槲皮素-3-O-乙酸-(4-硫代氨基)-苯酯的合成及其活性研究

［摘 要］ 以蘆丁為原料，以4-羥基硫代苯甲酰胺作為H2S供體，合成一種抗糖尿病且促進傷口愈合的新型化合物槲皮素-3-O-乙酸-（4-硫代氨基）-苯酯。工藝路線包括取代、水解、williamson醚化、水解、還原和酯化，共6步反應，總收率4.6%。各步產物經MS、1H NMR分析表征。通過HUVECs細胞增殖實驗、劃痕實驗以及胰島素抵抗模型實驗，驗證該化合物不僅具有降糖作用，還具有促進糖尿病患者傷口愈合的功效。

［關鍵詞］ 蘆丁； H2S供體； 抗糖尿病藥物； 降糖作用

［中圖分類號］ O626.32" ［文獻標識碼］ A

長期處在高血糖的狀態下，患者微血管發生病變［1］，進而會導致傷口愈合停滯。目前市場上主流的抗糖尿病藥物都沒有促進其患者傷口愈合的功效，但通過聯合給藥可以達到一個較好的療效［2-3］。槲皮素具有降低血糖水平的活性，但不容易被直接吸收［4］，對其進行結構修飾可以用作降血糖藥物［5］。H2S可以促進新生血管的形成，進而促進創面的愈合［6］。因此，本研究旨在利用藥物拼合原理［7］，將槲皮素與H2S供體合成一個新分子，同時發揮降血糖和促進傷口愈合的雙重作用［8］。

本研究以蘆丁為起始原料，以4-羥基硫代苯甲酰胺為H2S供體，經過取代、水解、williamson醚化、水解、還原和酯化反應得到目標化合物（Ⅰ）槲皮素-3-O-乙酸-（4-硫代氨基）-苯酯，其合成路線見圖1。通過HUVECs細胞增殖實驗、劃痕實驗和胰島素抵抗模型實驗驗證了目標化合物（Ⅰ）不僅具有降糖作用，還具有促進糖尿病患者傷口愈合的功效。本研究所制備的目標化合物（Ⅰ）不僅具有潛在的藥物開發價值，還具有廣闊的市場前景。

1 合成實驗

1.1 儀器與試劑

RE-3型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；WQS-3C型熔點儀，廣州儀表有限公司；MH-2型循環水式真空泵，寧波真空器械有限責任公司；400M超導核磁共振波譜儀，安捷倫科技有限公司。

溴化芐純度為99%，溴乙酸乙酯純度為98%，蘆丁純度為96%，Pd/C純度為10%，EDC純度為97%，HOBt純度為99%，4-羥基硫代苯甲酰胺純度為98%。其他試劑、溶劑均為分析純。所有試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 3’，4’，7-O-三芐基槲皮素（Ⅲ）的合成

將蘆丁（4.88 g，8 mmol）溶于40 mL DMF中，加入無水碳酸鉀（3.86 g，28 mmol），在28℃，氮氣保護下攪拌0.5 h，緩慢滴加溴化芐（3.8 mL，32 mmol），在60℃，氮氣保護下反應3 h。反應結束用10%的冰乙酸調節pH至5，過濾后取固體（Ⅱ）溶于120 mL乙醇，加熱至70℃，加入18 mL濃鹽酸，回流反應2 h，冷卻至室溫，過濾并烘干得3.5 g黃色固體（Ⅲ），收率71.7%。Mp：190～192。1H NMR（400 MHz，dmso）δ 12.40（s，1H），9.67（s，1H），7.88（s，1H），7.81（s，1H），7.49-7.33（m，15H），7.24（s，1H），6.83（s，1H），6.42（s，1H），5.22（s，6H）。

1.2.2 3’，4’，7-O-三芐基槲皮素-3-O-乙酸乙酯（Ⅳ）的合成

將化合物（Ⅲ）（2.3 g，4 mmol）溶于60 mL DMF中，加入無水K2CO3（690 mg，5 mmol），室溫攪拌30 min，緩慢滴加溶有溴乙酸乙酯（500 μL，4.4 mmol）的DMF溶液（15 mL），室溫反應2 h，用冰乙酸調節pH至6，用乙酸乙酯/水萃取，無水硫酸鈉干燥，過濾并減壓濃縮，經硅膠柱純化（w（丙酮）∶w（石油醚） = 1∶4）得到0.5 g黃色固體（Ⅳ），收率21.7%。Mp：121～122。1H NMR（400 MHz，dmso）δ 12.47-12.31（m，1H），7.88（d，J = 2.1 Hz，1H），7.84-7.72（m，1H），7.69-6.85（m，14H），6.84-6.59（m，1H），6.57-5.96（m，2H），5.54-5.21（m，4H），5.21-4.93（m，2H），4.79（d，J = 16.9 Hz，2H），4.21-3.97（m，2H），1.35-0.99（m，3H）。ESI-MS， m/z ： 659.23019，［M+H］+，理論值：658.22。

1.2.3 3’，4’，7-O-三芐基槲皮素-3-O-乙酸（Ⅴ）的合成

將化合物（Ⅳ）（2.63 g，4 mmol）溶于100 mL的NaOH水溶液（2 mmol/mL），回流反應3 h，冷卻至室溫，用3.6%的稀鹽酸調節pH至2～3，用乙酸乙酯/水萃取，調節有機相的pH至5～6，濃縮并烘干，得2.36 g 黃色固體（Ⅴ），收率90%。Mp：164～165。1H NMR（400 MHz，dmso）δ 13.01（s，1H），12.45（s，1H），7.98（s，1H），7.75（s，1H），7.48-7.33（m，15H），7.18（s，1H），6.80（s，1H），6.42（s，1H），5.21（s，6H），4.74（s，2H）。ESI-MS，m/z ： 631.19905，［M+H］+，理論值：630.19。

1.2.4 槲皮素-3-O-乙酸（Ⅵ）的合成

將化合物（Ⅴ）（600 mg，1 mmol）溶于60 mL混合溶液（w（二氯甲烷）∶w（甲醇） = 2∶1），加入Pd/C（10%，60 mg）置于加氫反應釜，25℃，反應7 h，反應液經離心、過濾、濃縮并烘干得到314 mg黃色固體（Ⅵ），收率52%。1H NMR（400 MHz，dmso）δ 12.51（s，1H），10.84（s，1H），9.74（s，1H），9.28（s，2H），7.53（s，1H），6.85（d，J = 9.1 Hz，1H），6.84（s，1H），6.38（s，1H），6.17（s，1H），4.65（s，2H）。ESI-MS，m/z ： 361.05522 ［M+H］+，理論值：360.05。

1.2.5 槲皮素-3-O-乙酸-（4-硫代氨基）-苯酯（Ⅰ）的合成

將化合物（Ⅵ）（100 mg，0.2778 mmol）溶于10 mL DMF，加入EDC（79.59 mg，0.4167 mmol），HOBt（63.76 mg，0.4167 mmol），在0℃攪拌1 h后，加入4-羥基硫代苯甲酰胺（63.76 mg，0.4167 mmol），0℃再次反應1 h后，升溫至25℃反應4 h，繼續升溫至30℃反應1 h，反應液濃縮到1～2 mL，加入50～60 mL的水，水洗并離心三次，經過濾烘干后，得到63 mg黃色固體（Ⅰ），收率63%。Mp：259～266。1H NMR（400 MHz，dmso）δ 12.45（s，1H），9.87（s，1H），9.48（s，2H），8.33（s，2H），7.92（s，2H），7.54（s，1H），7.13（s，2H），6.83（s，1H），6.74（s，1H），6.45（s，1H），6.18（s，1H）。ESI-MS，m/z ： 496.069 79 ［M+H］+，理論值：495.02。

2 細胞實驗

2.1 儀器與試劑

DX-23YC型細胞培養箱，廣州泰溫機電設備有限公司；AIRTECH-3型細胞用超凈工作臺，蘇凈安泰；IYD-3型熒光倒置顯微鏡，日本Olympus；BioTek酶標儀，美國BD；SU-DH-100超低溫冷凍儲存箱，海爾集團，2 mL凍存管，Thermo Scientific。

DMSO，氯化鈉、氯化鉀、十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀均為分析純；DMEM（低糖）培養基，DMEM（高糖）培養基，胎牛血清，PBS，MTT純度（98%），胰酶溶液（0.25%），DMSO（細胞凍存級），乙醇（95%）；二甲雙胍（95%），葡萄糖檢測試劑盒，HUVECs專用培養基，鈣黃綠素AM染色劑，康寧BD Matrigel基質膠。

2.2 細胞增值實驗

將HUVECs細胞接種于96孔板，使每孔有（1～2）×104個細胞；將96孔板放入培養箱培養（37℃，5% CO2）24 h，待細胞生長至70% ～80%融合。將化合物（I）（儲存濃度為10 mmol/L DMSO）、槲皮素（儲存濃度為10 mmol/L DMSO）、4-羥基硫代苯甲酰胺（儲存濃度為10 mmol/L DMSO）用低糖完全培養基（葡萄糖濃度為5.5 mmol/L）和高糖完全培養基（葡萄糖濃度為25.5 mmol/L）分別倍減稀釋配制成不同濃度，棄去96孔板上層培養基，換為含有不同濃度的槲皮素、4-羥基硫代苯甲酰胺以及化合物（I）的培養液。將96孔板繼續放入細胞培養箱培養24 h，于實驗終止前4 h，每孔加入20 μL新配制的5 mg/mL MTT溶液，繼續培養4 h后取出，棄去上清液，然后每孔加入150 μL DMSO，振蕩10～20 min，直至藍紫色顆粒完全溶解后，于酶標儀上490 nm波長測定吸光度值，計算細胞增長率。對照組增長率為0，每組實驗設5組重復實驗。對照組在給藥干預這一步驟中用的是不含藥物的培養基，除此步驟外其余步驟以及處理方式和實驗組相同。

細胞增殖率=實驗組OD-對照組OD對照組OD×100%

分組情況為：對照組（Control）、高糖組（HG）、槲皮素（HPS）、4-羥基硫代苯甲酰胺（a）、化合物（I）（A）、物理混合（HPS+a）、高糖+槲皮素（HG+HPS）、高糖+4-羥基硫代苯甲酰胺（HG+a）、高糖+化合物（I）（HG+A）、高糖+物理混合（HG+HPS+a）。

2.3 劃痕實驗

培養傳代HUVECs細胞，取對數期細胞接種于24孔板，放入恒溫細胞培養箱（37℃，5% CO2）培養過夜。用不含FBS的培養基將細胞饑餓12 h，用移液器吸頭（200 μL）劃傷創面，加入400 μL無血清含藥培養基。放入恒溫細胞培養箱（37℃、5% CO2）培養，按照0 h、24 h對劃痕傷口拍照。

分組情況為：對照組（Control）、高糖組（HG）、化合物（I）（A）、高糖+化合物（I）（HG+A）。

2.4 胰島素抵抗模型治療實驗

取對數期HepG2細胞接種于96孔板，放入培養箱（37℃，5% CO2）培養24 h，用PBS洗滌，分別用低糖培養基和高糖培養基孵育24 h，建立高糖誘導胰島素抵抗的細胞模型。棄去上清培養液，替換為用高糖培養基配置的分別含有化合物（Ⅰ）、槲皮素、4-羥基硫代苯甲酰胺、二甲雙胍以及槲皮素和4-羥基硫代苯甲酰胺物理混合的藥液，培養12 h，棄去含有藥液的培養基，替換為無 FBS的低糖培養基培養12 h。建立葡萄糖標準曲線，檢測每個實驗組的葡萄糖含量，計算消耗量。

分組情況為：對照組（Control）、高糖組（HG）、高糖+槲皮素（HG+HPS）、高糖+4-羥基硫代苯甲酰胺（HG+a）、高糖+化合物（I）（HG+A）、高糖+物理混合（HG+HPS+a）、高糖+二甲雙胍（Metformin）。

3 結果與討論

3.1 目標化合物（I）的結構表征

目標化合物（Ⅰ）是以蘆丁為基本原料，以4-羥基硫代苯甲酰胺作為H2S供體，通過取代、水解、williamson醚化、水解、還原和酯化共6步反應制備而成，其結構經MS、1H NMR分析表征的圖譜見圖2。目標化合物（Ⅰ）的理論分子量495.06 ，從圖2中可直接看出陽離子轟擊產生496.06979的峰，由質譜圖可初步判斷該步產物較大可能是目標化合物（Ⅰ）。

由圖3可知，目標化合物（Ⅰ）的核磁氫譜解析如下：1H NMR（400 MHz，dmso）δ 12.45（s，1H），9.87（s，1H），9.48（s，2H），8.33（s，2H），7.92（s，2H），7.54（s，1H），7.13（s，2H），6.83（s，1H），6.74（s，1H），6.45（s，1H），6.18（s，1H）?；瘜W位移處于4.63的質子積分面積為2.16，對應的是與酯鍵相連的亞甲基上的兩個質子；化學位移處于7.29的質子積分面積為2.06，對應的是右上端與苯基相連的兩個酚羥基；化學位移處于8.33的質子積分面積為2.26，對應的是硫代苯甲酰胺上面氨基的兩個質子；化學位移處于9.87的質子積分面積為1.01，對應的是最左端酚羥基中的一個質子；化學位移處于12.45的質子積分面積為1.01，對應左端的苯基上下端的酚羥基中的一個質子。鑒于以上，可證明合成的分子結構是目標化合物（I）。

3.2 細胞增殖實驗結果

在本實驗中，通過設置不同組分藥物對HUVECs細胞增殖率影響的濃度梯度實驗，得出不同組分藥物的最佳給藥濃度，以此作為后續細胞實驗中使用的最佳濃度。通過低糖環境和高糖環境給藥干預實驗，對比化合物（Ⅰ）、槲皮素和4-羥基硫代苯甲酰胺在最佳濃度下對細胞增殖率的影響。實驗結果如圖4所示。

由圖4可以得出化合物（Ⅰ）、槲皮素和4-羥基硫代苯甲酰胺對HUVECs細胞促進增殖的最佳濃度均為48 μmol/L。在對HUVECs細胞低糖環境和高糖環境的給藥實驗中，僅高糖作用而不用藥物治療時細胞增殖呈負增長，可以看出高糖環境抑制HUVECs細胞的增殖?；衔铮á瘢┰诘吞黔h境和高糖環境中均能促進HUVECs細胞增殖，驗證了其能夠促進糖尿病患者傷口愈合。單一H2S供體實驗組（a）以及槲皮素和H2S供體物理混合實驗組（HPS+a）在低糖環境和高糖環境都能促進HUVECs細胞增殖，但增長率均比化合物（Ⅰ）實驗組（A）小，說明單一的槲皮素或H2S供體和簡單的物理混合藥用效果不及化合物（Ⅰ），并且驗證了槲皮素對H2S促進HUVECs細胞增殖有協同作用。

3.3 劃痕實驗結果

在本實驗中，通過低糖環境給藥和高糖環境給藥干預來驗證化合物（Ⅰ）對HUVECs細胞的愈合速度是否具有促進效果，進而驗證化合物（Ⅰ）糖尿病患者傷口愈合是否有作用。實驗結果見圖5。

從圖5中可以看出，在低糖環境下，對照組HUVECs細胞可以按照正常的速度愈合，使用化合物（Ⅰ）干預后可以加快HUVECs細胞傷口的愈合；在高糖環境下細胞不能按照正常的速率愈合，而在高糖環境下使用化合物（Ⅰ）干預治療后，可以加快高糖環境的傷口愈合且效果顯著。這驗證了化合物（Ⅰ）對糖尿病患者的傷口愈合有促進作用。

3.4 胰島素抵抗模型治療實驗結果

在本實驗中，先通過高糖誘導創建HepG2細胞胰島素抵抗模型（IR-HepG2），再通過給藥干預，研究不同組分藥物對IR-HepG2的治療作用，以此來評價化合物（Ⅰ）的抗糖尿病活性。實驗結果如圖6所示。

由圖6可以看出，高糖干預而不進行藥物治療的實驗組葡萄糖，其消耗量低于對照組葡萄糖消耗量，顯示了高糖環境抑制葡萄糖的消耗。在高糖環境有藥物干預的實驗組中，化合物（Ⅰ）實驗組以及二甲雙胍實驗組葡萄糖消耗量相比高糖實驗組顯著提高，槲皮素實驗組、4-羥基硫代苯甲酰胺實驗組和物理混合實驗組的葡萄糖消耗量相比高糖實驗組也有提高，但消耗量不及前兩者，說明單一的槲皮素、4-羥基硫代苯甲酰胺和兩者簡單的物理混合的降糖效果不及化合物（Ⅰ）?；衔铮á瘢┚哂泻投纂p胍相似的降糖效果，表明了本研究合成的化合物（Ⅰ）有望成為一種良好的治療糖尿病的新藥。

4 結論

本研究以蘆丁為原料，以4-羥基硫代苯甲酰胺為H2S供體，經過六步反應合成了新型化合物槲皮素-3-O-乙酸-（4-硫代氨基）-苯酯，并通過MS、1H NMR確認目標化合物（Ⅰ）的化學結構。HUVECs細胞增殖實驗、劃痕實驗以及胰島素抵抗模型實驗驗證目標化合物（Ⅰ）既具有抗糖尿病的活性，又具有促進糖尿病患者傷口愈合的藥物活性。因此，本研究制備的槲皮素-3-O-乙酸-（4-硫代氨基）-苯酯在治療糖尿病以及促進患者傷口愈合方面具有潛在的藥物開發價值。

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Synthesis and Activity Research of Quercetin -3-O-

acetic acid -（4- thioamino）-phenyl Ester

SHANG Shikang， HUANG Xiaojiang， LIU Jian， HE Shibo， JIN Die， LIU Mingxing

（School of Biological Engin. and Food， Hubei Univ. of Tech.， Wuhan 430068，China）

Abstract： A novel compound quercetin-3-O-acetic acid-（4-thioamino）-phenyl ester， which is antidiabetic and promotes wound healing， was synthesized using rutin as raw material and 4-hydroxythiobenzamide as H2S donor. The process route included substitution， hydrolysis， williamson etherification， hydrolysis， reduction and esterification in six steps with an overall yield of 4.6%. The products of each step were characterized by MS and 1H NMR analysis. The compounds were verified by HUVECs cell proliferation assay， scratch assay and insulin resistance model assay to have not only hypoglycemic effect， but also the efficacy of promoting wound healing in diabetic patients.

Keywords： Rutin；H2S donor；Antidiabetic drug；Hypoglycemic effect

［責任編校： 張 眾］

［收稿日期］ 2022-11-01

［基金項目］ 國家級大學生創新創業訓練計劃項目（202110500010）

［第一作者］ 尚世康（2001-）， 男， 湖北隨州人， 湖北工業大學本科生， 研究方向為新藥研發。

［通信作者］ 劉明星（1970-）， 男， 湖北武漢人， 理學博士， 湖北工業大學教授， 研究方向為新藥研發。

［文章編號］ 1003-4684（2024）05-0060-05