HU-308和ACPA對斑馬魚的行為影響評價(jià)

［摘 要］ 為了解興奮劑對脊椎動物早期發(fā)育的影響，以斑馬魚為研究對象，以HU-308和ACPA為興奮劑，對斑馬魚的心率和體長兩項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在一定濃度梯度范圍內(nèi)，HU-308和ACPA興奮劑對體長的影響均不大，ACPA的濃度為0.5 μmol/L時(shí)，對心率的影響最大；HU-308的濃度為50 μmol/L時(shí)，對心率的影響最大。兩者均可以加快斑馬魚的心率。

［關(guān)鍵詞］ 脊椎動物早期發(fā)育； 激動劑； 心率

［中圖分類號］ R741" ［文獻(xiàn)標(biāo)識碼］ A

由于脊椎動物早期發(fā)育的速度極快，了解胚胎和幼體的突觸以及神經(jīng)系統(tǒng)是如何發(fā)育的非常重要［1］。大麻在醫(yī)藥上已經(jīng)應(yīng)用了數(shù)千年［2］，大麻的活性化合物是大麻素，內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)對脊椎動物的發(fā)育有著至關(guān)重要的影響［3］。斑馬魚基因與人類基因的相似度達(dá)到87％。其產(chǎn)卵量大，胚胎透明，胚胎在24 h內(nèi)就可發(fā)育成形，而藥物溶于水中，斑馬魚胚胎可以通過皮膚吸收這些藥物［4-5］，故斑馬魚很適合作為胚胎早期發(fā)育的研究模型。另外，HU-308為CB2的靶向興奮劑，ACPA為CB1的靶向興奮劑。以斑馬魚為模型，以HU-308和ACPA為興奮劑，以心率和體長為指標(biāo)，對斑馬魚進(jìn)行了研究，以了解HU-308和ACPA兩種興奮劑對斑馬魚的心率和體長的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

HU-308，millipore sigma；ACPA，abcam；斑馬魚胚胎，阿爾伯塔大學(xué)斑馬魚培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室；斑馬魚胚胎培養(yǎng)液，阿爾伯塔大學(xué)斑馬魚培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)所用溶液配制

2.1.1 HU-308溶液的配制

將5 mg藥物溶解于1.206 mL的DMSO，即得濃度為10 mmol/L的HU-308儲備液。用移液槍移取50 μL濃度為10 mmol/L的儲備液到50 μL的DMSO溶液中，即得濃度為5 mmol/L的儲備液。用移液槍移取50 μL濃度為5 mmol/L的儲備液到450 μL的DMSO溶液中，即得濃度為500 μmol/L的實(shí)驗(yàn)用溶液，逐級稀釋即得濃度為50，5，0.5，0.05 μmol/L的實(shí)驗(yàn)用溶液。

2.1.2 ACPA溶液的制備

所購得的ACPA溶液的物質(zhì)的量濃度為29 mmol/L，即儲備液濃度為29 mmol/L。用移液槍移取50 μL濃度為29 mmol/L的儲備液到95 μL的乙醇溶液中，即得濃度為10 mmol/L的儲備液。經(jīng)過逐級稀釋即得濃度為500，50，5，0.5，0.05 μmol/L的實(shí)驗(yàn)用溶液。

2.2 興奮劑濃度初步篩選

2.2.1 胚胎收集及給藥

1）設(shè)置水箱。檢查水位是否低于300 mm，若不低于300 mm，準(zhǔn)備好最近兩周沒產(chǎn)過卵的魚，每個(gè)魚缸放入一條雄魚，兩條雌魚，并將雄魚和雌魚用隔板隔開，靜置一晚上。

2）收集魚卵。第2天早上，取下隔板，靜候15～20 min使其產(chǎn)卵，將所產(chǎn)下的斑馬魚胚胎收集到培養(yǎng)皿中，換3次水，以便魚卵能夠生存。

3）給藥。將收集到的魚卵分裝到小培養(yǎng)皿（直徑60 mm）中，每個(gè)培養(yǎng)皿中25個(gè)魚卵，用膠頭滴管除去培養(yǎng)皿中的水，加入4 mL養(yǎng)魚卵專用水，加入4 μL藥物溶液，搖勻后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每24 h換一次水。

2.2.2 體長的測定

該項(xiàng)指標(biāo)在胚胎發(fā)育的第2天開始檢測。樣品共分為3組：空白對照組（命名為Untreated control或Untreated）、溶劑對照組（其中ACPA命名為Ethanol，HU-308命名為DMSO）、濃度梯度組（其中ACPA的濃度分別為0.05，0.5，5，50，500 μmol/L，HU-308的濃度分別為0.05，0.5，5，50，500 μmol/L）。每個(gè)樣品根據(jù)實(shí)驗(yàn)安排重復(fù)該實(shí)驗(yàn)3到5次。檢測所用軟件為AOS軟件，檢測時(shí)，先用膠頭滴管轉(zhuǎn)移10～15條魚至培養(yǎng)皿中，使所有的魚都處于視野中，記錄下照片并保存。所得數(shù)據(jù)用proanalyst軟件進(jìn)行分析。

2.2.3 心率的測定

該項(xiàng)指標(biāo)在胚胎發(fā)育的第2天開始檢測，檢測分組同2.2.2小節(jié)中體長的分組方法，每個(gè)樣品根據(jù)實(shí)驗(yàn)安排重復(fù)該實(shí)驗(yàn)3～5次。檢測步驟為：錄制斑馬魚心跳視頻并保存，所得數(shù)據(jù)用proanalyst軟件進(jìn)行分析即可得到檢測結(jié)果。

2.3 結(jié)果與討論

由圖1可知，給予斑馬魚胚胎ACPA興奮劑培養(yǎng)至48 h時(shí)，與空白對照組相比，ACPA濃度為0.5 μmol/L時(shí)對斑馬魚心率的影響最為顯著。濃度為0.05 μmol/L的檢測結(jié)果與空白對照組結(jié)果相比沒有顯著性差異，濃度為50 μmol/L和500 μmol/L的檢測結(jié)果與空白溶劑的檢測結(jié)果相一致，可能是乙醇作為溶劑有一定的干擾。濃度為5 μmol/L時(shí)，對斑馬魚心率的影響略高于50 μmol/L和500 μmol/L的檢測結(jié)果，但低于0.5 μmol/L的檢測結(jié)果。據(jù)報(bào)道，ACPA是CB1受體的靶向興奮劑［6-7］，可能是由于ACPA靶向激活了CB1受體，故給予ACPA興奮劑后加快了斑馬魚的心率。

給予斑馬魚胚胎HU-308興奮劑，培養(yǎng)至48 h時(shí)的心率檢測結(jié)果顯示（圖2），與空白對照組相比，HU-308濃度為5 μmol/L和50 μmol/L時(shí)對斑馬魚心率的影響最為顯著。濃度為0.05 μmol/L的檢測結(jié)果與空白對照組結(jié)果相比沒有顯著性差異，濃度為0.5 μmol/L的檢測結(jié)果與空白溶劑的檢測結(jié)果沒有顯著性差異，可能是DMSO作為溶劑有一定的干擾；濃度為500 μmol/L時(shí)對斑馬魚心率的影響略高于濃度為0.5 μmol/L的檢測結(jié)果，但低于濃度為5 μmol/L和50 μmol/L的檢測結(jié)果。據(jù)報(bào)道，HU-308是CB2受體的靶向興奮劑［8］，可能是由于當(dāng)HU-308存在時(shí)可激活CB2受體，故給予HU-308興奮劑后加快了斑馬魚的心率。

給予斑馬魚胚胎ACPA興奮劑并培養(yǎng)至48 h時(shí)的體長檢測結(jié)果顯示（圖3），與空白對照組相比，ACPA濃度為0.5 μmol/L時(shí)對斑馬魚體長的影響最為顯著，與空白對照組相比體長減小，可能是由于ACPA靶向激活了CB1受體，故給予ACPA興奮劑后，斑馬魚的體長變短。其他濃度的ACPA溶液和溶劑對照組與空白對照組的結(jié)果相比均沒有顯著性差異，說明所用的溶劑對該實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有干擾。

給予斑馬魚胚胎HU-308興奮劑并培養(yǎng)至48 h時(shí)的體長檢測結(jié)果顯示（圖4）。

與空白對照組相比，HU-308濃度為50 μmol/L時(shí)對斑馬魚體長的影響最為顯著，與空白對照組相比體長減小，可能是由于HU-308靶向激活了CB2受體，故給予HU-308興奮劑后使斑馬魚的體長變短。其他濃度的HU-308溶液和溶劑對照組與空白對照組的結(jié)果相比均沒有顯著性差異，說明所用的溶劑對該實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有干擾。

3 結(jié)論

本文以斑馬魚為研究對象，評價(jià)了HU-308和ACPA兩種興奮劑對斑馬魚胚胎心率和體長的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：ACPA進(jìn)行體長和心率檢測時(shí)，影響最大的濃度均為0.5 μmol/L；HU-308進(jìn)行心率和體長檢測時(shí)，影響最大的濃度均為50 μmol/L，并初步發(fā)現(xiàn)HU-308和ACPA兩種興奮劑在最佳濃度下對體長的影響均不大，但兩者均可以加快斑馬魚的心率。本研究有助于我們了解大麻素受體［9］的激活所產(chǎn)生的影響，初步了解CB1和CB2受體的激活，對胚胎的運(yùn)動神經(jīng)元的形態(tài)［10］以及對胚胎心率［11］的影響，為進(jìn)一步研究大麻二酚（CBD）在生物發(fā)育中的作用提供了參考。

［ 參 考 文 獻(xiàn) ］

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Effects of HU-308 and ACPA on Heart Rate

and Body Length of Zebrafish

ZHAI Beibei， SUN Hongmei

（School of Bioengineering and Food， Hubei Univ. of Tech.， Wuhan 430068， China）

Abstract： In order to understand the effects of agonists on the early development of vertebrates， we took zebrafish as the research object and used HU-308 and ACPA as agonists to measure the heart rate and body length of zebrafish. The results showed that the maximum concentration of ACPA in the detection of body length and heart rate was 0.5 μM. The maximum concentration of HU-308 for heart rate and body length detection was 50 μM， and preliminary findings showed that both HU-308 and ACPA had little effect on body length at the optimal concentration， but both could accelerate the heart rate of zebrafish.

Keywords： early development of vertebrates; Agonist; heart rate

［責(zé)任編校： 張 眾］

［收稿日期］ 2023-02-23

［第一作者］ 翟貝貝（1991-）， 女， 河南平頂山人， 湖北工業(yè)大學(xué)碩士研究生， 研究方向?yàn)樗巹W(xué)。

［通信作者］ 孫紅梅（1984-）， 女， 山東濟(jì)寧人， 湖北工業(yè)大學(xué)副教授， 研究方向?yàn)樾滦图{米藥物構(gòu)建及藥物作用機(jī)理。

［文章編號］ 1003-4684（2024）05-0071-03