γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝及濃縮方法對比研究

［摘 要］ 為選擇合適的包裝條件與安全高效的濃縮方法生產(chǎn)用于CAR-T制備的γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，使用兩種包裝條件γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體（pMIG與pMIG Ⅱ）和包裝質(zhì)粒總量（20 μg與40 μg）分別生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同條件下生產(chǎn)的病毒滴度；使用超速離心與超濾離心兩種濃縮方法得到逆轉(zhuǎn)錄病毒濃縮液，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)，檢測兩種病毒濃縮液滴度及其對T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，并監(jiān)測CAR-T細(xì)胞增殖與存活率。數(shù)據(jù)顯示，pMIG Ⅱ載體包裝病毒滴度較高（p lt; 0.05），20 μg與40 μg質(zhì)粒總量對病毒滴度無顯著影響（p gt; 0.05），超濾離心法與超速離心法濃縮后逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度無顯著差異（p gt; 0.05）。研究表明，pMIG Ⅱ載體與20 μg質(zhì)粒總量更適合包裝γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒，超濾離心法可用于實驗室小規(guī)模濃縮逆轉(zhuǎn)錄病毒，滿足CAR-T研究的需要。

［關(guān)鍵詞］ γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；病毒包裝；超速離心；超濾離心；CAR-T細(xì)胞

［中圖分類號］ R153 "［文獻(xiàn)標(biāo)識碼］ A

嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptor-T cells， CAR-T cells）療法是過繼細(xì)胞療法（adoptive cell therapy，ACT）的一種，即在體外分離改造供者T淋巴細(xì)胞，進(jìn)而回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，實現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷［1］。CAR-T療法用于多種血液系統(tǒng)腫瘤治療，已應(yīng)用于臨床試驗的靶點有CD19、CD20、CD22、NKG2D和ROR1等［2］。基于CD19靶點的CD19 CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品Yescarta（Axi-cel）于2017年10月被FDA批準(zhǔn)用于大B細(xì)胞淋巴瘤，是全球首個獲批的CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品。CD19 CAR-T的制備流程及檢測方法較成熟，本研究以此為例進(jìn)行探索。

目前，γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體與慢病毒載體是向T細(xì)胞中遞送CAR基因應(yīng)用最廣泛的病毒載體［3］。γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體與慢病毒載體在感染宿主細(xì)胞后，病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA，穩(wěn)定整合至宿主DNA中，可以實現(xiàn)CAR基因的高效傳遞與穩(wěn)定表達(dá)［4］。生產(chǎn)高滴度病毒載體是相關(guān)試驗開展的重要保證，本文從γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝條件優(yōu)化與濃縮方法比較兩方面展開研究。

包裝條件優(yōu)化涵蓋很多方面，本課題組前期已對γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝質(zhì)粒（目的基因表達(dá)質(zhì)粒與輔助包裝質(zhì)粒）比例及質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑比例進(jìn)行優(yōu)化，但質(zhì)粒加入量對病毒滴度的影響尚不清楚。另外，本研究用到的攜帶CAR基因的pMIG（pMSCV-IRES-GFP）表達(dá)載體與pMIG Ⅱ（pMSCV-IRES-GFP Ⅱ）表達(dá)載體均基于鼠胚胎干細(xì)胞病毒（murine embryonic stem cell virus，MESV）與LNL6表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染均一性較高，更有利于目的基因表達(dá)，但這兩種表達(dá)載體對逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝的影響仍需要進(jìn)一步探究。故對γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝條件的優(yōu)化在本研究中主要針對質(zhì)粒量與表達(dá)載體展開。

目前逆轉(zhuǎn)錄病毒濃縮的下游工藝主要運(yùn)用的方法包括超速離心與超濾離心等。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠使用超速離心法進(jìn)行濃縮，取決于其具有穩(wěn)定的包膜蛋白——水泡性口炎病毒糖蛋白（vesicular stomatitis virus-G protein， VSV-G）和病毒內(nèi)核的類型［5-6］。有研究表明，使用離心力36 026×g濃縮逆轉(zhuǎn)錄病毒后滴度可達(dá)到約4×107 TU/mL，經(jīng)4輪連續(xù)濃縮后滴度可達(dá)到約1.6×108 TU/mL［7］。但過高的離心力在濃縮病毒顆粒的同時，也會給病毒顆粒施加剪切力，導(dǎo)致病毒顆粒失活，病毒滴度降低。有研究發(fā)現(xiàn)，離心力從90 000×g降至20 000×g時，慢病毒滴度提高約3倍［8］。

超濾離心法則是打破了超速離心的限制，為逆轉(zhuǎn)錄病毒濃縮提供了新思路。超濾離心對病毒的限制較小，可以濃縮逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒等［9］。超濾濃縮法濃縮病毒顆粒多用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及實驗室大規(guī)模生產(chǎn)，如使用切向流過濾系統(tǒng)濃縮大批量的慢病毒載體［10］。有研究發(fā)現(xiàn)，慢病毒更適合用超濾離心法濃縮，而逆轉(zhuǎn)錄病毒的超濾濃縮研究較少［11-12］。本文優(yōu)化逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝條件，并使用兩種濃縮方法生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒，探索了兩種濃縮方法對病毒滴度、CAR-T細(xì)胞陽性率、活力的影響，為制備高滴度逆轉(zhuǎn)錄病毒提供了參考。

1 實驗材料

BALB/c-SPF級雌鼠購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)；人胚胎腎293T細(xì)胞系HEK-293T和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系NIH/3T3均由本實驗室保存；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒pMSCV-CAR-IRES-GFP、pMSCV-CAR-IRES-GFP Ⅱ和輔助包裝質(zhì)粒pCL-ECO均由本實驗室保存。Opti-MEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基以及DME/F-12培養(yǎng)基均購自Hyclone公司；胎牛血清（FBS）購自碧云天公司與Gibco公司；重組人白介素-2（IL-2）購自Peprotech公司；鞘液、鼠源T淋巴細(xì)胞分離磁珠、鼠源CD3e抗體及鼠源CD28抗體購自BD公司；紅細(xì)胞裂解液（ACK Lysis Buffer）購自Biosharp公司；非必須氨基酸與丙酮酸鈉均購自Thermo Fisher公司；HEPES購自Biofroxx公司；PE-CD19蛋白購自Acro system公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipo8000TM購自碧云天公司；Retronectin購自TAKARA公司；聚凝胺（Polybrene）購自Sigma公司；0.45 μm濾膜購自PALL公司；6孔板、24孔板與96孔板均購自JET公司；超速離心管購自BECKMAN公司；超濾管購自Merck公司；高速冷凍離心機(jī)購自Thermo Fisher公司；超速離心機(jī)購自BECKMAN公司。

2 實驗方法

2.1 逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝

將HEK-293T細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度為4×106 個/皿，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞匯合度在80%以上后進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。首先將每個皿更換10 mL新鮮的完全培養(yǎng)基，按照Lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑說明書，使用Opti-MEM培養(yǎng)基配制轉(zhuǎn)染體系；分別于48 h和72 h兩個時間點收集逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液，放于4℃冰箱保存，收集的病毒上清液用于逆轉(zhuǎn)錄病毒濃縮。

2.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒澄清與濃縮

用0.45 μm濾膜過濾澄清逆轉(zhuǎn)錄病毒上清，去除細(xì)胞碎片及其他雜質(zhì)。將逆轉(zhuǎn)錄病毒上清加入到超速離心管中，配平誤差在± 0.02 g，配平后使用超速離心機(jī)進(jìn)行超速離心（72 000×g，2 h，4℃）。離心后去除上清液，使用RPMI-1640培養(yǎng)基收集病毒顆粒，得到超速離心法濃縮的逆轉(zhuǎn)錄病毒濃縮液。將逆轉(zhuǎn)錄病毒上清加入到截留分子量為100 ku的超濾管中，確保配平誤差在±0.02 g，配平后使用高速冷凍離心機(jī)離心（4000×g，40 min，4℃），離心后收集上室濃縮液，得到超濾離心法濃縮的逆轉(zhuǎn)錄病毒濃縮液。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度

將NIH/3T3細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為4×106 個/孔。放于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞匯合度在80%以上更換含有6 μg/mL polybrene的10%-FBS-DME/F-12培養(yǎng)基，于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置30 min后加入10 μL梯度稀釋后的逆轉(zhuǎn)錄病毒。于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中放置48 h后收集NIH/3T3細(xì)胞，用PBS洗滌兩遍后使用流式細(xì)胞儀檢測逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度。計算公式為：病毒滴度（TU/mL）=（細(xì)胞數(shù)目×GFP陽性率×稀釋倍數(shù)）/每孔病毒加入量（mL）。

2.4 鼠源CAR-T細(xì)胞制備及培養(yǎng)

斷頸處死BALB/c-SPF級雌鼠，分離脾臟后放置于10 mL RPMI培養(yǎng)基中。將脾臟取出后充分研磨，經(jīng)70 μm濾網(wǎng)過濾后加入5 mL紅細(xì)胞裂解液反應(yīng)5 min，加入10 mL PBS終止裂解反應(yīng)，于500×g離心5 min后得到小鼠脾細(xì)胞。將小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)2天后使用小鼠T淋巴細(xì)胞分離試劑盒分離小鼠T細(xì)胞，使用含非必須氨基酸、丙酮酸鈉、HEPES buffer和β-巰基乙醇的10%-FBS-RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠T細(xì)胞，同時加入白細(xì)胞介素-2和三抗。使用Retronectin包被24孔板，4℃放置過夜后棄去Retronectin溶液，以MOI=10的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)5×105個鼠源T細(xì)胞，2000×g，90 min離心得到鼠源CAR-T細(xì)胞。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測嵌合抗原受體表達(dá)

收集鼠源T細(xì)胞與鼠源CAR-T細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個/500 μL，使用500 μL PBS洗滌2遍后，再使用人血清封閉30 min，接著加入PE-CD19蛋白孵育40 min，最后使用500 μL PBS洗滌2遍后使用流式細(xì)胞儀檢測。

2.6 RT-qPCR檢測

分別收集1×106個鼠源T細(xì)胞與鼠源CAR-T細(xì)胞，按照總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞RNA，并依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。本實驗以18s rRNA為內(nèi)參，通過RT-qPCR測定目的基因轉(zhuǎn)錄。引物序列如下：18s rRNA-F： ACAGGATTGACAGATTGA，18s rRNA-R： TATCGGAATTAACCAGACA， CAR VL-F： CAAGTCAGGACATTAGTA， CAR VL-R： AAGTAAGTGGCAATATCT， CAR VH-F： ACTGACCATCATCAAGGA， CAR VH-R： ACCACCGTAGTAATAATGTT，引物均由擎科生物武漢合成部合成。

2.7 統(tǒng)計學(xué)處理

本文使用GraphPad Prism 8軟件，用t檢驗對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，ns表示無差異，*p＜0.05，**p＜0.01。

3 實驗結(jié)果

3.1 逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝條件優(yōu)化

3.1.1 表達(dá)載體對比分析

使用pMSCV-CAR-IRES-GFP與pMSCV-CAR-IRES-GFP Ⅱ 2種逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝載體生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測病毒滴度。如圖1所示，在控制單一變量的情況下，使用pMSCV-CAR-IRES-GFP包裝載體（圖1a）生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒在未稀釋后感染NIH/3T3細(xì)胞48 h后，GFP陽性率為10.5%，而pMSCV-CAR-IRES-GFP Ⅱ包裝載體（圖1b）生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒GFP陽性率為18%。為進(jìn)一步驗證，使用2種載體質(zhì)粒分別生產(chǎn)3批病毒并計算病毒滴度。如圖1c所示，pMSCV-CAR-IRES-GFP Ⅱ（pMIG Ⅱ）包裝載體生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度顯著高于pMSCV-CAR-IRES-GFP（pMIG）包裝載體生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度。

3.1.2 質(zhì)粒總量對比分析

分別以質(zhì)粒總量20 μg與40 μg包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測病毒滴度。如圖2所示，質(zhì)粒總量20 μg時（圖1a）包裝生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒在稀釋10倍后感染NIH/3T3細(xì)胞48 h，GFP陽性率為2.77%。而質(zhì)粒總量40 μg時（圖1b），包裝生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒GFP陽性率為2.14%。2次重復(fù)試驗結(jié)果如圖2c所示，質(zhì)粒總量20 μg與40 μg生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度無顯著性差異。

3.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒濃縮條件優(yōu)化

3.2.1 濃縮方法對比分析

將逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液按不同濃縮方法濃縮后，使用流式細(xì)胞儀分別檢測未濃縮的病毒上清液、超濾離心濃縮的病毒濃縮液和超速離心濃縮的病毒濃縮液三種逆轉(zhuǎn)錄病毒的滴度。在控制單一變量的情況下，使用超濾離心法（圖3a）濃縮的逆轉(zhuǎn)錄病毒在稀釋100倍后感染NIH/3T3細(xì)胞48 h后，GFP陽性率為24.7%，而超速離心法（圖3b）濃縮的逆轉(zhuǎn)錄病毒GFP陽性率為13.2%。如圖3c圖所示，用于超濾離心的病毒，濃縮前滴度（均值為2.67×106 TU/mL）與用于超速離心的病毒濃縮前滴度（均值為2.33×106 TU/mL）無顯著性差異，而超濾離心法濃縮的逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度（均值為2.41×108 TU/mL）高于超速離心法濃縮的逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度（均值為1.83×108 TU/mL），但兩者經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析無顯著性差異。

3.2.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒活力檢測

為進(jìn)一步對比研究超速離心法與超濾離心法濃縮的逆轉(zhuǎn)錄病毒遞送靶基因的效果差異，分別使用兩種逆轉(zhuǎn)錄病毒濃縮液以感染復(fù)數(shù)MOI=10制備鼠源CAR-T細(xì)胞，并使用流式細(xì)胞術(shù)測定靶基因的表達(dá)情況。圖4 a使用流式細(xì)胞術(shù)檢測鼠源CAR-T細(xì)胞與CD19蛋白的結(jié)合。D19-PE重組蛋白可以與CAR陽性T細(xì)胞結(jié)合，通過檢測熒光素PE的陽性率即可得到CAR-T細(xì)胞的陽性率。結(jié)果顯示，使用超速離心法濃縮的逆轉(zhuǎn)錄病毒制備的鼠源CAR-T細(xì)胞陽性率更高。為進(jìn)一步驗證，重復(fù)3次試驗，如圖4b所示，超濾離心法濃縮的逆轉(zhuǎn)錄病毒，與超速離心法濃縮的逆轉(zhuǎn)錄病毒制備的CAR-T細(xì)胞陽性率無顯著性差異。圖4c是RT-qPCR定量檢測scFv結(jié)構(gòu)域VH與VL mRNA的轉(zhuǎn)錄的結(jié)果。結(jié)果顯示，不同方法濃縮的病毒濃縮液對VH基因轉(zhuǎn)錄影響不大，而超速離心法濃縮的逆轉(zhuǎn)錄病毒VL基因轉(zhuǎn)錄水平較超濾離心法濃縮的逆轉(zhuǎn)錄病毒顯著升高。

3.2.3 鼠源CAR-T細(xì)胞增值與存活率測定

為更進(jìn)一步對比研究兩種濃縮方法得到的逆轉(zhuǎn)錄病毒濃縮液對鼠源CAR-T細(xì)胞的影響，使用細(xì)胞計數(shù)儀記錄鼠源CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞存活率。如圖5所示為細(xì)胞增殖曲線（圖5a）與存活率曲線（圖5b）。結(jié)果顯示，在相同條件下，超濾離心與超速離心濃縮的逆轉(zhuǎn)錄病毒所制備的鼠源CAR-T細(xì)胞增殖數(shù)目與存活率之間均無顯著性差異。

4 討論與結(jié)論

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的生產(chǎn)過程分為包裝、澄清、濃縮、純化和儲存5個部分。本研究以包裝和濃縮兩個步驟為研究對象。就包裝步驟而言，本研究對質(zhì)粒載體和質(zhì)粒加入總量進(jìn)行對比分析，采用流式測定病毒滴度，能夠準(zhǔn)確測定出具有活性的病毒顆粒數(shù)［13］。研究結(jié)果顯示，使用pMIG Ⅱ表達(dá)載體生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度顯著高于pMIG表達(dá)載體生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度，且20 μg與40 μg的質(zhì)粒總量對病毒滴度無顯著影響，故后續(xù)實驗采用pMIG Ⅱ表達(dá)載體和20 μg質(zhì)粒總量的包裝條件。

目前常用的病毒濃縮方法包括超速離心、超濾離心、PEG沉淀和陰離子交換色譜，PEG沉淀可用于慢病毒載體濃縮，但操作周期長且容易產(chǎn)生非特異性沉淀，導(dǎo)致病毒濃縮液雜質(zhì)過多，不利于CAR-T細(xì)胞制備［16］；陰離子交換色譜可用于大規(guī)模濃縮慢病毒載體，但高濃度鹽溶液會損傷病毒包膜，降低病毒載體感染T細(xì)胞的效率［15］；超速離心（gt;20 000×g）常用于濃縮病毒載體，可獲得高滴度、低雜質(zhì)病毒濃縮液，但該方法設(shè)備要求較高，離心時間長（2～3 h），有一定的安全風(fēng)險，不利于大規(guī)模制備和實驗室生產(chǎn)。

之前有研究報道稱，超速離心法濃縮后逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度高于超濾法濃縮后逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度［14］。但研究結(jié)果表明，超濾離心濃縮后逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度高于超速離心濃縮后逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度。這一結(jié)果與上述研究結(jié)論有所區(qū)別，究其原因可能為不同過濾裝置會影響逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度。上述研究中超濾法使用Millipore centricon-30過濾器，這一過濾器無死體積保留，需要在過濾后使用回收管回收病毒濃縮液，這一過程會導(dǎo)致濾膜吸附病毒粒子，降低濃縮效率。而本研究使用Millipore UFC9100過濾器，能夠在離心后保留約50 μL的死體積，不需要再回收，故降低了病毒粒子損失。

除此之外，有研究超濾法對慢病毒濃縮的影響，數(shù)據(jù)顯示超濾法能夠?qū)⒙《镜味葟?.02×106 VP/mL濃縮至2.7×108 VP/mL，說明超濾法適合實驗室慢病毒的濃縮［15］。也有研究對比兩種濃縮方式對慢病毒的影響，發(fā)現(xiàn)超濾離心濃縮效果優(yōu)于超速離心［11］。

就本研究結(jié)果而言，盡管超濾離心法濃縮后逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度（2.41×108 TU/mL）高于超速離心法濃縮后逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度（1.83×108 TU/mL），但兩者間無統(tǒng)計學(xué)差異。并且，兩種濃縮方法對病毒濃縮液轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、CAR-T細(xì)胞增殖和存活率均無顯著影響。但考慮到CAR-T細(xì)胞增殖和存活率以及逆轉(zhuǎn)錄病毒濃縮液對T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響還受質(zhì)粒的質(zhì)量、病毒的比活及病毒的純度等多種因素影響，故兩種濃縮方法在細(xì)胞水平的對比研究有待進(jìn)一步深入。

本試驗研究發(fā)現(xiàn)，pMIG Ⅱ載體與20 μg質(zhì)粒總量更適合包裝γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒，超濾離心法可用于實驗室小規(guī)模濃縮逆轉(zhuǎn)錄病毒，滿足CAR-T研究的需要。

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Comparative Study on Packaging and Concentration Methods

of γ - Retrovirus Vector

ZHANG Fan1， CHENG Yining1， SHEN Qi1， ZHAN Sijian1， WANG Yang1， HU Han1， LIU Binlei1，2

（1 Biological Engineering and Food， Hubei Univ. of Tech.， Wuhan 430068，China;

2 Wuhan Binhui Biotechnology Co.， Ltd， Wuhan 436030，China）

Abstract： For the optimization of packaging conditions and concentration methods for γ-retroviral vector production for CAR-T production， two packaging vectors （pMIG and pMIG II） and different amounts of plasmids （20 μg and 40 μg） were used to produce retrovirus， respectively， and the virus titers were detected by flow cytometry; Ultracentrifugation and ultrafiltration were used to concentrate the retrovirus， the titer of the two viruses and their transduction efficiency on T cells were detected by flow cytometry， the proliferation and survival rate of CAR-T cells were monitored. The data showed that the virus titer was higher using pMIG II vector （plt;0.05）， the different amounts of plasmids （20 μg and 40 μg） did not affect the virus titer （pgt;0.05）， ultrafiltration and ultracentrifugation concentration methods did not affect the virus titer （pgt;0.05）. The results showed that pMIG II vector and the total amount of 20 μg plasmid were suitable for packaging γ-retrovirus， and ultrafiltration can be used for small-scale concentration of retrovirus in the laboratory to content the needs of CAR-T research.

Keywords： γ-retroviral vector; virus packaging; ultracentrifugation; ultrafiltration centrifugation; CAR-T cells

［責(zé)任編校： 張 眾］

［收稿日期］ 2023-03-08

［第一作者］ 張 帆（1996-）， 男，" 甘肅民樂人，" 湖北工業(yè)大學(xué)碩士研究生，" 研究方向為腫瘤免疫治療。

［通信作者］ 劉濱磊（1962-）， 男，" 湖北武漢人，" 湖北工業(yè)大學(xué)教授，" 研究方向為腫瘤免疫治療、" 生物制藥與溶瘤病毒。

［文章編號］ 1003-4684（2024）05-0074-06