紅曲霉發酵龍蝦殼產酸性蛋白酶分離純化及酶學性質研究

［摘 要］ 小龍蝦蝦殼廢棄物排放造成環境污染和資源浪費，而紅曲霉可以轉化利用蝦殼蛋白質。以小龍蝦蝦殼為唯一氮源，煙灰色紅曲霉BQ2液態發酵誘導其產胞外酸性蛋白酶。該酸性蛋白酶經硫酸銨鹽析沉淀和DEAE-Sepharose CL-6B陰離子交換柱層析分離純化，酶活為29.10 U/mL，純化倍數為11.42，相對分子質量為65 000。對其酶學性質進行研究，結果表明該酸性蛋白酶的最適反應pH為4.0，最適反應溫度為40℃。該酶屬于天冬氨酸蛋白酶，Pepstatin A 能強烈抑制其活性，Cu2+和Ca2+能抑制該蛋白酶活性，而Mg+、Zn2+和Fe3+對該蛋白酶的活性具有促進作用。

［關鍵詞］ 紅曲霉； 小龍蝦殼； 酸性蛋白酶； 酶學性質

［中圖分類號］ Q556" ［文獻標識碼］ A

小龍蝦，學名克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），屬于甲殼綱動物［1］，由于其美味和營養價值，深受人們喜愛，其產量和消費量逐年增加［2］。然而，小龍蝦在加工處理過程中會產生蝦殼等固態廢棄物［3］，目前這些小龍蝦廢棄物利用率較低。小龍蝦蝦殼中含有大量的營養成分和多種活性物質（如蛋白質、甲殼素和礦物質等）［4-6］。其丟棄不僅造成環境污染，還會造成資源的浪費。

紅曲霉（Monascus）是一種藥食兩用真菌，是重要的工業發酵微生物，在食品和醫藥等方面應用普遍［7-8］。它在發酵過程中不僅可以產生紅曲色素、洛伐他汀等有益的代謝產物。利用紅曲霉發酵小龍蝦蝦殼，不僅可以對小龍蝦蝦殼進行轉化利用，減少資源浪費和環境污染，還可以產生紅曲色素等多種有益的代謝產物［11］。

酸性蛋白酶是一種能在酸性情況下水解蛋白酶、多肽類物質的酶，在食品和藥品等行業應用廣泛［12-14］。紅曲霉發酵產生的酸性蛋白酶在發酵食品風味形成和高蛋白食品等應用上具有重要意義［15］。國內外研究中對紅曲霉發酵蝦殼蛋白產酸性蛋白酶的報道較少。因此本文以小龍蝦蝦殼蛋白質為唯一氮源，利用Monascus fuliginosus BQ2液態發酵小龍蝦蝦殼，發酵濾液分離純化，得到酸性蛋白酶，并對其酶學性質進行初步探討，為后續紅曲霉轉化利用蝦殼蛋白質提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

菌種：煙灰色紅曲霉BQ2（Monascus fuliginosus），湖北工業大學發酵工程教育部重點實驗室保藏。

蝦殼（小龍蝦），市購。將蝦殼徹底清洗并在60℃下烘干，將干蝦殼粉碎成粒徑為0.25～0.45 mm的蝦殼粉，備用。葡萄糖、可溶性淀粉、瓊脂、乳酸、乳酸鈉、酪氨酸、干酪素、福林酚試劑等均為國藥分析純。

1.2 儀器與設備

GI65DWS立式自動壓力蒸汽滅菌器，致微儀器有限公司；ZGJH-1214垂直流超凈工作臺，上海智城分析儀器制造有限公司；Thermo Fisher ST 16R高速冷凍離心機，賽默飛世爾科技有限公司；722S可見光分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；DYCP-31DN型水平電泳槽，北京六一儀器廠。

1.3 培養基配方

斜面培養基：6% 葡萄糖，2% 蛋白胨，3% 可溶性淀粉，3% 瓊脂。

二級種子培養基：0.5% NaNO3，0.15% K2HPO4，0.1% MgSO4，1% 蝦殼粉，用乳酸調pH 5.5～6.0。

發酵培養基：4%葡萄糖，0.2% K2HPO4，0.1% MgSO4，2%蝦殼粉，用乳酸調pH 5.5～6.0。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌種培養

一級種子培養：挑取一環紅曲霉接種于斜面培養基上，30℃恒溫箱培養7 d。

二級種子培養：用接種環在斜面培養基中刮取兩環接種到二級種子培養基中。 30℃、180 r/min培養2～3 d。

液體發酵培養：將10%二級種子液接種到發酵培養基上，在30℃、180 r/min搖瓶培養5 d。

1.4.2 蛋白酶活力測定

根據Chatterjee［18］的方法測定蛋白酶活性。蛋白酶的活性定義：40℃每分鐘水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸為1個活力單位（U）。

1.4.3 蛋白質含量測定

采用Lowry方法［19］測定其蛋白質濃度，以牛血清蛋白作為標準蛋白樣品。

1.4.4 M.fuliginosus BQ2酸性蛋白酶的分離純化

將發酵液過濾，留上清液，然后按照文獻［17］以飽和度80%硫酸銨進行鹽析沉淀。鹽析沉淀后，在15 000 r/min離心30 min，除去細胞上清液，將沉淀溶解到 pH 4.0的檸檬酸鈉緩沖液中，然后在4℃透析脫鹽24 h（透析袋截留分子相對質量為7000），每8 h換一次蒸餾水。

透析液在以0.05 mol檸檬酸鈉為緩沖液平衡的DEAE-Sepharose CL-6B陰離子柱上層析。用0～1 mol/L NaCl緩沖溶液進行階梯式梯度洗脫，以1 mL/min的流速洗脫，280 nm波長處檢測，收集穿過峰和各洗脫峰，測定蛋白酶活性。

1.4.5 SDS-PAGE測定蛋白酶分子量

根據Laemmli方法［20］，測定純化蛋白酶的分子量。

1.4.6 酶學性質分析

1）M.fuliginosus BQ2酸性蛋白酶最適pH和pH穩定性

將蛋白酶分別置于不同pH（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0）的緩沖溶液中。在40℃測定蛋白酶活性，其中以最高酶活力為100%，計算其他pH值條件下的相對酶活力，確定最適pH值。將蛋白酶依次置于上述緩沖液中，在40℃保溫60 min，測定蛋白酶活力。以最高酶活力為100%，計算其他pH值條件下的相對酶活力，確定蛋白酶的pH值穩定性。

2）M.fuliginosus BQ2最適溫度和溫度穩定性

分別在30℃、40℃、50℃、60℃下測定蛋白酶活力。以最高酶活力為100%，計算其他溫度下的相對酶活力，確定酶的最適反應溫度。最適pH值下，分別將蛋白酶置于上述溫度水浴保溫，在相同時間段下，于40℃測定蛋白酶活力，以保溫0 min的酶活力為100%。計算其他條件下的相對酶活力，確定蛋白酶的溫度穩定性。

3）抑制劑對M.fuliginosus BQ2酸性蛋白酶的影響

分別添加4種不同類型的蛋白酶抑制劑（Pepstatin A、E-64、EDTA 和PMSF）到蛋白酶液中，濃度分別為0.1，0.1，5和5 mmol/L。混合液40℃下放置30 min 后，測定其蛋白酶活力，以不添加抑制劑的作為對照，設為100%。

4）金屬離子對M.fuliginosus BQ2酸性蛋白酶的影響

分別添加Cu2+、Mg+、Ca2+、Zn2+、Fe3+金屬離子到蛋白酶液中，濃度為2 mmol/L，混合液40℃下放置30 min，測定其蛋白酶活力，以不添加金屬離子的酶液反應體系為對照組，設為100%。

1.5 數據分析

全部實驗均以一式三份，數據以平均值±標準差（SD）表示。

2 結果與討論

2.1 M.fuliginosusBQ2酸性蛋白酶的分離純化

以蝦殼廢棄物為底物，利用M. fuliginosus BQ2發酵制備的粗酶液，經過飽和度80%的硫酸銨鹽析沉淀，再利用DEAE-Sepharose CL-6B陰離子層析柱分離洗脫，采用Origin 2018軟件繪制圖1，得到了2個蛋白峰。

第一個蛋白峰中蛋白質基本無蛋白酶活性，而第2個蛋白峰的蛋白酶活性高，故收集合并第2個峰的酶液。該酸性蛋白酶純化結果如表1所示。在經過硫酸銨沉淀和DEAE-Sepharose CL-6B 陰離子交換柱純化后，比酶活達到56.53 U/mg，純化倍數為11.42，回收率為8.57%。本研究采用小龍蝦蝦殼為唯一氮源，利用M.fuliginosus BQ2液態發酵產酸性蛋白酶，酶活最高為29.10 U/mL。而Liang［21］以蝦蟹殼粉為氮源，用M.purpureus CCRC31499進行發酵產酸性蛋白酶，酶活性僅為0.22 U/mL。說明采用M.fuliginosus BQ2發酵小龍蝦蝦殼可產酶活相對較高的酸性蛋白酶，其M.fuliginosus BQ2酸性蛋白酶可能在蝦殼蛋白降解中發揮積極作用。

2.2 SDS-PAGE分析

將純化后的蛋白酶樣品進行SDS-PAGE分析，結果如圖2所示。經硫酸銨鹽析沉淀后的樣品中含有2 個條帶，而通過DEAE-Sepharose CL-6B陰離子交換層析后，收集的第2個蛋白峰樣品含有1個條帶，這說明了該酸性蛋白酶的純度較高，該酸性蛋白酶相對分子質量為65 000a。不同紅曲霉菌株所發酵產生的酸性蛋白酶分子量不同［17， 21- 22］。Liang等［21］分離純化M.purpureus CCRC31499產的蛋白酶，其相對分子質量為40 000。袁江蘭等［17］以M.anka CICC 40806發酵米渣，得到了相對分子質量介于44 300～66 400的酸性蛋白酶。本研究中M.fuliginosus BQ2酸性蛋白酶分子量相對較高。

2.3 酶學性質

2.3.1 pH對M.fuliginosus BQ2酸性蛋白酶的影響

M.fuliginosus BQ2酸性蛋白酶的最適pH見圖3a。該酸性蛋白酶的最適反應pH值為4.0，高于M.anka CICC 40806、M.kaoliang產的酸性蛋白酶最適pH（3.0）［17， 23］。而Aspergillus foetidus產的酸性蛋白酶最適pH為5.0［24］。這說明不同種類的菌株產的酸性蛋白酶最適pH不同，可能是結構和性質存在較大差別所致［17］。由圖3b可知，pH值低于3.0或高于5.0時，該酸性蛋白酶活性會迅速下降，穩定的pH值范圍為3.0～6.0，這與M.kaoliang酸性蛋白酶穩定的pH值范圍一致［23］。由圖3b可知，在2.0～3.0的范圍內，pH值對該蛋白酶的活性影響非常顯著，pH值下降會引起蛋白酶活性迅速下降。當pH值為2.0時，蛋白酶基本失活，而當pH值大于6.0，隨著pH值增加蛋白酶活性也會隨之降低。這可能是由于pH值對蛋白酶活性具有較大影響，會導致蛋白酶空間構象改變，甚至引起酶變性失活［17， 25］。

2.3.2 溫度對M.fuliginosus BQ2酸性蛋白酶的影響

溫度對該酸性蛋白酶的影響見圖4。

該酸性蛋白酶的最適溫度為40℃。當溫度在30℃～40℃時蛋白酶活性逐漸上升，但是溫度高于40℃時，蛋白酶活性開始迅速下降，在溫度低于40℃時保持穩定，。溫度對于蛋白酶的反應具有一定的促進作用，但是當溫度過高時，就會導致酶失活［26- 27］。

2.3.3 4種抑制劑對M.fuliginosus BQ2酸性蛋白酶的影響

Pepstatin A為天冬氨酸蛋白酶抑制劑，E-64 為半胱氨酸蛋白酶抑制劑，EDTA為金屬蛋白酶抑制，PMSF為絲氨酸蛋白酶抑制劑。分別研究這4種不同抑制劑對M.fuliginosus BQ2酸性蛋白酶的影響，結果如表 2 所示。添加E-64、EDTA和PMSF這3種抑制劑后，相對酶活力還保持在79.39%～98.27%，對該酸性蛋白酶活性影響較小。而添加Pepstatin A后，酸性蛋白酶活性無法檢出，所以Pepstatin A對該酸性蛋白酶活性具有明顯的抑制作用，說明該酸性蛋白酶活性中心具有天冬氨酸殘基，是一種天冬氨酸蛋白酶。這與M. pilosus 4480酸性蛋白酶結果一致［20］。

2.3.4 金屬離子對M.fuliginosus BQ2酸性蛋白酶的影響

探究了5種不同金屬離子對于該酸性蛋白酶的影響。如圖5所示，添加Cu2+和Ca2+后，相對酶活力為79.13%和70.22%，對于該酸性蛋白酶呈現抑制作用。這說明該酸性蛋白酶活性中心可能不含有Cu2+和Ca2+，所以EDTA對于該酶的影響較小。Mg+、Zn2+和Fe3+對于該酸性蛋白酶的活性具有促進作用，尤其是Fe3+對于該酸性蛋白酶活性促進作用最強，相對酶活力為196.89%。然而，余翔［22］研究發現Fe3+對M.ruber MJ-1酸性蛋白酶有抑制作用，Lakshman等［20］研究發現Cu2+對 M.pilosus酸性蛋白酶有促進作用，這可能是由于不同種類紅曲霉產生的酸性蛋白酶結構存在差異，導致不同金屬離子對酸性蛋白酶的抑制作用不同［22］。金屬離子對M.fuliginosus BQ2酸性蛋白酶的影響效果并不相同，這說明金屬離子對該酶的影響是很復雜的。

3 結論

以M.fuliginosus BQ2為發酵菌株，小龍蝦蝦殼為底物，可產活性較高酸性蛋白酶。

1）經過硫酸銨鹽析沉淀和DEAE-Sepharose CL-6B陰離子層析柱分離純化該酸性蛋白酶，比酶活為56.53 U/mg，純化倍數為11.42，回收率為8.57%，該酸性蛋白酶相對分子質量為65 000。

2）該酸性蛋白酶最適溫度為40℃，最適反應pH值為4.0。Pepstatin A 能強烈抑制該酸性蛋白酶酶活，而 E-64、EDTA 和 PMSF 對其活性影響較小，說明該蛋白酶屬于天冬氨酸蛋白酶。

3）Cu2+和Ca2+能抑制該蛋白酶活性，而Mg+、Zn2+和Fe3+對該酸性蛋白酶的活性具有促進作用。

［ 參 考 文 獻 ］

［1］ 蔡一芥， 馬申嫣， 程佳琦， 等. 克氏原螯蝦殼高值化利用的研究進展 ［J］.食品工業科技，2019，40（10）：334-338.

［2］ GAO C， ZHANG A L， OUYANG P. Characterization of extracellular chitinase from Chitinibacter sp. GC72 and its application in GlcNAc production from crayfish shell enzymatic degradation ［J］. Biochemical Engineering Journal， 2015， 97： 59-64.

［3］ 張建旭， 王璐穎， 鄭曉衛， 等. 紅球菌利用小龍蝦殼粉產幾丁質脫乙酰酶的培養條件優化 ［J］. 中國食品學報， 2021， 21（04）： 216-223.

［4］ CHEN X， YANG H， YAN N. Shell biorefinery： dream or reality ［J］. Chemistry， 2016， 22（38）： 13402-13421.

［5］ ZHANG Q， WANG L， LIU S， et al. Establishment of successive co-fermentation by Bacillus subtilis and Acetobacter pasteurianus for extracting chitin from shrimp shells ［J］. Carbohydrate Polymers， 2021， 258： 117720.

［6］ MAO X， GUO N， SUN J， et al. Comprehensive utilization of shrimp waste based on biotechnological methods： A review ［J］. Journal of Cleaner Production， 2017， 143： 814-823.

［7］ CHENG M J， WU M D， YUAN G F， et al. Secondary metabolites produced by the fungus Monascus pilosus and their anti-inflammatory activity ［J］. Phytochem Lett， 2012， 5（03）： 567-571.

［8］ ZENG H Y， ZHU A R， HE S L， et al. Anti-lipid-oxidation effects and edible safety evaluation of the oil extracted by a supercritical CO2 process from coix seed fermented by Monascus purpureus ［J］. Food Sci Hum Well， 2023， 12（04）： 1119-1127.

［9］ EGEA M B， DANTAS L A， DE SOUSA T L， et al. The potential， strategies， and challenges of Monascus pigment for food application ［J］. Frontiers in Sustainable Food Systems， 2023， 7：1141644

［10］ 李紅勝， 邢宏博， 許贛榮， 等. 紅曲菌固態發酵產消化酶生產工藝優化 ［J］. 廣東農業科學， 2021， 48（11）： 133-142.

［11］" 王偉平，李嬌，謝衛紅.一種利用廢棄小龍蝦頭和蝦殼生產紅曲色素的方法［P］.中國專利：CN106755120B，2017.05.31

［12］ 張歡， 王端好， 陸光瑞， 等. 酸性蛋白酶對發酵黃豆醬品質的影響 ［J］. 中國釀造， 2021， 40（08）： 150-156.

［13］ SILVA T A S E， KNOB A， TREMACOLDI C R， et al. Purification and some properties of an extracellular acid protease from Aspergillus clavatus ［J］. World Journal of Microbiology amp; Biotechnology， 2011， 27（11）： 2491-2497.

［14］ RAO M B，TANKSALE A M， GHATGE M S，et al.Molecular and Biotechnological Aspects of Microbial Proteases［J］.Microbiology and molecular biology reviews，1998，62（03）： 597-635

［15］ LAKSHMAN P， TOYOKAWA Y， TACHIBANA S， et al. Reducing the antigenicity of milk whey protein using acid proteinases from Monascus pilosus ［J］. Process Biochem， 2011， 46（03）： 806-10.

［16］ SAKAGUCHI M Y. Degradation of soybean protein by an acid proteinase from Monascus anka ［J］. Food Science and Technology International， 1998， 4（01）：6-8.

［17］ 袁江蘭， 何首春， 康旭， 等. 安卡紅曲霉酸性蛋白酶分離純化及部分酶學性質分析 ［J］.食品科學， 2018， 39（10）： 118-124.

［18］ CHATTERJEE J， GIRI S， MAITY S， et al. Production and characterization of thermostable alkaline protease of Bacillus subtilis （ATCC 6633） from optimized solid-state fermentation ［J］. Biotechnol Appl Biochem， 2015， 62（05）： 709-718.

［19］ LOWRY O H， ROSEBROUGH N J， FARR A L， et al. Protein measurement with the folin phenol reagent ［J］. Journal of Biological Chemistry， 1951，193（01）： 265-275.

［20］ LAKSHMAN P， TOYOKAWA Y， TOYAMA H， et al. Purification and characterisation of two extracellular acid proteinases from Monascus pilosus ［J］. Food Chemistry， 2010， 121（04）： 1216-1224.

［21］ LIANG T W， LIN J J， YEN Y H， et al. Purification and characterization of a protease extracellularly produced by Monascus purpureus CCRC31499 in a shrimp and crab shell powder medium ［J］. Enzyme and Microbial Technology， 2006， 38（01-02）： 74-80.

［22］ 余翔. 紅曲菌肉品發酵菌株篩選、鑒定及其酸性蛋白酶功能特性研究 ［D］. 南京：南京農業大學， 2015.

［23］ TSAI M S， HSEU T H， SHEN Y S. Purification and characterization of an acid protease from monascus kaoliang ［J］. International Journal of Peptide and Protein Research， 1978，12（05）： 293-302

［24］ SOUZA P M， ALIAKBARIAN B， FERREIRA E X， et al. Kinetic and thermodynamic studies of a novel acid protease from Aspergillus foetidus ［J］. International Journal of Biological Macromolecules， 2015， 81： 17-21.

［25］ SOUZA P M， WERNECK G， ALIAKBARIAN B， et al. Production， purification and characterization of an aspartic protease from Aspergillus foetidus ［J］. Food Chem Toxicol， 2017， 109（02）： 1103-1110.

［26］ ZHENG L， YU X， WEI C， et al. Production and characterization of a novel alkaline protease from a newly isolated Neurospora crassa through solid-state fermentation ［J］. Lwt， 2020， 122： 108990.

［27］ 張培， 申鉉日， 李川， 等. 金鯧魚內臟酸性蛋白酶的分離純化及酶學性質研究 ［J］. 食品工業科技， 2017， 38（02）： 210-214.

Purification and Study Enzymatic Properties of Acid Protease from

Fermentation of Crayfish Shell with Monascus

LI Yingying， LIU Zao， LI Jiao， JIANG Xiao， WU Yingying， WANG Weiping

（School of Biological Engineering and Food， Hubei Univ. of Tech.， Wuhan 430068， China）

Abstract： Crayfish shell waste discharge causes environmental pollution and waste of resources. Monascus can convert and utilize shrimp shell proteins. In this paper， crayfish shells were used as the only nitrogen source， and" Monascus fuliginosus BQ2 liquid fermentation induced the production of extracellular acid protease. The acid protease was purified by ammonium sulfate and DEAE-Sepharose CL 6B anion exchange column. The enzyme activity was 29.10U/mL， purification ratio was 11.42， and molecular weight was 65 KDa. Its enzymatic properties were investigated. The results showed that the optimal pH value for the enzyme activity was 4.0 and the optimal reaction temperature was 40°C. Pepstatin A strongly inhibited the enzyme activity and the enzyme belongs to the aspartic proteases. Cu2+" and Ca2+ inhibited the activity of the protease. Mg+， Zn2+and Fe3+ promoted the activity of the protease.

Keywords： Monascus; Crayfish shell; acid protease; enzymatic properties

［責任編校： 張 眾］

［收稿日期］ 2023-05-06

［基金項目］ 國家自然科學基金（31101349）

［第一作者］ 李瑩瑩（1998-）， 女， 河南信陽人， 湖北工業大學碩士研究生， 研究方向為發酵工程。

［通信作者］ 王偉平（1972-）， 女， 湖北武漢人， 理學博士， 湖北工業大學教授， 研究方向為發酵調控。

［文章編號］ 1003-4684（2024）05-0055-05