高鹽飲食通過激活鹽皮質受體引發Dahl SS 大鼠腎損傷和高血壓的新機制

摘要：鹽敏感高血壓作為一種頑固性高血壓，其發病機制十分復雜。雖然鹽皮質激素受體激活和腎損傷在鹽敏感高血壓的發展中起關鍵作用，但具體的病理機制目前并不明確。通過高鹽飲食誘導建立達爾鹽敏感（Dahl SS）大鼠高血壓模型，探究鹽敏感高血壓及腎損傷產生的病理機制。與鹽不敏感的SS-13BN 大鼠相比，長期高鹽飲食會造成Dahl SS 大鼠腎臟中交感神經和腎素-血管緊張素-醛固酮系統（RAAS）的局部激活，最終激活鹽皮質激素受體（MR），導致上皮鈉通道（ENaC）表達增加、氧化應激與炎癥反應增強，從而發生腎纖維化病變，并引發腎臟中磷酸化肌動蛋白（P-Cofilin）與足蛋白（Podocin）表達增加，造成足細胞損傷，最終引發腎損傷與高血壓癥狀。

關鍵詞：高鹽飲食；Dahl SS 大鼠；鹽敏感高血壓；腎損傷；鹽皮質激素受體

中圖分類號：R965 文獻標志碼：A

高血壓作為一種最普遍的慢性代謝性疾病，是導致心血管疾病的重要因素之一。人群中，因高血壓導致心血管疾病發生甚至死亡的比例正在顯著增加[1]，而鹽敏感高血壓作為一種特殊的難治性高血壓，其病因繁多復雜。基因遺傳、高鹽飲食、腎鈉攝入和排出失衡、交感神經的過度興奮、交感神經和腎素-血管緊張素-醛固酮系統（RAAS）的紊亂、炎癥和氧化應激的增強、肥胖、精神壓力以及衰老等諸多因素，均是造成鹽敏感高血壓產生和迅速發展的重要原因[2-3]。由鹽攝入量的持續性增加而引起的交感神經與鹽皮質激素受體（MR）的過度激活是導致腎損傷、并最終發展成鹽敏感高血壓的根本因素[4]。

作為一種特殊的鹽敏感高血壓模型，達爾鹽敏感（Dahl SS）大鼠及對照鼠SS-13BN 大鼠常用于鹽敏感高血壓的研究。在高鹽飲食狀態下，Dahl SS 大鼠的血壓會出現爆發式增高，并伴有腎損傷。這樣的特點與人群中的鹽敏感人群相吻合，故常用于模擬人類的鹽敏感高血壓模型，用于各種病理機制的研究及尋找潛在的治療藥物[2-3， 5-10]。研究表明Dahl SS大鼠高血壓及腎損傷的爆發與腎臟線粒體功能受損和能量代謝障礙[11]、足細胞損傷與腎小球病變[12]、氧化應激與炎癥[13-14] 等因素密切相關。但由于Dahl SS高血壓模型發病機制十分復雜，所以現今鮮有針對Dahl SS 大鼠高血壓模型進行的病理機制系統研究。

本文通過高鹽飲食建立Dahl SS 大鼠高血壓模型，探究導致腎損傷與血壓升高潛在的病理機制，并揭示各因素之間明確的因果關系，為后續的藥物開發提供有效的研發思路。

1 實驗部分

1.1 動物與試劑

6 周齡的Dahl SS 大鼠及對照鼠SS-13BN 大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；特殊訂制的0.3%（質量分數，下同） NaCl AIN-93G 和4%NaClAIN-93G 飼料購自北京科澳協力飼料有限公司。血壓測量使用的是由上海奧爾科特生物技術有限公司購買的ALC-NIBP 無創血壓分析系統。抗體α-ENaC（ PA5-96353） 、γ-ENaC（ PA5-110347）購自賽默飛世爾科技有限公司；β-ENaC（14134-1-AP）、GADPH（60004-1-Ig）、β-actin（11224-1-AP）、Cofilin（66057-1-Ig）、NPHS2（20384-1-AP）、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔或抗鼠二抗購自美國Proteintech 公司；SGK-1（ab55281）購自英國Abcam 公司；NF-κB（3033S）、P-Cofilin（ 3313S） 購自美國CST 公司； IL-4（ E-ELR0014c）、IL-1β（ E-EL-R0012c） 、去甲腎上腺素（ EEL-0047c） 、血管緊張素Ⅱ（ E-EL-R1430c） 、醛固酮（E-EL-0070c）、腎素（E-EL-R0030c）Elisa 試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司； 丙二醛（S0131S）和谷胱甘肽還原酶（S0055）試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與模型建立 6 周齡的Dahl SS 大鼠和SS-13BN 大鼠在恒溫無病原體、12 h 和12 h 光暗循環的鼠房中適應性飼養一周，進行一周的適應性訓練，并根據訓練血壓的結果隨機分成4 組：SS-13BN rats+0.3% NaCl+Placebo；SS-13BN rats+4% NaCl+Placebo；Dahl SS rats+0.3%NaCl+Placebo；Dahl SS rats+4% NaCl+Placebo，其中，0.3%NaCl 代表低鹽飼料，4%NaCl 代表高鹽飼料，Placebo 代表安慰劑。每周進行1 次尾套管無創血壓監測，并且在第8 周時，在戊巴比妥鈉麻醉狀態下腹主動脈取血并采集腎臟標本，血液取出后靜置5 min，后在4 ℃、12 000 g條件下離心15 min，取上層血漿，分裝后放在?80 ℃ 冰箱儲存；腎臟縱切，一半固定于10%（體積分數，下同）中性甲醛溶液，用于組織學病理檢查，另一半液氮速凍，用于分子生物學實驗。所有實驗方案都按照美國國立衛生研究院發布的《實驗動物護理和使用指南》進行設計和研究。

1.2.2 腎臟的組織病理學評估 通過Masson 染色評估腎臟的纖維化狀況：將縱切固定于10% 中性甲醛的腎臟組織進行石蠟包埋、切片、脫蠟，并用蒸餾水沖洗起到補水作用， 然后按照標準改良后的Masson 染色實驗方案進行染色，并使用光學倒置顯微鏡觀察拍照。在200X 視野條件下，每張切片隨機選擇4 個腎臟區域進行定量分析，并使用Image-ProPlus 6.0 測量陽性區域的面積，通過藍色的膠原面積判斷腎纖維化的程度。

1.2.3 Western Blot 實驗 使用RIPA（ Radio-ImmunoprecipitationAssay）裂解液，并輔以苯醛基磺酰氟（PMSF）和Cocktail 蛋白酶抑制劑提取腎臟標本中的總蛋白，利用BCA 蛋白濃度測定法確定總蛋白濃度。樣品在10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，對目的蛋白進行分離，將其轉移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上（70 min），后在0.05 g/mL 的脫脂牛奶中阻斷非特異性蛋白2 h，再在4 ℃ 下與一抗過夜孵育。隔日，在室溫條件下用含0.2%（體積分數）吐溫的TBST 緩沖液清洗未結合的一抗，每次10 min。清洗結束后，將膜與HRP 標記的二抗在室溫下孵育2 h，并清洗未結合的二抗。通過ECL 化學發光液將信號放大， 并使用化學發光儀獲取圖像， 最后用Image J 進行灰度值計算。

1.2.4 免疫組化 將石蠟切片置于二甲苯中進行脫蠟處理，并在不同濃度梯度的酒精中進行脫水處理。脫蠟脫水結束后， 將切片置于pH 為6.0 的1X 檸檬酸抗原修復液中，在95 ℃ 條件下進行抗原修復，然后冷卻至室溫。隨后，用體積分數為3% 的H2O2 室溫避光孵育20 min，阻斷內源性過氧化物酶，然后在室溫下用5% 的牛血清白蛋白阻斷非特異性信號。將切片在4 ℃ 下與一抗過夜孵育，次日在室溫條件下用PBS 洗去多余的一抗，二抗孵育1 h后清洗未結合的二抗。在避光條件下進行二氨基聯苯胺顯色、蘇木素染核和鹽酸乙醇分化操作，最后在梯度乙醇和二甲苯中脫水至透明，并在通風櫥中進行中性樹膠封片處理。晾干后在倒置光學顯微鏡下觀察并拍片，每張切片在200X 視野下選擇4 個區域進行定量分析，并使用Image-Pro Plus 6.0 量化二氨基聯苯胺（DAB）顯色的信號強度。

1.2.5 酶聯免疫吸附測定實驗 本文實驗所有操作均嚴格遵守制造商說明書規定的實驗方案。樣品中的抗原與包被在酶標板上的抗體結合后，洗去未結合的抗原，再依次加入生物素化抗體工作液和酶結合物工作液繼續孵育，形成免疫復合物。隨后加入顯色底物四甲基聯苯胺（TMB），使其在辣根過氧化物酶的催化下呈現藍色，接著加入終止液停止反應，然后在450 nm 處測量腎臟組織中各物質的吸光度值，并用OriginPro2020 計算各樣品對應的濃度。

1.2.6 GSH、MDA 的測定 剪取適量腎臟組織制備成組織勻漿，冰上儲存備用以用來進行二氨基聯苯胺（GSH）、丙二醛（MDA）的測定，整個過程嚴格根據制造商提供的說明書進行實驗操作和測量。

1.2.7 數據分析及處理 本文中所有數據均用平均值+標準誤差（Mean + SEM）表示，使用SPSS26.0 軟件進行組間的單因素方差分析，采用最小顯著差異法檢驗進行多重比較。n 代表每組樣本數， p lt;0.05 代表有顯著性差異。