猴痘病毒A33R、L1R、B5R和A27L蛋白表達及生物學特性

［摘 要］ 為給猴痘病毒的抗原制備和疫苗制備奠定基礎，原核表達帶有GST標簽的融合蛋白A33R、L1R、B5R和A27L，并簡要分析這四個蛋白的一些生物學特性。 用PGEX-6P-1為載體，構建重組融合蛋白表達質粒；用大腸桿菌DE3感受態細胞轉化重組質粒后，在體外誘導表達和純化；純化的蛋白進行SDS-PAGE電泳，做考馬斯亮藍染色分析并用WB進行驗證。最后，通過生物信息學方法分析4個蛋白的生物學特性，用ExPAsy在線軟件中的ProtParam工具和ProtScale工具分別分析其理化性質和親疏水性，用SignalP4.1 service在線軟件分析其信號肽，成功構建了4個重組目的蛋白表達質粒，并成功誘導表達并純化出帶GST標簽的目的蛋白。通過生物信息學的方法分析可知，4個蛋白均為疏水蛋白，除了B5R，A33R、L1R和A27L均為分泌蛋白，為猴痘病毒的抗原制備和疫苗制備提供理論基礎。

［關鍵詞］ 猴痘病毒； 原核表達； 蛋白純化； 生物信息學

［中圖分類號］ R153" ［文獻標識碼］ A

猴痘病毒（MPXV）是一種包膜雙鏈DNA病毒，屬于痘科、脊索病毒亞科和正痘病毒屬［1］。它的傳播方式有以下幾種：第一種是人類被猴痘病毒的宿主直接接觸或攻擊；第二種是食用未高溫煮熟的受感染動物的肉；第三種是人與人之間通過呼吸道飛沫來傳播［2］。由于猴痘（MPX）病毒與天花病毒十分相似，接種牛痘病毒（另一種正痘病毒）的天花對猴痘的保護率約為85%［3］。然而，在1980年根除天花之后，不再有針對天花的常規疫苗接種［4］。隨著停止接種天花疫苗后人類群體免疫力減弱，這也導致了猴痘在流行和非流行地區再次出現并快速爆發。

猴痘L1R基因表達的L1R蛋白與痘苗病毒中的J1R同源。有研究表明，痘苗病毒中的J1R是一種病毒生長所需的膜蛋白，J1R蛋白與A45R蛋白相互作用，在未成熟病毒粒子形成過程中發揮重要作用［5］。痘苗病毒中的A33R在病毒粒子在細胞間的傳播中起著至關重要的作用。有研究表明，A33R是猴痘病毒血清學檢測的潛在靶點［6］。B5R是一種補體調節蛋白，在細胞外包膜病毒粒子（EEV） 最外層膜的溶解中發揮作用，以允許病毒粒子進入宿主細胞，同時也參與包裹細胞內成熟病毒粒子（IMV） 以形成細胞內包膜病毒粒子（IEV）［7］。A27L蛋白是一種存在于IMV的包膜中蛋白，它參與病毒與細胞附著、病毒與細胞融合和病毒從細胞釋放這三個過程。A27L蛋白是用于針對人類痘病毒感染的免疫保護反應的最佳表征和最有希望的蛋白質之一，其N末端包含一個肝素結合結構域、一個融合結構域和一個負責與高爾基體中的蛋白質或脂質相互作用以形成EEV和病毒傳播的結構域［8］。除此之外，它能形成共價連接的三聚體，并定位在IMV形式的包膜中，在病毒到細胞和細胞到細胞的融合中起作用［9］。已有研究證實針對A27L的抗體在體外具有強大的IMV中和能力［10］。已經證明，L1R、A33R、 B5R和A27L蛋白本質上具有免疫原性，并具有針對痘病毒的保護作用。特別是，這些蛋白質是病毒與靶細胞結合、融合和進入靶細胞所必需的。L1R 和 B5R 免疫原是 IMV 和 EEV 中和抗體的靶標，而 A33R 是補體介導的細胞溶解的靶標［9，11］。此外，使用LIR，B5R和A33R的牛痘病毒亞單位重組疫苗也被證明對猴痘有效［12］。

本研究采用原核表達系統，通過構建能融合表達GST標簽和目的蛋白的GST融合表達質粒，用DE3感受態細胞轉化并誘導表達純化出帶GST標簽的融合蛋白A33R、L1R和B5R，為猴痘病毒的抗原制備和疫苗制備奠定基礎。

1 實驗材料

大腸桿菌DE3感受態細胞、大腸桿菌DH5α感受態細胞、原核表達載體質粒PGEX-6P-1由本實驗室保存；質粒pUC57-A27L、pUC57-B5R、pUC57-A33R和pUC57-L1R由武漢濱會生物科技有限公司饋贈；引物合成與基因測序由北京擎科生物科技有限公司完成；質粒小提中量試劑盒購于康為世紀公司；膠回收試劑盒購自諾唯贊公司；限制性內切酶購自NEB；GST標簽蛋白純化試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

2 實驗方法

2.1 質粒構建

對質粒pUC57-A27L、pUC57-B5R、pUC57-A33R和pUC57-L1R進行PCR并作膠回收，回收目的片段。將目的片段與原核表達載體pGEX-6P-1同源重組后，轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，搖菌涂板（Amp抗性）。第二日，取單克隆菌落進行菌落PCR，挑選陽性單克隆菌落擴培后外送測序。測序結果與NCBI上發布的序列比對，將測序結果正確的菌株保菌，用于后續實驗。

所用引物見表1。

2.2 質粒提取

將保存的菌液取出解凍，以1∶1000的比例接種至LB液體培養基中（Amp抗性），37℃，220 r/min搖菌16 h后，提取質粒，并測定濃度。

2.3 GST融合蛋白的原核表達和純化

將質粒轉化至大腸桿菌DE3感受態，先不添加抗性，于37℃、220 r/min的搖床上搖菌1 h至菌液微渾后，加入5 mL的LB液體培養基（Amp抗性），37℃、220 r/min搖菌過夜。第二天，取1 mL菌液接種至100 mL的LB液體培養基后，繼續搖菌，直至菌液OD值到0.6～0.8。添加IPTG（1 mmol/mL），在16℃、200 r/min，的條件下誘導表達16 h后，離心收集菌體。加入PBS（添加EDTA和蛋白酶抑制劑）重懸菌體，用超聲破碎儀進行破碎，破碎后離心收集上清。

取40 μL的BeyoGoldTM GST-tag Purification Resin，4℃，2000×g離心1 min后棄去儲存液。加入200 μL裂解緩沖液，平衡凝膠株，4℃，2000×g離心1 min后棄去液體。將200 μL超聲破碎后的上清加入EP管中并將凝膠珠重懸，置于混勻儀上4℃孵育3 h。4℃，2000×g離心1 min后棄去液體，加入200 μL的PBS將凝膠珠重懸，置于混勻儀上4℃清洗10 min，重復一次。加入200 μL的裂解緩沖液將凝膠珠重懸，置于混勻儀上4℃清洗10 min。加入40 μL的洗脫緩沖液（含1×GSH）將凝膠珠重懸，置于混勻儀上4℃洗脫15 min，重復2次。收集所有的樣品，加入蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸15 min后，將上述蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳。通過考馬斯亮藍染色來初步驗證蛋白表達量及純度，通過WB來驗證純化后的蛋白是否是帶GST標簽的融合目的蛋白。

2.4 蛋白生物信息學分析

用SIB瑞士生物信息學研究所運營的ExPAsy在線軟件中的ProtParam工具分析A33R、L1R、B5R和A27L蛋白的理化參數；用SIB瑞士生物信息學研究所運營的ExPAsy在線軟件中的ProtScale工具分析蛋白的親疏水性；用DTU Health Tech 官網的SignalP4.1 service在線軟件分析蛋白的信號肽。

3 實驗結果

3.1 GST融合蛋白原核表達載體雙酶切和目的基因擴增

將原核表達載體PGEX-6P-1雙酶切。 如圖1a所示， 雙酶切后的理論條帶大小應為5012 bp， 酶切條帶大小與理論大小一致。 分別以質粒 pUC57-A33R、 pUC57-L1R、 pUC57-A27L 和 pUC57-B5R 為模板擴增A33R基因 （482 bp）、 L1R基因（503 bp）、 A27L基因（2135 bp）和B5R基因（1730 bp），其擴增條帶大小均與目的基因一致，如圖1b，c，d，e所示。

3.2 菌落PCR篩選重組GST融合蛋白原核表達質粒

重組后的GST融合蛋白表原核表達質粒轉化涂板后，通過菌落PCR來篩選出陽性單克隆菌落。如圖2所示，對重組質粒PGEX-A33R、PGEX-L1R、PGEX-A27L和PGEX-B5R轉化涂板后，挑取單克隆菌落進行菌落PCR，目的條帶大小均正確。隨后各挑取陽性單克隆菌落搖菌擴培，外送測序，測序結果與NCBI上的序列一致。

3.3 重組GST融合蛋白原核表達純化

GST-A33R重組蛋白預測的相對分子質量為42 000，GST-L1R重組蛋白預測的相對分子質量為43 000，GST-A27L重組蛋白預測的分子質量為102 000，GST-B5R重組蛋白預測的相對分子質量為87 000。按照2.3的方法純化蛋白，取裂解后的上清、與凝膠珠孵育后的上清、雜蛋白清洗上清（W）、三次洗脫的上清（E1，E2，E3）以及洗脫三次后的凝膠珠進行SDS-PAGE電泳，并進行考馬斯亮藍染色，結果如圖3所示，電泳所得的目的蛋白均與預測的蛋白分子質量一致。

3.4 原核表達重組GST融合蛋白的驗證

在考馬斯亮藍驗證得到預測的目的條帶后，通過WB用anti-GST的抗體來驗證純化后的蛋白是否帶GST標簽的融合目的蛋白。如圖4所示，電泳所得的目的蛋白均與預測的蛋白分子質量一致。

3.5 A33R、L1R、B5R和A27L蛋白的理化性質分析

用SIB瑞士生物信息學研究所運營的ExPAsy在線軟件中的ProtParam工具分析A33R、L1R、B5R和A27L蛋白的理化性質。軟件預測A33R蛋白的分子式為C1280H2124N438O508S133，相對分子質量為36041.55；L1R蛋白的分子式為C1322H2187N459O535S141，相對分子質量為37592.12；B5R蛋白的分子式為C4907H8130N1686O1961S538，相對分子質量為139402.99；A27L蛋白的分子式為C5844H9599N2091O2341S636，相對分子質量為167000.26。A33R蛋白的理論等電點（pI）為5.17，原子總量為4483，脂肪族氨基酸指數為30.37；L1R蛋白的理論等電點（pI）為5.16，原子總量為4644，脂肪族氨基酸指數為24.62；B5R蛋白的理論等電點（pI）為4.89，原子總量為17223，脂肪族氨基酸指數為26.57；A27L蛋白的理論等電點（pI）為4.85，原子總量為20511，脂肪族氨基酸指數為25.25。4種蛋白在哺乳動物體外半衰期均為4.4 h，在酵母體內半衰期均大于20 h，在大腸桿菌體內半衰期均大于10 h。A33R蛋白的不穩定系數為86.17，L1R蛋白的不穩定系數為56.53，B5R蛋白的不穩定系數為67.19，A27L蛋白的不穩定系數為56.19，4個蛋白的不穩定系數均大于穩定蛋白的臨界值40，說明它們均為不穩定蛋白。A33R蛋白的親水系數為1.101，L1R蛋白的親水系數為0.983，B5R蛋白的親水系數為1.063，A27L蛋白的親水系數為1.002。它們的親水系數均大于0，可能都屬于疏水性蛋白。

A33R、L1R、B5R和A27L蛋白均只由Ala（A）、Cys（C）、Gly（G）和Thr（T）4種氨基酸組成。如表2所示，A33R蛋白中Ala（A）占比為30.4%，Cys（C）占比為30.4%，Gly（G）占比為23.5%，Thr（T）占比為15.8%，沒有帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+ Lys）和帶負電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu）。如表3所示，L1R蛋白中Ala（A）占比為24.6%，Cys（C）占比為30.7%，Gly（G）占比為28.3%，Thr（T）占比為16.3%，沒有帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+ Lys）和帶負電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu）。如表4所示，B5R蛋白中Ala（A）占比為26.6%，Cys（C）占比為32.0%，Gly（G）占比為25.2%，Thr（T）占比為16.3%，沒有帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+ Lys）和帶負電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu）。如表5所示，A27L蛋白中Ala（A）占比為25.3%，Cys（C）占比為30.4%，Gly（G）占比為32.4%，Thr（T）占比為11.9%，沒有帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+ Lys）和帶負電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu）。

3.6 A33R、L1R、B5R和A27L蛋白的親水性分析

用SIB瑞士生物信息學研究所運營的ExPAsy在線軟件中的ProtScale工具分析A33R、L1R、B5R和A27L蛋白的親疏水性。如圖5所示的親水性分析圖譜，坐標軸負值區域的為親水峰，坐標軸正值區域為疏水峰。因此根據4個蛋白的親水性分析圖譜中的親水峰和疏水峰，可以判斷出它們均為疏水蛋白，與ProtParam工具預測得到的親水系數的結果一致。

3.7 A33R、L1R、B5R和A27L蛋白的信號肽預測

用DTU Health Tech 官網的SignalP4.1 service在線軟件分析 A33R、L1R、B5R和A27L蛋白的信號肽。圖6為信號肽預測圖譜，其中：C值用來區分是否為剪切位點，最高峰值為剪切位點后的第一個氨基酸；S值用來區分相應位置是否為信號肽區域；Y值是C值和S值的幾何平均數，用于避免多個高C值對結果的影響。同時，軟件在分析圖譜時，還會給出相應的D值。D值是S值的平均值和Y值的最大值的加權平均數值，對于含信號肽的蛋白，它的D值應大于0.500。

根據軟件的預測，A33R蛋白的D值為0.574，L1R蛋白的D值為0.637，B5R蛋白的D值為0.390，A27L蛋白的D值為0.511。由于A33R、L1R和A27L的預測D值都大于0.500，只有B5R的小于0.500，故可以得知A33R、L1R和A27L都有信號肽區域，屬于分泌蛋白，而B5R沒有信號肽區域，不屬于分泌蛋白。再結合信號肽預測的圖譜，可以預測到A33R信號肽的切割位點位于第27和第28個氨基酸之間，L1R信號肽的切割位點位于第24和第25個氨基酸之間，A27L信號肽的切割位點位于第27和第28個氨基酸之間。

4 結束語

本研究用PGEX-6P-1為載體，成功構建了4個重組目的蛋白表達質粒。用大腸桿菌DE3感受態細胞轉化重組質粒后，在體外誘導表達和純化。通過考馬斯亮藍和WB驗證可得知成功誘導表達并純化出帶GST標簽的目的蛋白。通過生物信息學的方法分析可知4個蛋白均為疏水蛋白，且A33R、L1R和A27L均為分泌蛋白。本研究所純化出猴痘病毒的4個關鍵蛋白，對研究猴痘病毒感染宿主的分子機理、阻斷病毒與靶細胞的結合有著重要的意義，同時為猴痘病毒診斷抗原、抗血清抗體或單克隆抗體的篩選和制備提供原材料，進而為建立猴痘病毒的ELISA抗體檢測方法和膠體金免疫層析等快速檢測方法，以及猴痘病毒疫苗的制備奠定基礎，有望協助猴痘病毒防控檢測與藥物的篩選和研制。

［ 參 考 文 獻 ］

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Expression， Purification and Characterization of A33R， L1R， B5R

and A27L Proteins of Monkeypox Virus

ZHAN Sijian， ZHANG Fan， DUAN Haixiao， WANG Yang， HU Han， LIU Binlei

（School of Biological Engineering and Food， Hubei Univ. of Tech.， Wuhan 430068， China）

Abstract： This paper intends to explore the prokaryotic expression of GST-agged fusion proteins A33R， L1R， B5R and A27L， and conduct a brief analysis of some biological characteristics of these four proteins， laying the foundation for monkeypox virus antigen preparation and vaccine preparation. Recombinant fusion protein expression plasmid was constructed with PGEX-6P-1 as vector. The recombinant plasmid was transformed into E. coli DE3 competent cells and induced to express and purify in vitro. The purified protein was subjected to SDS-PAGE electrophoresis， Coomassie brilliant blue staining analysis and WB verification. Finally， the biological characteristics of the four proteins were analyzed by bioinformatics methods， and the physical and chemical properties of the four proteins were analyzed by ProtParam tool in ExPAsy online software. The ProtScale tool in ExPAsy online software was used to analyze the hydrophilicity and hydrophobicity of the four proteins. The signal peptides of the four proteins were analyzed by SignalP4.1 service online software. Four recombinant expression plasmids were successfully constructed. Coomassie brilliant blue and WB verification showed that the target protein with GST tag was successfully induced and purified. Bioinformatics analysis showed that four proteins were hydrophobic proteins， except B5R， A33R， L1R and A27L were secretory proteins. In this study， four proteins of monkeypox virus were purified by prokaryotic expression， and the biological characteristics of these four proteins were analyzed by bioinformatics， which provided a theoretical basis for antigen preparation and vaccine preparation of monkeypox virus.

Keywords： monkeypox virus; prokaryotic expression; protein purification; bioinformatics

［責任編校： 張 眾］

［收稿日期］ 2022-12-21

［第一作者］ 詹思建（1999-）， 男， 湖北麻城人， 湖北工業大學碩士研究生， 研究方向為生物與醫藥。

［通信作者］ 劉濱磊（1962-）， 男， 湖北武漢人， 湖北工業大學教授， 研究方向為生物制藥。

［文章編號］ 1003-4684（2024）05-0080-07