CXCL12通過CXCR4/AKT誘導自噬對肺癌細胞遷移的作用

［摘要］ 目的

探究外源性趨化因子配體12（CXCL12）通過激活趨化因子受體4（CXCR4）/蛋白激酶B（AKT）信號通路對肺癌細胞遷移的作用。

方法 用外源性CXCL12處理肺癌細胞，通過Western blot實驗對自噬相關蛋白LC3B以及CXCR4/AKT信號通路蛋白進行檢測，通過劃痕實驗對細胞的遷移進行檢測。

結果 與對照組相比較，加入外源性CXCL12組細胞的遷移能力增強（t=3.949，P＜0.05），自噬相關蛋白LC3B Ⅱ的表達水平顯著增高（t=3.051，P＜0.05），CXCR4的表達和AKT的磷酸化水平也明顯增高（t=2.974、4.307，P＜0.05）。

結論

CXCL12可能通過CXCR4/AKT信號通路誘導自噬進而促進肺癌細胞的遷移。

［關鍵詞］ 趨化因子CXCL12；受體，CXCR4；肺腫瘤；自噬；細胞運動

［中圖分類號］ R734.2

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2024）05-0669-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.172

［網絡出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.r.20241127.0855.002;2024-11-27 16：49：50

CXCL12 induces autophagy and promotes the migration of lung cancer cells via the CXCR4/AKT signaling pathway

ZHANG Yifan， WAN Lixin， LI Hui， SUN Xiao

（Department of Pulmonary Oncology， Nanyang Central Hospital， Nanyang 47300， China）

［Abstract］Objective To investigate the effect of exogenous CXCL12 on the migration of lung cancer cells by activating the CXCR4/AKT signaling pathway.

Methods Lung cancer cells were treated by exogenous CXCL12. Western blot was used to measure the autophagy-related protein microtubule-associated protein light chain 3B Ⅱ （LC3B Ⅱ） and the proteins associated with the CXCR4/AKT signaling pathway， and wound healing assay was used to observe cell migration.

Results Compared with the control group， the group with the addition of exogenous CXCL12 had significant increases in the migration ability of cells （t=3.949，Plt;0.05） and the expression of the autophagy-related protein LC3B Ⅱ （t=3.051，Plt;0.05）， as well as significant increases in the expression of CXCR4 and the phosphorylation level of AKT （t=2.974，4.307，Plt;0.05）.

Conclusion CXCL12 may promote the migration of lung cancer cells by inducing autophagy via the CXCR4/AKT signaling pathway.

［Key words］ chemokine CXCL12; receptors， CXCR4; lung neoplasms; autophagy; cell movement

肺癌是世界上導致病人死亡的主要疾病之一，其進展機制一直是研究的重點，而研究表明趨化因子在肺癌的發生發展中扮演重要角色［1-4］。趨化因子是一類小細胞因子，趨化因子配體12（CXCL12）是趨化因子家族中研究最廣泛的成員［5-6］。研究表明，CXCL12在腫瘤中廣泛高表達，影響腫瘤的進展［7-8］。CXCL12與其特異性受體趨化因子受體4（CXCR4）相互作用后，誘導下游信號通路，促進細胞的遷移和侵襲［2，6，9］。CXCL12可以促進蛋白激酶B（AKT）的磷酸化，而AKT信號通路的激活可以誘導腫瘤細胞的自噬［10-12］。有研究結果表明，自噬可以促進腫瘤的自我更新和發展，但是在不同的腫瘤和環境中，自噬又可以抑制腫瘤的進展［13-16］。而CXCL12是否可以通過CXCR4/AKT誘導自噬影響肺癌細胞的侵襲和遷移尚不明確。本研究旨在探討外源性CXCL12對肺癌細胞遷移的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗細胞A549細胞購自武漢普諾賽生物科技有限公司。CXCR4抗體和兔二抗購自愛必信公司，磷酸化AKT（p-AKT）抗體和β-actin抗體購自CST公司，外源性CXCL12購自Peprotech公司，CXCR4抑制劑AMD3100購自Selleck公司，完全培養基購自普諾賽公司，胎牛血清購自依科賽公司，胰蛋白酶和青霉素-鏈霉素雙抗購自索萊寶公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 A549細胞使用含體積分數0.1胎牛血清和體積分數0.01青霉素-鏈霉素雙抗的混合培養液培養。

1.2.2 藥物作用 使用AMD3100預處理A549細胞1 h，然后再加入0.1 mg/L的外源性CXCL12共同培養24 h。

1.2.3 劃痕實驗 將A549細胞接種于6孔板中，待細胞長滿后用200 μL的槍頭在板中央劃線，然后用PBS洗3遍，將漂浮的細胞洗去，此時作為0 h拍照。用含體積分數0.01胎牛血清的培養液繼續培養，分別在培養24、48 h時拍照，然后計算愈合率。

1.2.4 自噬相關蛋白及CXCR4/AKT信號通路蛋白Western blot檢測 用RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的混合液裂解細胞0.5 h，在4 ℃下以20 000 r/min離心15 min，取蛋白上清。用BCA試劑盒測蛋白濃度后，將所有蛋白樣本稀釋至同一濃度，然后加上樣緩沖液，沸水煮5 min。制備SDS聚丙烯酰胺凝膠，加入蛋白樣本20 μg，電泳分離蛋白，然后使用PVDF膜300 mA濕轉1 h。轉膜后用含50 g/L脫脂牛奶的TBST溶液封閉2 h，以PBST洗3遍后加一抗4 ℃孵育過夜。吸去一抗，以PBST洗3遍，加入二抗常溫孵育2 h，以PBST洗3遍，用ECL 發光液顯影。使用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值，蛋白表達水平以目的蛋白與內參蛋白灰度值的比值表示。

1.3 統計學處理

使用GraphPad Prism 9.0軟件進行統計學分析。計量資料結果以±s表示，兩組比較采用t檢驗，以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結 "果

2.1 CXCL12對A549細胞遷移的影響

劃痕實驗結果顯示，與對照組相比，加入外源性CXCL12組細胞的遷移能力增強，差異有統計學意義（t=3.949，P＜0.05）。見圖1。

2.2 CXCL12對A549細胞自噬的影響

Western blot實驗結果顯示，與對照組相比，加入外源性CXCL12組細胞自噬蛋白LC3B Ⅱ的表達增高，差異具有統計學意義（t=3.051，P＜0.05）。見圖2。

2.3 CXCL12對CXCR4/AKT信號通路的影響

Western blot實驗結果顯示，與對照組相比，加入外源性CXCL12組細胞CXCR4及p-AKT的表達增加，差異有統計學意義（t=2.974、4.307，P＜0.05）。見圖3。

3 討 "論

本實驗使用外源性CXCL12作用于肺癌A549細胞，然后對細胞的遷移能力進行檢測，結果顯示，加入外源性CXCL12可以明顯促進肺癌細胞的遷移。現有的研究發現，CXCL12可以調節骨髓的腫瘤微環境，利于腫瘤轉移［17］。CXCL12可以明顯促進乳腺癌向骨髓和其他部位的轉移，并且CXCL12的表達還與乳腺癌向肝臟和肺部的轉移密切相關［18-20］。此外，CXCL12可以通過激活ERK1/2信號通路維持食管癌干細胞高水平的轉移特征，證明CXCL12是影響食管癌的潛在靶點之一［21-22］。這些研究結果與本研究結果相一致，表明CXCL12可以促進腫瘤的轉移，是影響多種腫瘤轉移的潛在分子。但是有研究結果顯示，CXCL12可顯著減緩胰腺癌在體外的生長，并且使體內腫瘤也明顯變小，此外，CXCL12還導致腫瘤細胞在體外的黏附性和遷移性變差，在體內的轉移性變弱［23］。這說明CXCL12對腫瘤轉移的影響在不同腫瘤中扮演著不同的角色，尚需繼續探究CXCL12在不同腫瘤轉移中的具體作用和機制。目前已經確定CXCL12是影響腫瘤進展的一個重要分子，對CXCL12的繼續研究可以為腫瘤的治療提供新的策略。

目前的研究發現，外源性CXCL12在促進肺癌細胞遷移的同時，可以促進細胞的自噬。而自噬抑制劑氯喹可以抑制CXCL12介導的癌細胞遷移［24］。本實驗結果顯示，CXCL12可以促進自噬標志性蛋白LC3B Ⅱ的表達，提示CXCL12可能是通過誘導肺癌細胞的自噬促進細胞遷移。有研究結果表明，CXCL12可以與CXCR4結合，然后誘導細胞內信號傳導，參與腫瘤的轉移［25-29］。為了探究CXCL12是否是通過CXCR4激活AKT發揮作用，本實驗在肺癌細胞中加入外源性CXCL12，對CXCR4的表達和AKT的磷酸化水平進行檢測，結果顯示，外源性CXCL12可以促進肺癌細胞CXCR4的表達和AKT的磷酸化。有研究結果表明，CXCL12/CXCR4可以通過激活AKT信號通路促進膠質母細胞瘤細胞的遷移［30］，并且CXCR4的抑制劑AMD3100可以抑制CXCR4介導的骨肉瘤轉移［31-32］。但是，目前尚無研究證明在肺癌中CXCL12可通過CXCR4/AKT信號通路誘導自噬促進肺癌的轉移。所以，本研究首次對此進行了探討，結果表明CXCL12可能通過CXCR4/AKT誘導自噬進而發揮促肺癌細胞遷移的作用。

綜上，CXCL12可促進肺癌細胞的遷移和自噬，并且可促進CXCR4的表達和AKT的磷酸化，提示CXCL12可能通過CXCR4/AKT誘導自噬，進而促進肺癌細胞的遷移。本文結果為肺癌的治療提供了新的研究方向。但本研究僅探討了CXCL12誘導肺癌細胞自噬和遷移的相關性，兩者的具體作用還有待進一步研究和探討。

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（本文編輯 劉寧）

［收稿日期］2024-03-30; ［修訂日期］2024-06-26

［基金項目］河南省醫學科技攻關計劃省部共建項目（SBGJ-202102220）

［第一作者］張一帆（1992-），男。

［通信作者］孫曉（1972-），男，主任醫師。E-mail：89581914@qq.com。