鐵皮石斛接種菌根真菌的生理效應研究

摘要要：【目的】探究不同菌根真菌與鐵皮石斛共生的菌根效應，揭示共生生理效應，為石斛菌根化栽培提供理論依據。【方法】以鐵皮石斛組培苗為研究對象，在其根部接種耐鹽枝孢霉菌（Cladosporium halotolerans，Ch）和石斛小菇（Mycena dendrobii，Md）2種菌根真菌，分析菌根真菌對鐵皮石斛生長發育、生物活性物質以及糖轉運情況的影響。【結果】在鐵皮石斛組培苗接種菌根真菌10 d后，根部表面出現褐化現象，在根部皮層細胞內形成具有螺旋狀或念珠狀結構的菌絲結。接種Md和Ch后鐵皮石斛生物量變化均不顯著。接種Md后地上部和地下部生物堿含量顯著提高，分別比未接種處理提高21.74%和18.75%，地上部總黃酮含量提高30.00%；接種Md后地上部果糖含量顯著提高25.00%，并促進地上部葡萄糖和蔗糖轉運到地下部。鐵皮石斛接種Ch地上部生物堿含量顯著提高12.77%，而地下部生物堿含量顯著降低43.75%；地上部和地下部總黃酮含量分別降低27.12%和50.91%；接種Ch地上部果糖含量顯著提高30.00%，促進地下部蔗糖轉運到地上部。【結論】鐵皮石斛接種菌根真菌10d已形成共生關系，菌根真菌調節鐵皮石斛生物堿和總黃酮等生物活性物質的生成，促進果糖、葡萄糖和蔗糖的轉運。

關鍵詞：鐵皮石斛；菌根效應；生長發育；生物活性物質；糖轉運

中圖分類號：S567.239" " " " " " " " " " "文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " 文章編號：2095-5774（2024）02-0117-08

Physiological Effects of Inoculation of Mycorrhizal Fungi on Dendrobium officinale

Yu Yuxiao1，Zheng Beihua2，Wang Hechuan3，Li Hua1，Liu Jianfu1*，Wu Xinquan4

（1 Institute of Horticultural Science and Engineering，Huaqiao University，Xiamen，Fujian 361021，China;

2 Quanzhou Forestry Bureau，Quanzhou，Fujian 362000，China;

3 Quanzhou Crop Production Technology Station，Quanzhou，Fujian 362000，China;

4 Quanzhou Quanfeng Biotechnology Co.，Ltd.，Quanzhou，Fujian 362021，China）

Abstract：【Objective】To investigate the mycorrhizal effects of different fungi in symbiosis with Dendrobium officinale，reveal the physiological effects of orchid mycorrhizal symbiosis，and provide theoretical basis for mycorrhizal cultivation of Dendrobium officinale.【Method】Using tissue culture seedlings of Dendrobium officinale as the research object，two mycorrhizal fungi，Cladosporium halotolerans（Ch）and Mycena dendrobii（Md），were inoculated to analyze their effects on the growth and development，bioactive substances，and sugar transport of Dendrobium officinale.【Result】After 10 days of inoculation with two types of fungi in the tissue culture seedlings of Dendrobium officinale，mycelial nodules with spiral and moniliform structures were formed in the cortical cells of the roots，and browning appeared on the surface of the Dendrobium officinale roots. Following inoculation with Md and Ch，no significant change was observed in the biomass of Dendrobium officinale；Following inoculation with Md，the alkaloid content in both the aboveground and underground parts rose by 21.74% and 18.75%，respectively，with the total flavonoid content in the aboveground parts increasing by 30%；Inoculation with Md led to a 25.00% increase in fructose content in the aboveground parts and facilitated the transport of glucose and sucrose from the aboveground to the underground parts. Inoculation with Ch led to a 12.77% increase in alkaloid content in the aboveground parts of Dendrobium officinale，but a 43.75% decrease in the underground parts；The total flavonoid content decreased by 27.12% in the aboveground parts and 50.91% in the underground parts；Inoculation with Ch resulted in a 30.00% increase in fructose content in the aboveground parts and facilitated the transport of sucrose from the underground to the aboveground parts. 【Conclusion】After being inoculated with mycorrhizal fungi，Dendrobium officinale forms a symbiotic relationship. The mycorrhizal fungi enhance the production of alkaloids and flavonoids in Dendrobium officinale，and facilitate the transport of fructose，glucose，and sucrose.

Key words：Dendrobium officinale；Mycorrhizal effect；Growth and development；Bioactive substance；Sugar transport

鐵皮石斛（Dendrobium offcinale Kimura amp; Migo）是蘭科石斛屬多年生草本植物，作為藥用植物最早記載于《神農本草經》。鐵皮石斛是植物中最有價值的品種之一，具有獨特的形態學特征和出色的觀賞效果［1］，同時含多種對人體健康有益的多糖、生物堿、菲類等化合物，具有抗癌、抗腫瘤、抗炎、抗氧化以及增強機體免疫力等功效［2-3］。

鐵皮石斛從種子萌發到幼苗建成的整個生長過程都需要菌根真菌的參與，枝孢霉菌屬Cladosporium和小菇屬Mycena sp.是蘭科植物常見的共生真菌。研究表明蘭科菌根可以促進鐵皮石斛的生長，共生真菌通過誘導石斛生根，促進石斛的莖和葉生長，增加植株的鮮重和干重［4-5］；共生菌根可以增加鐵皮石斛植株葉綠素和多糖的含量，改善滲透調節物質的產生、增強抗氧化酶的活性，從而增加其抗寒、抗旱、抗鹽的能力，以更好地適應外部環境的變化［6-8］；共生菌根還參與石斛生物活性物質多糖、生物堿、萜類化合物的生物合成［9］。本研究通過對鐵皮石斛接種耐鹽枝孢霉菌（Cladosporium halotolerans，Ch）和石斛小菇（Mycena dendrobii，Md）2種蘭科植物菌根真菌優勢菌種，探究不同的菌根真菌對鐵皮石斛的生長發育、生物活性物質積累以及糖轉運情況的影響。

1材料與方法

1.1 試驗材料

鐵皮石斛組培苗由泉州市泉豐生物科技有限公司提供。耐鹽枝孢霉菌菌株購自北京保藏生物科技有限公司，石斛小菇菌株購自北京百歐博偉生物技術有限公司。

1.2 試驗設計

選取同一批次且長勢一致（4～6片葉、株高

3 cm以上）的鐵皮石斛無菌組培苗作為試驗材料。分別將Md、Ch接種到馬鈴薯葡萄糖肉湯（Potato Dextrose Broth，PDB）液體培養基中，在28℃條件下進行搖瓶震蕩，煉苗培養7～10 d。煉苗后的組培苗移栽至121℃高壓滅菌2 h的松樹皮基質中，每個穴盤種植8株，再分別用5 mL的Md、Ch菌液澆淋組培苗根系進行接種處理，以澆淋5 mL無菌水作為對照（CK）。接種完成后穴盤覆蓋好基質，以確保組培苗根系的穩定性和生長環境的一致性。每個處理10個穴盤，生物學重復3次，在26℃溫室環境下培養10 d后取樣檢測。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌根結構觀察

參考 Biermann和Linderman［10］改進后的方法觀察菌根的形成情況。將侵染好的鐵皮石斛根樣切段，長1 cm左右，放入FAA固定液中浸泡1～2 h，后用蒸餾水漂洗3次；加入15 mL 10% KOH沸水浴3 h，直至根樣呈現透明為止，使用蒸餾水漂洗3次；加入15 mL 10% H2O2于室溫下漂白20 min，使用蒸餾水漂洗3次；加入15 mL 0.2 mol/L HCl酸化處理10 min，使用蒸餾水漂洗3次；用0.5%錐蟲藍染液進行染色30 min，然后用乳酚進行脫色處理；最后壓片并用光學顯微鏡進行觀察。

1.3.2 生物量測定

將鐵皮石斛苗用蒸餾水沖洗凈并晾干水分。每個處理隨機取5株進行生物量測定，分別對地上部和地下部的鮮重稱量；然后放于60℃恒溫箱進行烘干至恒重，進行干重稱量。每個處理均取3個生物學重復。

1.3.3 生物活性物質測定

分別檢測鐵皮石斛地上部和地下部的生物活性物質含量，參照黃璐瑤等［11］使用酸性染料比色法測定生物堿含量，參照高海立等［12］使用NaNO2-Al（NO）3法測定石斛總黃酮含量。

1.3.4 可溶性糖含量測定

參照Zou P等［13］方法測定鐵皮石斛幼苗地上部和地下部的葡萄糖、蔗糖和果糖等可溶性糖含量。

1.4數據統計與分析

使用Excel 2020進行數據整理，采用SPSS 26.0軟件方差分析功能進行不同處理之間差異的統計學檢驗，組間差異采用LSD法，采用Origin 2019進行圖表繪制。所有數據均進行3次生物學重復取平均值。

2 結果與分析

2.1 接種菌根真菌對鐵皮石斛表型的影響

鐵皮石斛幼苗根部接種菌根真菌培養10 d后，首先體現在石斛根部表型的變化，而植株地上部形態變化不明顯，如圖1所示。接種菌根真菌Md和Ch后，鐵皮石斛幼苗的根系均出現不同程度的褐化現象，呈現淡黃色或黃棕色；而CK的根系表面無褐化，呈現正常的白色。

2.2 鐵皮石斛受菌根真菌侵染后根系顯微結構的變化

鐵皮石斛根系侵染菌根真菌后形成菌根結構。如圖2所示，2種菌根真菌均在鐵皮石斛根部定殖形成菌絲結，而圖2-F接種Md的菌根中可以觀察到菌根真菌定殖在根皮層細胞內，形成具有螺旋狀結構的菌絲結；圖2-I接種Ch的根皮層細胞內形成具有念珠狀結構的菌絲結；圖2-C未接菌的CK根系中沒有形成菌絲結。Md和Ch菌絲侵染鐵皮石斛根部皮層細胞內形成共生體，構成鐵皮石斛的內生菌根。

2.3 接種菌根真菌對鐵皮石斛生物量的影響

由圖3可知，接種2種菌根真菌培養10 d后，鐵皮石斛地上部的鮮重和干重均顯著高于地下部，即整株植株中地上部的生物量占優勢；且與CK相比生物量均呈現下降變化。圖3-A中接種Md和Ch的植株鮮重分別比CK降低10.03%和20.91%，圖3-B中接種Md和Ch的植株干重分別比CK降低10.06%和17.45%，接種Md的鮮重、干重均高于Ch處理，但處理間差異都不顯著。因此，接種Md和Ch對鐵皮石斛生物量沒有顯著影響。

2.4 接種菌根真菌對鐵皮石斛生物活性物質含量的影響

接種Md和Ch影響鐵皮石斛中生物堿的生成（圖4-A）。鐵皮石斛接種Md 10 d后地上部和地下部的生物堿含量，分別比CK提高21.74%和18.75%，且均顯著高于CK和Ch處理。接種Ch后地上部生物堿含量比CK增加12.77%，差異顯著；而地下部的生物堿含量比CK下降43.75%，與CK和Md處理間存在顯著性差異。可見，鐵皮石斛接種Md促進地上部和地下部生物堿的生成。

由圖4-B可知，接種Md和Ch也影響鐵皮石斛總黃酮的生成。與未接菌處理CK相比，接種Md 10 d后鐵皮石斛地上部總黃酮含量增加30.00%，地下部總黃酮含量降低27.87%，與CK均存在顯著性差異；而接種Ch后鐵皮石斛地上部和地下部總黃酮含量均呈現顯著性降低，分別降低27.12%和50.91%，與CK和Md處理均存在顯著性差異。因此，接種Md有利于提高鐵皮石斛地上部總黃酮的生成。

2.5 接種菌根真菌對鐵皮石斛糖轉運的影響

由圖5-A可知，鐵皮石斛接種Md 10 d后地上部葡萄糖含量顯著下降，比CK降低55.41%，而地下部的含量顯著增加，比CK增加820.00%。接種Ch后地上部和地下部的葡萄糖含量均降低，地上部與CK差異不顯著，地下部的含量比CK降低30.00%，且與CK差異顯著。接種Md和Ch的植株總葡萄糖含量處理間差異不顯著，說明接種Md和Ch不影響葡萄糖總含量，但接種Md可以把地上部的葡萄糖轉運到地下部。

由圖5-B可知，接種Md和Ch 10 d后顯著提高鐵皮石斛地上部果糖含量，分別比CK提高25.00%和30.00%。接種Md和Ch提高地下部果糖含量，但與CK差異不顯著。可見，接種Md和Ch有利于促進鐵皮石斛地上部果糖的生成。

由圖5-C可知，鐵皮石斛接種Md 10 d后地上部蔗糖含量降低50.00%，地下部蔗糖含量提高76.47%，且與CK間均存在顯著性差異。接種Ch后地上部蔗糖含量提高144.44%，地下部含量降低5.88%；且與CK間存在顯著性差異。可見，接種Md使鐵皮石斛地上部蔗糖轉運到地下部，而接種Ch使地下部蔗糖轉運到地上部。

3 討論

鐵皮石斛是多年生附生草本植物，通常依附于樹皮、巖石等表面，生長過程中與菌根真菌形成共生體，其菌絲結是菌根結構形成的標志［14］。已有研究表明，菌根真菌對鐵皮石斛的生長發育、多糖、生物堿和總黃酮等生物活性物質的積累都具有較強的促進作用。菌根真菌會改變石斛幼苗的生理調節功能，會通過改變石斛內源激素的合成和分泌進一步提高植株體內礦物質含量［15- 16］和葉綠素含量［17］，也會增強植株C、N、P等代謝途徑中相關關鍵酶基因的表達［18-19］。由于不同菌根真菌與宿主植物之間存在特定共生代謝關系，對植物的生長發育和生物活性物質的積累會產生較大差異。

吳慧鳳等［20］分析了12種可以促進鐵皮石斛幼苗生長的共生真菌，結果表明這12種菌株均可以增加鐵皮石斛的生物量，且不同菌株之間差異較大；侯曉強等［21］對8種鐵皮石斛菌根進行試驗也得出相似的結果。本試驗結果表明，鐵皮石斛接種菌根真菌10 d后生物量并沒有顯著性差異，該結果與其他研究者所得出的結論不一致，原因可能是本試驗接菌處理后菌根共生時間較短，共生菌根的促進效果還沒有表現出來，因此石斛幼苗出現生長緩慢的現象。

李青等［22］從接種小菇屬（Mycena sp.）的金釵石斛菌根苗莖中克隆到了顯著表達的生物堿MVA代謝途徑的MVD基因DnMVDP7，觀察到生物堿前體物質合成的第一個關鍵酶編碼基因AACT上調表達，這可能是促進生物堿含量增加的原因之一。王兆春等［23］研究發現接種枝孢霉菌后顯著提高了鐵皮石斛幼苗葉綠素和多糖含量，進一步驗證了枝孢霉菌對鐵皮石斛生理生化的促生效應機制；黃璐瑤等［11］研究發現鐵皮石斛與多種真菌共生培養比單一真菌培養更有利于促進其生長發育和生物活性物質的積累，混合培養對其生長發育和生物活性物質的積累具有顯著的優越性，這可能是由于混合培養中不同種類的共生真菌之間相互協同作用加強了與植物的互利共生關系。

趙少鵬等［24］研究發現，接種Rhizophagus intraradices和Glomus aggregatum-H共生真菌后大豆地上部和根部葡萄糖、果糖和蔗糖濃度均顯著高于接種Glomus aggregatum-L共生真菌的大豆，表明不同的接菌處理顯著改變了植株的糖代謝途徑以及轉運的差異。通過對比菌根皮層中菌絲結形成和多糖大量合成的時間，發現金釵石斛［25-26］可能在MF23（Mycena sp.）開始侵染石斛根時就已經對多糖積累產生了影響，對石斛莖中多糖積累相關的重要酶編碼基因進行KEGG富集分析，發現MF23可以通過誘導參與光合作用、淀粉和蔗糖代謝、果糖和甘露糖代謝的基因以及抑制參與糖酵解的基因和檸檬酸循環的基因等進而調控多糖的生成和消耗，對多糖的積累產生影響［27］。菌根真菌共生條件下調節了鐵皮石斛糖代謝的相關通路，提高了植株糖合成的效率，石斛多糖作為鐵皮石斛主要藥用成分之一，提高其地上部含量可以有效提高鐵皮石斛的藥用價值。

本試驗研究結果顯示，鐵皮石斛與菌根真菌形成共生結構后，可以調節其糖類的合成和轉運，接種Md使鐵皮石斛地上部蔗糖、葡萄糖轉運到地下部，而接種Ch使地下部蔗糖轉運到地上部；接種Md和Ch有利于促進鐵皮石斛地上部果糖的生成。并且接種Md和Ch后顯著影響了生物活性物質的積累，且不同菌根真菌對鐵皮石斛的促生效果不同。

參考文獻：

［1］Yu Z，Yang Z，Teixeira Da Silva J A，et al. Influence of low temperature on physiology and bioactivity of postharvest Dendrobium officinale stems［J］. Postharvest Biology and Technology. 2019，148： 97-106.

［2］Zeng Q，Ko C，Siu W，et al. Polysaccharides of Dendrobium officinale Kimura amp; Migo protect gastric mucosal cell against oxidative damage-induced apoptosis in vitro and in vivo［J］. Journal of Ethnopharmacology. 2017，208： 214-224.

［3］Yu W，Ren Z，Zhang X，et al. Structural characterization of polysaccharides from Dendrobium officinale and their effects on apoptosis of HeLa cell line［J］. Molecules. 2018，23（10）： 2484

［4］Brundrett M C. Scientific approaches to Australian temperate terrestrial orchid conservation［J］. Australian Journal of Botany. 2007，55（3）： 293.

［5］Jacquemyn H，Waud M，Merckx V S，et al. Mycorrhizal diversity，seed germination and long‐term changes in population size across nine populations of the terrestrial orchid Neottia ovate［J］. Molecular Ecology. 2015，24（13）： 3269-3280.

［6］Zhang S，Li J，Shen Y，et al. Physiological responses of Dendrobium officinale under exposure to cold stresswith two cultivars ［J］. Phyton. 2020，89（3）： 599-617.

［7］何漢瓊，彭曉媛，陶爽，等. 叢枝菌根真菌對鹽（堿）-旱交叉脅迫下羊草幼苗生長與抗氧化酶活性的影響［J］. 現代農業科技，2019（12）： 149-150.

［8］Zhang Y，Li Y，Chen X，et al. Effect of different mycobionts on symbiotic germination and seedling growth of Dendrobium officinale，an important medicinal orchid ［J］. Botanical Studies. 2020，61（1）： 2-12.

［9］Bhatti S K，Thakur M. An overview on orchids and their interaction with endophytes［J］. The Botanical Review. 2022，88（4）： 485-504.

［10］Biermann，B.，Linderman，R G. Use of vesicular-arbuscular mycorrhizal roots，intraradical vesicles and extraradical vesicles as inoculum［J］. New Phytol. 1983，95： 97-105.

［11］黃路瑤.真菌對鐵皮石斛生長的影響及鐵皮石斛有菌苗中circRNA的差異性表達［D］. 杭州：浙江理工大學，2021.

［12］高海立. 鐵皮石斛葉黃酮提取純化工藝優化及抗氧化性研究［D］. 杭州：浙江理工大學，2020.

［13］Zou P，Li K，Liu S，et al. Effect of chitooligosaccharides with different degrees of acetylation on wheat seedlings under salt stress［J］. Carbohydrate Polymers. 2015，126： 62-69.

［14］陳艷紅，邢曉科，郭順星.蘭科植物與菌根真菌的營養關系［J］.菌物學報，2017，36（7）：807-819.

［15］陳娟，唐燕靜，閻波，等. 蘭科藥用植物鐵皮石斛種子共生萌發的分子機制［Z］. 中國貴州貴陽： 2023.

［16］王家祺，田麗霞，陳曉梅，等. 常規與菌根栽培的鐵皮石斛莖及葉中礦物元素含量比較及健康風險評價［J］. 中國中藥雜志. 2022，47（21）： 5824-5831.

［17］李景蕻，張麗華，鐘靜，等. 不同菌根真菌對鐵皮石斛穴盤苗生長及生根的影響［J］. 華北農學報. 2022，37（S1）： 172-177.

［18］Li Q，Li B，Zhou L，et al. Molecular analysis of polysaccharide accumulation in Dendrobium nobile infected with the mycorrhizal fungus Mycena sp.［J］. RSC Advances. 2017，7（42）： 25872-25884.

［19］陳家棟，姜武，宋敏全，等. 鐵皮石斛尿苷二磷酸糖基轉移酶（UGT）基因家族鑒定與表達分析［J］. 中國中藥雜志. 2023，48（7）： 1840-1850.

［20］吳慧鳳，宋希強，胡美姣. 鐵皮石斛促生內生真菌的篩選與鑒定［J］. 西南林業大學學報. 2011，31（5）： 47-52.

［21］侯曉強，郭順星. 鐵皮石斛促生長內生真菌的篩選與鑒定［J］. 中國中藥雜志. 2014，39（17）： 3232-3237.

［22］李清，李標，郭順星. 金釵石斛焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶基因的克隆及表達分析［J］. 基因組學與應用生物學，2018，37（2）： 850-858.

［23］王兆春. 鐵皮石斛接種枝孢霉菌的響應機制及其種子萌發關鍵環境因子研究［D］. 重慶： 西南大學，2019.

［24］趙少鵬. 大豆菌根生長反應差異的生理與分子機制及相關GmSWEET6基因功能解析［D］. 廣州： 華南農業大學，2019.

［25］Li Q，Ding G，Li B，et al. Transcriptome analysis of genes involved in dendrobine biosynthesis in Dendrobium" nobile Lindl. infected with mycorrhizal fungus MF23（Mycena sp.）［J］. Scientific Reports. 2017，7（1）： 316-332.

［26］Li Q，Li B，Zhou L，et al. Molecular analysis of polysaccharide accumulation in Dendrobium nobile infected with the mycorrhizal fungus Mycena sp.［J］. RSC Advances. 2017，7（42）： 25872-25884.

［27］Li Y Y，Chen X M，Zhang Y，et al. Immunolocalization and changes of hydroxyproline-rich glycoproteins during symbiotic germination of Dendrobium officinale［J］. Frontiers in Plant Science. 2018，9（1）： 552-565.

（責任編輯：許玲）

DOI：10.20023/j.cnki.2095-5774.2024.02.004

收稿日期：2024-02-11

基金項目：福建省高校產學合作項目（2022N5016）

作者簡介：*為通訊作者，劉建福（1975-），男，教授，博士，主要從事植物生理與代謝研究工作，E-mail：907153549@qq.com。

余宇瀟（1999-），男，在讀研究生，主要從事植物細胞培養工程研究，E-mail：807447176@qq.com