人臍帶血間充質(zhì)干細胞治療肝纖維化microRNA表達變化及其功能分析

［摘要］ 目的

探討人臍帶血間充質(zhì)干細胞（hUCB-MSCs）治療肝纖維化microRNA（miRNA）表達的變化及其功能。

方法 從GEO數(shù)據(jù)庫獲取肝星形細胞（LX-2）與hUCB-MSCs共培養(yǎng)后測序的miRNA表達矩陣，篩選出差異表達miRNA（DEMs）；利用miRWalk在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測DEMs的靶基因，并通過Cytoscape對miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)進行可視化；通過GeneMANIA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建DEMs靶基因的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，并對DEMs的靶向基因進行功能和通路富集分析。

結(jié)果 差異表達分析顯示，與hUCB-MSCs共培養(yǎng)的LX-2細胞較單獨培養(yǎng)的LX-2細胞存在13個低表達DEMs和28個高表達DEMs。通過構(gòu)建miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)分析顯示，hsa-miR-221-3p及hsa-miR-146a-5p同時靶向ERBB4，hsa-miR-10a-5p及hsa-miR-155-5p同時靶向RORA。GO分析發(fā)現(xiàn)，這些DEMs靶向基因主要富集的生物過程包括GDP折疊、蛋白磷酸酶調(diào)節(jié)活性、核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性及纖維蛋白原連接等。KEGG分析發(fā)現(xiàn)，這些DEMs靶向基因主要在癌癥miRNA、癌癥蛋白聚糖類、肝癌、Rap1信號通路、胃癌、甲狀腺癌以及膀胱癌方面富集。

結(jié)論 本研究確定了41種DEMs及ERBB4、RORA兩種多miRNA共同靶向基因，它們可能在hUCB-MSC治療肝纖維化的過程中發(fā)揮作用。

［關(guān)鍵詞］ 胎血；間質(zhì)干細胞；肝纖維化；微RNA

［中圖分類號］ R575

［文獻標(biāo)志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2024）05-0658-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.177

［網(wǎng)絡(luò)出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.r.20241128.1039.002;2024-11-28 16：20：37

Changes in the expression of microRNAs and their functions after the treatment of liver fibrosis using human umbilical cord blood me-

senchymal stem cells

XING Yueyi， JING Xue

（Qingdao University Medical College， Qingdao 266003， China）

［Abstract］Objective To investigate the changes in the expression of microRNAs （miRNAs） and their functions after the treatment of liver fibrosis using human umbilical cord blood mesenchymal stem cells （hUCB-MSCs）.

Methods The GEO database was used to obtain the expression matrix of miRNAs sequenced after co-culture of human hepatic stellate cells LX-2 and hUCB-MSCs， and differentially expressed miRNAs （DEMs） were identified. The miRWalk online database was used to predict the target genes of DEMs， and Cytoscape was used to visualize the miRNA-mRNA network. The GeneMANIA database was used to construct a protein-protein interaction network for the target genes of DEMs， and then functional and pathway enrichment analyses were performed for the target genes of DEMs.

Results The differential analysis showed that compared with the LX-2 cells cultured alone， the LX-2 cells co-cultured with hUCB-MSCs had 13 downregulated DEMs and 28 upregulated DEMs. The miRNA-mRNA network analysis showed that both hsa-miR-221-3p and hsa-miR-146a-5p targeted ERBB4， and both hsa-miR-10a-5p and hsa-miR-155-5p targeted RORA. The GO analysis showed that the target genes of the DEMs were mainly enriched in the biological processes such as GDP folding， protein phosphatase regulator activity， nuclear receptor activity， ligand-activated transcription factor activity， and fibrinogen binding， and the KEGG analysis showed that these genes were mainly enriched in the pathways asso-

ciated with cancer miRNAs， cancer proteoglycans， liver cancer， the Rap1 signaling pathway， gastric cancer， thyroid cancer， and bladder cancer.

Conclusion This study identifies 41 DEMs and 2 target genes， ERBB4 and RORA， of multiple miRNAs， which may play a role in the treatment process of liver fibrosis by hUCB-MSCs.

［Key words］ fetal blood; mesenchymal stem cells; hepatic fibrosis; microRNAs

肝纖維化可演變?yōu)楦斡不．?dāng)肝細胞損傷時，肝星狀細胞（HSC）釋放炎癥介質(zhì)，刺激造血干細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，過度產(chǎn)生細胞外基質(zhì)（ECM）導(dǎo)致肝功能受損［1］。間充質(zhì)干細胞（MSCs）在肝病治療中具有潛力［2］，能夠抑制免疫細胞活性［3］，并具有多向分化及擴增能力，為理想的肝病治療候選方法。人臍帶血（hUCB）含有更多MSCs，相比骨髓或外周血，可能是更好的細胞來源［4-5］。目前，hUCB在肝纖維化中的治療潛力尚未明晰。microRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼 RNA，可以調(diào)節(jié)造血干細胞的活化，影響肝纖維化的進展［6-9］。然而，MSCs如何通過調(diào)節(jié)miRNA表達來緩解HSC活化的機制仍不清楚。本研究旨在探究hUCB治療肝纖維化時miRNA的表達變化，以了解hUCB-MSCs治療肝纖維化的潛力。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源及獲取

miRNA表達矩陣（GSE151098）從美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的GEO數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中檢索獲得。該研究將TGFβ1激活的人肝星形細胞（LX-2）與hUCB-MSCs共培養(yǎng)48 h，并通過高通量測序比較其與單獨培養(yǎng)LX-2細胞差異表達的miRNA（DEMs）。

1.2 DEMs分析

使用R軟件（v.4.4.0）DESeq2包篩選DEMs，以Plt;0.05和|log2FC|≥0.5作為臨界標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用ggplot2包繪制火山圖。

1.3 miRNA靶基因的預(yù)測和miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

使用miRWalk在線數(shù)據(jù)庫（http：//zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/index.html）預(yù)測DEMs的靶基因，該在線數(shù)據(jù)庫包括5個不同的數(shù)據(jù)庫（miRanda、miRDB、Targetscan、RNA22和miRWalk）。至少擬合3個數(shù)據(jù)庫的預(yù)測基因被認(rèn)為是DEMs的靶基因。并利用Cytoscape軟件（v 3.9.0）可視化miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將DEMs的靶基因輸入GeneMANIA數(shù)據(jù)庫（http：//genemania.org/）中，構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)。

1.5 功能和通路富集分析

應(yīng)用R軟件（v.4.4.0）中clusterProfiler包進行DEMs靶基因的GO及KEGG富集分析。

2 結(jié) "果

2.1 與hUCB-MSCs共培養(yǎng)的LX-2中DEMs

從GEO數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)集GSE151098中共獲得6個樣本，其中3個樣本為與hUCB-MSCs共培養(yǎng)的LX-2，另外3個為不與hUCB-MSCs共培養(yǎng)的LX-2。差異表達分析顯示，兩組細胞中共有41種miRNA表達存在差異，其中28個miRNA表達上調(diào)，13個miRNA低表達，見圖1。

2.2 DEMs靶基因預(yù)測和miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過miRWalk在線數(shù)據(jù)庫，找到2個高表達miRNA及6個低表達miRNA的靶基因，其表達序列及靶向mRNA見表1。為了進一步鑒定其調(diào)控的重要miRNA/mRNA，應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，hsa-miR-221-3p及hsa-miR-146a-5p同時靶向基因人表皮生長因子4（ERBB4），hsa-miR-10a-5p及hsa-miR-155-5p同時靶向基因視黃酸受體相關(guān)孤兒受體α（RORA）。見圖2。

2.3 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

通過GeneMANIA數(shù)據(jù)庫分別對高表達及低表達miRNA的靶基因進行蛋白質(zhì)互作分析，結(jié)果顯示靶基因蛋白質(zhì)之間存在相互作用關(guān)系（圖3）。

2.4 DEMs的靶基因功能和通路富集分析

GO分析顯示，DEMs的靶基因主要富集的生物過程包括GDP折疊、蛋白磷酸酶調(diào)節(jié)活性、核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性及纖維蛋白原連接等，其中以GDP折疊、蛋白磷酸酶調(diào)節(jié)活性、核受體活性這3種生物過程富集的基因最多（圖4A）。KEGG通路富集分析顯示，DEMs的靶基因主要在癌癥蛋白聚糖類、癌癥miRNA、肝癌、Rap1信號通路、胃癌、甲狀腺癌以及膀胱癌方面富集，其中以癌癥蛋白聚糖類及癌癥miRNA相關(guān)通路富集的基因最多（圖4B）。

3 討 "論

肝纖維化是不可逆的，這種被動過程會導(dǎo)致進行性肝硬化和肝衰竭。然而，肝纖維化的分子和細胞機制仍在探索中。目前，尚無特定的抗纖維化藥物可用于預(yù)防或治愈肝硬化。因此，制定一種安全、有效和臨床上可行的策略來預(yù)防肝纖維化和改善肝功能具有重要意義。

KAKINUMA等［10］研究顯示，臍帶血單個核細

胞具有橫向分化能力，在一定條件下可以誘導(dǎo)分化為肝細胞并表達肝細胞表面標(biāo)志如ALB、CK18、Thy-1、c-kit等。LEE等［11］研究顯示，肝纖維化病人正常功能的肝細胞數(shù)量顯著減少，hUCB單個核細胞可隨血循環(huán)植入肝臟增殖分化為肝細胞，從而改善肝功能。干細胞以MSCs為主，能夠通過遷移和轉(zhuǎn)化替代肝細胞行使功能；通過分泌多種細胞因子促進肝細胞增殖，增強肝細胞的抗凋亡和抗氧化能力，促進肝竇內(nèi)皮細胞增殖，抑制肝巨噬細胞中炎癥因子的分泌，抑制HSC的活化，促進活化細胞的凋亡，并且能夠降解ECM從而延緩肝纖維化的過程［12］。MSCs還能通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，抑制炎癥反應(yīng)，減少肝臟損傷［13］。目前，hUCB治療肝纖維化已經(jīng)在臨床上得到初步應(yīng)用，并取得了一定的效果。但仍需要更多大規(guī)模臨床研究進一步驗證其安全性和有效性。

多種miRNA被認(rèn)為可以促纖維化，能夠通過調(diào)節(jié)纖維化相關(guān)信號通路來激活HSC［14］。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-103、miR-105、miR-125、miR-146、miR-150、miR-181、miR-194、miR-195、miR-199、miR-214、miR-221、miR-222、miR-542等miRNA具有明確的促纖維化潛力，并且在慢性損傷肝臟的HSC激活過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［14］。miR-214（miR-214-3p）表達在HSC激活過程中顯著上調(diào)，并通過抑制

LX-2細胞中Hedgehog信號通路負調(diào)節(jié)因子Sufu

的表達而引起ECM積累。在CCl4誘導(dǎo)肝纖維化

的實驗中，也觀察到miR-214表達顯著上調(diào)。敲低小鼠體內(nèi)miR-214可增加Sufu的表達，減少促纖維化標(biāo)記基因的表達，抑制纖維化［15］。此外，也有多項研究表明，miRNA可以抑制纖維化的進程。其中miR-690可以直接抑制HSC中的纖維化過程，調(diào)節(jié)肝巨噬細胞的炎癥反應(yīng)，并抑制肝細胞中的de novo脂肪合成［16］。miR-96-5p的表達上調(diào)可以通過抑制FN1/ECM受體相互作用途徑減少HSC的活化，從而緩解肝纖維化［17］；MSCs來源的外泌體miR-27b-3p通過下調(diào)YAP/LOXL2通路緩解肝纖維化［18］。HSC也具有某些抗纖維化miRNA，其中miR-16、miR-19b、miR-29、miR-30、miR-101、miR-122、miR-133a、miR-144、miR-146a、miR-150-5p、miR-155、miR-195、miR-200a、miR-214、miR-335、miR-370、miR-454、miR-483等負責(zé)維持正常HSC的靜止表型，活化HSC的細胞凋亡誘導(dǎo)和表型逆轉(zhuǎn)，抑制HSC增殖，抑制ECM相關(guān)基因表達［19］。

本研究采用生物信息學(xué)的方法篩選出hUCB-MSCs治療肝纖維化后的DEMs，其中包括13個低表達miRNA和28個高表達miRNA；通過構(gòu)建miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-221-3p及hsa-miR-146a-5p同時靶向ERBB4，hsa-miR-10a-5p及hsa-miR-155-5p同時靶向RORA。ERBB4是表皮生長因子受體家族成員之一，也被稱為HER4。研究表明，肝纖維化過程中ERBB4的表達可能上調(diào)，尤其是在HSC中。ERBB4受體的激活可能通過與表皮生長因子（EGF）或者類似的配體結(jié)合，啟動下游的信號通路，如PI3K/Akt通路和MAPK通路，從而促進HSC的增殖、遷移和膠原合成［20］。此外，肝纖維化的發(fā)生通常伴隨著慢性炎癥反應(yīng)。ERBB4在炎癥反應(yīng)中也可能發(fā)揮重要作用，它通過調(diào)節(jié)炎癥細胞的功能或調(diào)控免疫反應(yīng)，間接影響纖維化過程。有研究顯示，將小鼠肝臟中ERBB4敲除后，炎癥反應(yīng)和纖維化反應(yīng)減輕［21］。RORA是一種核受體轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體超家族的一員，參與調(diào)節(jié)多個生理過程，包括免疫反應(yīng)和細胞增殖、分化、代謝等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，RORA在肝臟疾病，尤其是肝纖維化的發(fā)生和進展中扮演著重要的角色。研究顯示，日本血吸蟲卵外泌體的miRNA-30可能通過在宿主HSC中靶向RORA4來增強RORA4的轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性，從而促進日本血吸蟲感染后的肝纖維化［22］。本研究GO分析顯示， DEMs靶向基因主要富集的生物過程包括GDP折疊、蛋白磷酸酶調(diào)節(jié)活性、核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性及纖維蛋白原連接等；KEGG分析顯示，這些基因主要在癌癥miRNA、癌癥蛋白聚糖類、肝癌、Rap1信號通路、胃癌、甲狀腺癌以及膀胱癌方面富集。但本研究仍存在一定的局限性：目前關(guān)于hUBC-MSCs治療肝纖維化DEMs表達的研究較少，因此本研究僅采用單一數(shù)據(jù)庫，且樣本量較少。后續(xù)工作中將進一步在細胞水平及動物模型中驗證相關(guān)基因的表達情況和功能作用；通過開展大規(guī)模臨床試驗，探討本文研究結(jié)果的臨床意義，以提高研究的臨床適用性和證據(jù)水平。

綜上所述，本研究確定了41種DEMs及兩種多miRNA共同靶向基因（ERBB4、RORA），這些基因及miRNA可能在hUCB-MSCs治療肝纖維化的過程中發(fā)揮作用。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）

［收稿日期］2024-09-04; ［修訂日期］2024-10-12

［基金項目］2021年山東省醫(yī)學(xué)會臍帶血臨床科研專項資金項目（YXH2021ZX064）

［第一作者］邢月怡（1995-），女，博士研究生。

［通信作者］荊雪（1981-），女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師。E-mail：jingxue@qdu.edu.cn。