一種新型1型單純皰疹病毒mRNA疫苗的制備

［摘 要］ 制備用于防治1型單純皰疹病毒感染的新型mRNA疫苗，并檢測其免疫效果。利用同源重組技術構建HSV1糖蛋白gD胞外域（HSV1-gDEctodomain）重組質粒，經PCR反應擴增HSV1-gDEctodomain基因模板，體外轉錄反應得到HSV1-gDEctodomain mRNA，利用LNP包封HSV1-gDEctodomain mRNA得到mRNA-LNP疫苗復合物，小鼠大腿肌肉接種mRNA-LNP疫苗復合物。ELISA法檢測小鼠血清HSV1-gD抗體效價；TCID50 法檢測HSV1-gD血清中和效價。結果顯示：經HSV1-gDEctodomain mRNA疫苗接種后，小鼠血清抗體滴度達到1∶12 800，中和實驗表明抗體可保護Vero細胞不受HSV1病毒感染。成功制備一種新型HSV1 mRNA疫苗，用其接種小鼠可誘導產生特異性免疫應答，并具有良好的保護作用。

［關鍵詞］ HSV-1； gD胞外域基因； mRNA疫苗； 特異性抗體

［中圖分類號］ R392" ［文獻標識碼］ A

1型單純皰疹病毒 （herpes simplex virus type 1， HSV-1）是一種線性雙鏈DNA病毒，屬于皰疹病毒科，為最常見的誘發人體口面、皮膚和生殖系統等部位感染的皰疹病毒，人群普遍易感。該病毒可長期潛伏于人體的神經系統，導致其復發感染，并誘發中樞神經系統損害等嚴重后果，目前尚無特效治療藥物，因此疫苗接種依然是預防該病毒感染的最佳選擇。迄今為止，針對HSV疫苗設計多集中于亞單位疫苗、減毒活疫苗、復制缺陷病毒疫苗、DNA疫苗以及載體疫苗，但由于保護效果不理想， HSV-1疫苗的推廣應用受到限制。

mRNA（messenger RNA）疫苗具有細胞內表達速度快、有效性和安全性高、 易規模化擴大和成本效益比高等特點［1］。2020年暴發全球新冠大流行，Moderna 和BioNtech 公司推出的mRNA 疫苗在安全性和保護效力方面得到進一步驗證［2-4］，使得mRNA 疫苗技術受到更加廣泛的關注。與DNA 疫苗相比，mRNA 更安全有效，因為mRNA不需要進入細胞核即可指導蛋白質生成，外源mRNA整合進入基因組的概率極小。與減毒或滅活疫苗相比，mRNA 只表達特定抗原，誘導針對靶抗原的特定免疫應答，從而使機體獲得免疫保護力。mRNA疫苗既能高效誘導體液和細胞免疫應答［5］，又可先天免疫應答。由于mRNA 生產是基于體外無細胞轉錄反應系統制備，因此無宿主細胞來源雜質和病毒污染物等安全性風險。此外，mRNA 疫苗開發周期短及易規模化生產等特點，在傳染性疾病預防、腫瘤防治和基因替代治療等領域均顯示良好的應用前景。

目前，mRNA的常規結構由5′cap、5-非翻譯區（UTR）、一個編碼抗原的開放閱讀框、3′UTR以及一個poly（A）尾巴組成。IRES具有與5′Cap相似的功能，在應激條件下，由內部核糖體進入位點（IRESs）驅動的Cap-independent translation可以作為蛋白質生產的替代機制。1988年，Pelletier等發現脊髓灰質炎病毒的5′-UTR有一個大約450個核苷酸的P2序列，可以指導真核mRNA的翻譯［6］；Jang等也在腦心肌炎病毒的5′-UTR中發現了一個序列［7］。1991年，Macejak等發現在細胞免疫球蛋白重鏈結合蛋白基因的5′-UTR中含有IRES元件［8］。利用構建的環狀mRNA，IRES被證明可以在體外指導蛋白質合成，這表明蛋白質翻譯可以特異性地依賴于IRES序列促進核糖體組裝［9］，并通過招募不同的反式作用因子啟動翻譯，使得蛋白質翻譯的啟動不依賴于mRNA的5′cap結構［10］。

研究發現，在已知的HSV-1 12種包膜糖蛋白中，D型囊膜糖蛋白（glycoprotein D， gD） 是HSV-1病毒包膜重要成分，在病毒侵染宿主細胞中起重要作用［11］。大量研究提示，gD蛋白具有較強的免疫原性，可誘導機體產生高滴度的中和抗體和細胞免疫反應，因此可作為研制HVS-1疫苗的理想靶點。本研究選取HSV-1 gD的胞外域 （gDEctodomain） 為研究靶標，通過制備HSV-1 gDEctodomain mRNA 疫苗，檢測HSV-1 gDEctodomain mRNA 疫苗誘導小鼠血清抗體效價及對病毒的中和效果，來評估疫苗的保護效果。

1 實驗材料

oHSV1-GFP和pUC57載體由本實驗室前期制備；HSV1 gDEctodomain（HSV-1 17株，Gene ID：2703444，915bp）基因由北京擎科生物科技有限公司合成；質粒小提試劑盒購自南京諾唯贊公司；mRNA轉錄試劑盒購自蘇州近岸蛋白質公司；SM-102購自廈門賽諾邦格公司；DSPC（1，2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine）、cholesterol和DMG-PEG2000購自艾偉拓公司。分體式注射泵購自蘇州汶顥公司；納米粒度電位儀購自馬爾文帕納科公司；高內涵活細胞工作站購自珀金埃爾默公司。6～8周齡雌性C57BL/6小鼠購自湖北省疾病控制中心。

2 實驗方法

2.1 pUC57kana-HSV1 gDEctodomain質粒構建和轉錄模板制備

抗原基因 HSV-1包膜糖蛋白 D 胞外域（HSV1 gDEctodomain）通過同源重組方式連接到kana抗性的pUC57載體上，得到pUC57kana-HSV1 gDEctodomain重組質粒，質粒經酶切鑒定和序列測定予以確定。將質粒轉化大腸桿菌，挑單菌落在含卡納霉素的LB培養基中37℃、200 r/min培養16～24 h。參照諾唯贊質粒小提試劑盒說明書進行質粒提取。

將上述所得的質粒作為模板，用引物對（上游引物：ggccagagaattcgagctcggtacctcgcgaa，下游引物：gcagtcgacgggcccgggatccga）進行PCR擴增以獲得mRNA轉錄模板。取1 μL PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠以120 V電壓電泳30 min，凝膠成像系統檢測擴增DNA條帶大小。

2.2 體外轉錄

參照mRNA轉錄試劑盒說明書，于冰上配置mRNA轉錄體系：10×Transcription Buffer（50 μL）；ATP/GTP/CTP/UTP四種核苷酸（各37.5 μL）；轉錄模板（25 μg）；Enzyme Mix（25 μL）；DEPC水補充至500 μL。37℃恒溫反應3 h后收集產物，加入DNase I降解反應體系中的DNA。取1 μL gDEctodomainmRNA產物在3%的瓊脂糖凝膠以100 V電壓電泳30 min，用凝膠成像系統拍照。

2.3 LNP包封mRNA和換液濃縮

LNP配方在文獻基礎上優化得到［12］。將SM-102、DSPC、cholesterol和DMG-PEG20004種脂質以50∶10∶38∶2的物質的量的比溶解在乙醇中制備得到乙醇相。將溶有mRNA的醋酸鈉緩沖液（25 mmol/L，pH5.0）與乙醇相在體積比為4∶1（水相∶乙醇相）的條件下，使用分體式注射泵進行包封。然后用含8%蔗糖的Tris （20 mmol/L，pH7.4），通過Millpore超離心過濾器對包封后的mRNA-LNP進行換液濃縮。取10 μL mRNA-LNP產物在1%的瓊脂糖凝膠以120 V電壓電泳30 min，用凝膠成像系統拍照；另取10 μL用納米粒度電位儀測定粒徑。

2.4 mRNA-LNP免疫動物

隨機選取6～8周齡C57BL/6小鼠18只，分成空白對照組、LNP對照組和gDEctodomainmRNA-LNP 實驗組，每組6只， 分別在第1、14和28天3次給藥。空白對照組，小鼠右后腿肌肉注射100 μL含8%蔗糖的20 mmol/L Tris緩沖液; LNP對照組，小鼠右后腿肌肉注射100 μL LNP; gDEctodomainmRNA-LNP實驗組，小鼠右后腿肌肉注射100 μL 濃度為300 ng/μL" 的gDEctodomainmRNA-LNP（即30 μg/只）。分別于實驗開始后第28和42天，眼眶后靜脈取血采集血清。

2.5 ELISA法檢測小鼠血清抗體滴度

用碳酸鹽緩沖液（pH9.6）將 oHSV1-GFP稀釋至終濃度2×106TCID50/mL，紫外滅活30 min后包被96孔酶標板，每孔100 μL，4 ℃包被過夜； PBST洗滌液洗板1次，每孔300 μL，加入1% BSA于37 ℃封閉2 h； PBST洗滌液洗板1次，加入0.1% BSA倍比稀釋后的小鼠血清，每孔100 μL，37℃下孵育2 h； PBST洗滌液洗板3次，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG（1∶2000稀釋），每孔100 μL，37 ℃下孵育1 h；PBST洗滌液洗板3次，加入TMB顯色液，每孔50 μL，室溫避光顯色5～15 min；加入 2 mol/L濃硫酸終止反應；用酶標儀測定OD450 nm處的OD值。大于cut-off值（陰性對照組平均OD值的+3＊SD）的最高稀釋度即為抗體滴度［13］。

2.6 中和抗體測定

通過固定病毒稀釋血清法測定抗體的中和能力［14］。實驗動物采血后將收集的血清于56 ℃水浴1 h滅活補體，將每組樣品從1∶8至1∶128進行2倍稀釋，將每個稀釋度的血清與100 TCID50的oHSV1-GFP病毒在37 ℃下混合孵育1 h。再將血清病毒混合物接種到單層Vero細胞上，每一稀釋度接種4孔，每孔0.2 mL。并在37 ℃和5% CO2下孵育48 h后，使用高內涵活細胞工作站觀測綠色熒光GFP表達率，評估細胞病變情況。

2.7 實驗數據分析

實驗所取得數據使用Graphpad Prism 9.0軟件繪制實驗數據相關結果圖。Two-way ANOVA對統計數據進行分析顯著性差異， *plt;0.05，***plt;0.0001，差異分析認為plt;0.05存在顯著性差異。

3 實驗結果

3.1 pUC57kana-HSV1 gDEctodomain質粒構建和轉錄模板制備

pUC57kana-HSV1 gDEctodomain質粒構建如圖1a所示。以 pUC57kana-HSV1 gDEctodomain質粒為模板進行PCR擴增，擴增產物在凝膠中的電泳見圖1b。從圖1b中可以看出，擴增產物片段約1.75 kb，其大小與預期相符，且未發現其他非特異性條帶。

3.2 gDEctodomainmRNA制備

mRNA結構元件依次包括T7啟動子（T7 P）、內部核糖體進入位點（IRES）、1型單純皰疹病毒的D型囊膜蛋白胞外域基因（HSV1 gDEctodomain）和poly A。其中poly A含有106個重復的腺苷三磷酸堿基（圖2a）。gDEctodomainmRNA在凝膠中的電泳見圖2b，gDEctodomainmRNA片段約為1.75 kb，其大小與預期相符且未發現其它非特異性條帶。

3.3 gDEctodomain mRNA-LNP電泳和粒徑測定

LNP與gDEctodomain mRNA結合牢固，成像時在加樣孔原位處觀察到亮帶（圖3）。去除包封系統中的非水溶劑后，mRNA-LNP的粒徑（Z-average）應在70～100 nm之間［15］，Z-average為86.31 nm，聚合物分散性指數（PDI）為0.099（圖4），PDI小于0.3，提示gDEctodomain mRNA包封成功。

3.4 間接ELISA法檢測抗體滴度

間接ELISA法檢測小鼠血清抗體滴度。與空白對照組和LNP對照組相比，gDEctodomain mRNA-LNP實驗組在1/200～1/12800連續4個血清稀釋倍數時吸光度值差異顯著（***plt;0.0001）（圖5），抗體滴度為1∶12800。結果說明gDEctodomain mRNA經LNP包封后免疫小鼠能誘導產生較高滴度的抗體。

3.5 固定病毒稀釋血清法測定中和抗體

在接種oHSV1-GFP病毒的Vero細胞中加入適量血清，通過綠色熒光GFP表達率測定中和抗體。空白對照組和LNP對照組血清病毒混合液處理的細胞均有GFP產生，且可見典型的病毒復制的噬毒斑；gDEctodomain mRNA-LNP實驗組血清病毒混合液處理的細胞未見GFP和噬毒斑（圖6）。結果說明gDEctodomain mRNA經LNP包封后免疫的小鼠血清能對病毒具有良好的中和效果。

4 結論

目前，HSV中糖蛋白gD能誘導機體產生較強的體液免疫反應和細胞免疫反應，對機體有較強的保護作用，是研究HSV疫苗理想的目標蛋白。本研究將gDEctodomain基因序列重組插入到pUC57載體上，成功構建表達gDEctodomain的重組質粒，并以gDEctodomain基因的PCR產物作為模板，轉錄獲得mRNA并以LNP包封。用mRNA-LNP免疫接種小鼠，經中和實驗和ELISA兩種方法在小鼠血清中檢測到HSV-1 gD特異性抗體，表明gDEctodomainmRNA-LNP能夠誘導機體產生特異性體液免疫應答，對宿主細胞具有保護作用，但是否能夠誘導機體產生細胞免疫應答還需進一步研究。

本研究制備的HSV1-gD胞外域mRNA疫苗在初步的動物實驗中顯示出免疫保護作用，并且由于mRNA疫苗具有安全性高、制備快速、易規模化擴大等特點，有望成為防治HSV感染的候選疫苗。

［ 參 考 文 獻 ］

［1］ FANG E Y， LIU X H， LI M， et al. Advances in COVID-19 mRNA vaccine development［J］. Signal transduction and targeted therapy， 2022， 7（01）：94.

［2］ "BADEN L R， EI S H， ESSINK B， et al. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 Vaccine［J］. The New England journal of medicine， 2020，384（05）：403-416.

［3］"" SKOWRONSKI D M， DE S G. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA covid-19 vaccine［J］. New England Journal of Medicine， 2021， 384（16）： 1576-1578.

［4］ "YVETTE N L. BNT162b2 mRNA COVID-19 Vaccine： First Approval［J］. Drugs， 2021， 81（04）：1-7.

［5］" OGUZ F， ATMACA H. mRNA as a therapeutics： understanding mRNA vaccines［J］. Advanced pharmaceutical bulletin， 2022， 12（02）： 274-282.

［6］ PELLETIER J， KAPLAN G， RACANIELLO V R， et al. Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5′ noncoding region［J］. Molecular and cellular biology， 1988， 8（03）： 1103-1112.

［7］ JANG S K ，WIMMER E. Cap-independent translation of encephalomyocarditis virus RNA： structural elements of the internal ribosomal entry site and involvement of a cellular 57-kD RNA-binding protein［J］. Genes amp; development， 1990， 4（09）： 1560-1572.

［8］ MACEJAK D G，SARNOW P. Internal initiation of translation mediated by the 5′ leader of a cellular mRNA［J］. Nature， 1991， 353（6339）： 90-94.

［9］ 馬鵬，周小凱，常秋燕，等.內部核糖體進入位點介導核糖體翻譯起始機制［J］.動物醫學進展，2017，38（06）：74-78.

［10］ PYRONNET S，PRADAYROL L，SONENBERG N. A cell cycle–dependent internal ribosome entry site［J］. Molecular Cell， 2000， 5（04）： 607-616.

［11］"" MADAVARAJU K， KOGANTI R， VOLETY I， et al. Herpes simplex virus cell entry mechanisms： an update ［J］. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology， 2021， 10： 617578.

［12］"" MAUGERI M， NAWAZ M， PAPADIMITRIOU A， et al. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells［J］. Nature communications， 2019， 10（01）： 4333.

［13］"" WU Y T， HUANG X F， YUAN L Z， et al. A recombinant spike protein subunit vaccine confers protective immunity against SARS-CoV-2 infection and transmission in hamsters［J］. Science translational medicine， 2021，13（606）： eabg1143.

［14］" 姜子義. 基于偽狂犬病毒囊膜糖蛋白gD基因mRNA疫苗的初步研究［D］.成都：四川農業大學，2018.

［15］"" KIMBERLY J H， KERRY E B， ERIC J， et al. Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines［J］. Molecular Therapy-Nucleic Acids， 2019， 15： 1-11.

Developing a Novel Vaccine Against Herpes Simplex

Virus Type 1 by mRNA Technology

LIU Biao1， CAI Linkang2， SU Hongxia2， WANG Yang1， LIU Binlei1

（1 School of Bioengineering and Food， Hubei Univ. of Tech.，" Wuhan 430068，China；

2 Wuhan Binhui Biotechnology Co.， Ltd，" Wuhan 430073，China）

Abstract： To develop a novel mRNA vaccine that can be used to prevent and test the herpes simplex virus infection type 1， the coding sequence for HSV1 glycoprotein gD extracellular domain was cloned into the pUC57 vector to obtain a recombinant plasmid by homologous recombination. The HSV1-gDEctodomain gene template was amplified by PCR reaction， and HSV1-gDEctodomain mRNA was obtained by in vitro transcription reaction. The LNP was used to encapsulate HSV1-gDEctodomain mRNA to obtain mRNA-LNP complex， and the mRNA-LNP complex was injected intramuscularly into the thighs of mice. HSV1-gD antibody titer was determined by ELISA assay. The neutralization antibody titer of HSV1-gD was detected by TCID50 method. The results showed HSV1-gD antibody titer of the immunized mice reached to 1：12800， and the neutralization test showed Vero cells were protected from HSV1 virus infection （green fluorescent GFP and plaques did not appear in the experimental group）. All in all， The HSV1 vaccine prepared by mRNA technology can induce specific immune response and has good protective effect.

Keywords： HSV-1; gD extracellular genes; mRNA vaccines; Specific antibodies

［責任編校： 張 眾］

［收稿日期］ 2022-11-27

［第一作者］ 劉 彪（1997-）， 男， 江西吉安人， 湖北工業大學碩士研究生， 研究方向為微生物與生化藥學。

［通信作者］ 劉濱磊（1962-）， 男， 湖北武漢人， 湖北工業大學教授， 研究方向為生物制藥。

［文章編號］ 1003-4684（2024）05-0096-04