存。

1.3 吳屯楊PwHB7基因克隆

根據(jù)課題組前期獲得的吳屯楊轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，篩選出吳屯楊PwHB7基因序列。利用線上工具Primer5.0設計引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

F：ACTAGGGTCTCGCACCATGTTTGATGGAGT

AGAATATTCTCCTTCAGCAAC；

R：ACTAGGGTCTCTACCGTCAAGCCCAGAAAT

CCCACCAC。

以cDNA為模版進行PCR擴增，擴增體系為：2x PCR buffer 25 μL，2 mM dNTPs 10 μL，cDNA 1 μL，正、反向引物各1 μL， KOD酶1 μL，ddH2O 11 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s；58 ℃退火30 s；68 ℃延伸1 min，32 個循環(huán)；68 ℃延伸5 min。使用PCR產(chǎn)物進行測序（生工生物工程股份有限公司，上海）。

1.4 生物信息學分析

本研究使用Expasy ProtParam軟件分析氨基酸的組成及分子量、脂肪指數(shù)、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)等理化性質(zhì)，使用TMHMM2.0軟件和NetPhos-3.1 Server網(wǎng)站對蛋白跨膜區(qū)和蛋白序列中可能存在的磷酸化位點進行分析，利用SOPMA在線軟件和Swiss Model軟件預測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，利用NCBI網(wǎng)站的BLAST工具對與PwHB7蛋白同源性較高的HB7蛋白進行篩選與同源對比，使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 吳屯楊PwHB7基因的克隆

本研究從吳屯楊葉片中提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，以cDNA為模板進行RT-PCR擴增，獲得目標產(chǎn)物，通過電泳檢測其長度約為700 bp（圖1），這與預期結(jié)果相符合。將PCR產(chǎn)物送樣測序，測序結(jié)果顯示，PwHB7基因ORF的序列長度為717 bp（圖2），編碼238 個氨基酸，經(jīng)比較，測序序列與目的序列結(jié)果一致。

2.2 PwHB7蛋白的理化性質(zhì)分析

本研究使用Expasy ProtParam在線軟件對PwHB7基因編碼的蛋白質(zhì)進行理化性質(zhì)的分析。分析結(jié)果表明，PwHB7蛋白由C、H、O、N、S共5種原子組成，原子總數(shù)為3 775，相對分子量為27 290.38 KDa，其分子式為C1186H1860N328O391S10，理論等電點為4.93，是1個含有238" 個氨基酸的蛋白質(zhì)，谷氨酸含量最多，占12.6%。正電荷（Arg+Lys）殘基總數(shù)為33，負電荷（Asp+Glu）殘基總數(shù)為43。吳屯楊PwHB7蛋白的半衰期較短，脂肪指數(shù)為60.67，不穩(wěn)定系數(shù)值為61.88，超過40的臨界線，為不穩(wěn)定蛋白。

2.3 PwHB7蛋白跨膜區(qū)分析

跨膜區(qū)是蛋白質(zhì)序列中跨越細胞膜的部分，由疏水氨基酸組成，可以更好地融入細胞膜的脂質(zhì)雙層中。含有跨膜區(qū)的蛋白質(zhì)作為膜受體發(fā)揮作用或者作為細胞膜上的膜蛋白。本研究使用TMHMM軟件對PwHB7編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行跨膜區(qū)的分析。結(jié)果顯示，預測的跨膜螺旋數(shù)量為0，跨膜螺旋氨基酸殘基數(shù)量的期望值為0.001 83，預測PwHB7蛋白為非跨膜蛋白（圖3）。

2.4 PwHB7蛋白磷酸化位點分析

本研究使用NetPhos-3.1 Server在線軟件對吳屯楊PwHB7蛋白進行磷酸化位點預測。結(jié)果顯示，PwHB7蛋白中潛在的蛋白激酶磷酸化位點有絲氨酸（Ser）29 個、蘇氨酸（Thr）9 個、酪氨酸（Tyr）5 個（圖4）。

2.5 吳屯楊PwHB7蛋白二級結(jié)構(gòu)的預測

本研究通過 SOPMA 在線軟件預測PwHB7蛋白序列的二級結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，PwHB7 蛋白由無規(guī)則卷曲、α螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角組成。其中，存在較多的是α螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)元件，分別有95 個（占39.92%）和128 個（占53.78%）；存在較少的是延伸鏈和β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)元件，分別有12 個（占5.04%）和3 個（占1.26%）（圖5）。這表明吳屯楊PwHB7蛋白二級結(jié)構(gòu)元件主要以α螺旋和無規(guī)則卷曲的形式存在。

2.6 吳屯楊PwHB7蛋白三級結(jié)構(gòu)的預測

本研究使用Swiss Model在線軟件對吳屯楊PwHB7蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行同源建模分析。經(jīng)過序列比對，以A0A4U5Q0C5.1.A為模板進行同源建模，得到 PwHB7蛋白的一個三級結(jié)構(gòu)模型（圖6）。該模型主要由α螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角組成。

2.7 系統(tǒng)進化分析

本研究使用NCBI查找PwHB7蛋白的同源蛋白，獲得銀白楊（Populus alba L.）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、黑楊（Populus nigra）、柳橙（Citrus sinensis）胡楊（Populus euphratica）、毛白楊（Populus tomentosa ）、葡萄（Vitis vinifera）、毛果楊（Populus trichocarpa）、雷公藤（Tripterygium wilfordii）等物種的同源蛋白序列并進行多序列比對，使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖7）。結(jié)果表明，吳屯楊PwHB7蛋白與毛果楊親緣關(guān)系最近，與雷公藤親緣關(guān)系最遠。

3 討論與結(jié)論

紫花苜蓿MsHB7基因可以通過直接或間接的調(diào)節(jié)方式來調(diào)控抗逆基因的表達水平，以提高植物對干旱的耐受性[7]。蘋果MdHB-7基因通過促進干旱引起的內(nèi)源性ABA積累從而關(guān)閉氣孔，進而提高蘋果植株對干旱的耐受性和水分利用效率[14]。研究表明，HD-Zip Ⅰ亞家族成員與干旱脅迫等非生物脅迫有關(guān)[15]，楊樹中同源異型域-亮氨酸拉鏈蛋白促使維管細胞數(shù)量增多，促進根的生長發(fā)育，調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉，在莖中的表達量較高[15]，從而提高抗旱性。

吳屯楊PwHB7與毛果楊PtHB7所編碼的氨基酸序列的理化性質(zhì)十分相似。從等電點上看，吳屯楊PwHB7蛋白等電點略低于毛果楊PtHB7蛋白；從ORF長度來看，二者長度相等；從編碼氨基酸數(shù)量來看，二者數(shù)量也相等。2個基因所編碼的氨基酸中，谷氨酸的含量最多，但是毛果楊PtHB7蛋白的谷氨酸含量有29 個，本研究克隆得到的PwHB7蛋白的谷氨酸含量有30 個。對PwHB7基因進行生理指標分析可知，該基因等電點為酸性，且脂肪系數(shù)在51.23以上，疏水性平均系數(shù)為負值，說明該蛋白是熱穩(wěn)定性較高的親水性蛋白，由于其特殊的理化性質(zhì)，PwHB7基因表現(xiàn)出較強的脅迫應答能力。有研究表明，這種較強的脅迫應答能力可能受到HD-Zip I亞家族中轉(zhuǎn)錄因子的HD和LZ結(jié)構(gòu)域的影響[16]。

以上研究表明，雖然在近緣物種中，PwHB7基因保持著較高的遺傳穩(wěn)定性，但是在不同的物種上基因序列差異依舊較大。已有研究主要針對擬南芥、玉米、蘋果等開展HD-Zip研究，而對楊樹進行HD-Zip的研究較少。然而對于植樹造林工程來說，楊樹卻是必不可少的，HD-Zip的抗逆境脅迫特性也與當前的環(huán)境需求較為貼合。雖然吳屯楊在耐鹽堿方面有較多研究，但在耐旱相關(guān)基因方面研究較少。本研究通過對吳屯楊PwHB7基因進行生物信息學分析，為進一步探究吳屯楊等楊樹的HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白在抗逆境脅迫方面的影響提供了有利依據(jù)。

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